CN113150148B - 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法 - Google Patents

一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113150148B
CN113150148B CN202110189506.1A CN202110189506A CN113150148B CN 113150148 B CN113150148 B CN 113150148B CN 202110189506 A CN202110189506 A CN 202110189506A CN 113150148 B CN113150148 B CN 113150148B
Authority
CN
China
Prior art keywords
buffer solution
ser
mab
thr
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110189506.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113150148A (zh
Inventor
白义
刘晓航
孟艳敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Dongfang Baitai Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Dongfang Baitai Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Dongfang Baitai Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Dongfang Baitai Biotechnology Co Ltd
Priority to CN202110189506.1A priority Critical patent/CN113150148B/zh
Publication of CN113150148A publication Critical patent/CN113150148A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113150148B publication Critical patent/CN113150148B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本发明涉及抗体工程技术领域，具体提供了一种抗IL‑17RA单克隆抗体的纯化方法，该方法包括亲和层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析。本发明提供的纯化方法用于纯化的抗IL‑17RA单克隆抗体具有较强的亲和力和良好的生物活性，能够与IL‑17RA抗原特异性结合，是具有巨大潜力的自身免疫性疾病治疗药物，其次，本发明采用三步即可完成对抗IL‑17RA单克隆抗体的纯化，亲和层析用于捕获目的蛋白，阳离子交换层析去除酸性峰，阴离子交换层析去除聚集体，最终获得质量合格的抗IL17‑RA单克隆抗体，该方法易于中试放大生产，没有中间样品的调整步骤，各步工艺衔接顺畅，缩短工艺周期。

Description

一种抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法
技术领域
本发明涉及抗体工程技术领域，特别涉及一种抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法。
背景技术
自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。许多疾病相继被列为自身免疫性疾病，例如银屑病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病等。其中，银屑病(Psoriasis)又称牛皮癣，其特点是皮肤出现大小不等、境界清楚的红斑鳞屑性斑块,上覆大量干燥的银白色鳞屑。银屑病皮肤的组织学特征是表皮角质化细胞过度增殖、血管增生以及树突状细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T细胞浸润，银屑病的发病机制涉及复杂的炎症反应和免疫***。我国患病率约0.47％，据此推算，我国目前约有600多万银屑病患者。银屑病一旦发病，常常罹患终生，反复发作，大多数患者表现为复发与缓解交替出现的过程。类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病，主要病变特点为滑膜炎，以及由此造成的关节软骨和骨质破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。全世界的发病率约为0.5～1.0％，我国发病率在0.3～0.4％，通常女性发病率是男性的3倍。强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)是以骶髂关节和脊柱附着点、中轴骨骼炎症为主要症状，并以椎间盘纤维环及其附近***纤维化和骨化及关节强直为病变特点的慢性炎性疾病，属风湿病范畴，病因不明。多与感染、遗传因素、环境因素(如长期处于冷、潮、湿环境)等相关。
随着生物抗体药物的不断深入研究，发现白细胞介素-17(IL-17)是由辅助性T细胞17(Th17细胞)分泌的特征性细胞因子，其可以促进机体局部产生趋化因子、募集中性粒细胞、促进细胞增殖分化；但是，其还可与受体结合产生瀑布样炎症效应，造成组织损伤，其已被证实与多种自身免疫性疾病的发病过程密切相关。拮抗和阻断IL-17/IL-17R信号通路是具有巨大潜力的自身免疫性疾病治疗靶点，有望有效缓解自身免疫性疾病的症状，阻止疾病的进展。
IL-17受体(IL-17R)家族由5个成员组成，分别为IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE，所有成员都是Ⅰ型单次跨膜糖蛋白，具有保守结构基序，包括一个胞外的类纤维结合素Ⅲ结构域和一个胞内的结构域。人IL-17RA基因位于P22染色体上，人IL-17RA蛋白全长866个氨基酸，同时具有多个二硫键和糖基化位点，两个修饰位点，还含有胞外区，跨膜区和胞内区。
IL-17RA是IL-17A的受体，也是IL-17F的受体，IL-17RA结合IL-17A的亲和力高于IL-17F。IL-17RA的激活会减少CXCL1、CXCL8/IL-8和IL-6等炎症因子的表达。IL-17RA表达广泛，尤其在造血组织中表达水平较高。IL-17RA包含两个独特的结构域，即靠近SEF1R的toll/白细胞介素1受体样环状结构域和C末端结构域，IL-17RA可以引起多种分子的产生和释放，如细胞因子(IL-6，G-CSF，GM-CSF)、趋化因子(CCL2、CCL7、CCL20、CXCL1、CXCL5)、抗微生物肽(β防御素-2、S100A7、S100A8、S100A9)、黏蛋白(黏蛋白5B和黏蛋白5AC)及基质金属蛋白酶(MMP1、MMP3、MMP9、MMP12和MMP13)等，也可与多个IL-17家族成员结合发挥生物学作用。
目前，针对抗IL-17RA单克隆抗体在工艺研发过程中，往往会遇到很多问题，单克隆抗体类产品通常使用剂量高，约为200mg/次，但是皮下注射的给药体积有限，1.0-1.5ml已经是一个极限，这将预示着抗IL-17RA单克隆抗体的浓度将高达100-150mg/ml，这对于工艺的纯化要求更高。brodalumab是首个也是唯一一个选择性靶向IL-17受体A(IL-17RA)的全人源化单克隆抗体，但是brodalumab抗体的纯化工艺复杂，在常规的纯化步骤过程中，每步完成后均需要通过更换或调试缓冲液来适应下一步骤的pH条件，在批量生产过程中，浪费了大量的时间，同时在调试过程中很可能引入杂质，导致中间操作步骤多，回收率低，同时成本增加，为此，急需开发一种能够专门适用于本发明提供的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法。
发明内容
为了能够满足国内市场的需求，本发明利用噬菌体抗体库展示技术和高通量筛选的方法，筛选出亲和力更高，活性更好的抗IL-17RA单克隆抗体，同时本发明根据该单克隆抗体的特性，能够克服现有抗IL-17RA单克隆抗体在纯化工艺过程中存在的上述缺陷的基础上，通过大量的实验最终提供了一种适用于本发明提供的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、亲和层析；
S11、首先，用3-5CV的缓冲液A以100-200cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，将含有抗IL-17RA单克隆抗体的细胞上清液以100-200cm/h的流速进行上样；
S12、其次，上样结束后，使用所述缓冲液A第一次进行再平衡，待紫外信号平稳后，使用缓冲液B进行第二次淋洗，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗；
S13、最后，使用缓冲液C以100-200cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时收集亲和洗脱液，当所述紫外吸收值降至100mAU时结束收集，备用；
S2、阳离子交换层析；
S21、首先，使用3-5CV的缓冲液D以100-200cm/h的流速对阳离子交换层析柱进行平衡，将步骤S1中收集的所述亲和洗脱液以100-200cm/h的流速进行上样；
S22、其次，上样结束后，使用所述缓冲液D进行再平衡，待所述紫外吸收值平稳后，使用缓冲液E以100-200cm/h的流速对所述阳离子交换层析柱进行淋洗，冲洗的体积为5-15CV；
S23、最后，使用缓冲液F以100-200cm/h的流速对所述阳离子交换层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值开始上升时收集阳离子洗脱液，当所述紫外吸收值降至300mAU时结束收集，备用；
S3、阴离子交换层析；
S31、首先，使用7-10CV的缓冲液G以100-200cm/h的流速对阴离子交换层析柱进行平衡，将步骤S2中收集的所述阳离子洗脱液以100-200cm/h的流速进行上样；
S32、上样结束后，再次使用所述缓冲液G进行冲洗，待所述紫外吸收值上升至100mAU时，开始收集流穿液，待所述紫外吸收值降至200mAU时结束收集。
本发明提供了专门针对抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，通过三步层析的方法能够保证蛋白质量的基础上，不仅降低了抗体蛋白中宿主蛋白(HCP)、protein-A、DNA等工艺杂质，同时简化了操作流程，由阳离子交换层析至阴离子交换层析过渡的过程中，无需单独再次调节适宜的pH值，两步衔接顺畅，避免了调节pH值的过程中引入杂质，缩短了纯化周期，提高纯化效率，为后期中试批量生产节省了时间，同时有效去除多聚体、酸碱异构体等多种产品相关的杂质，从而达到显著提高目的蛋白纯度的作用。本发明中，亲和层析用于捕获目的蛋白，阴阳离子交换层析用于精细纯化蛋白，进一步去除产品杂质最终获得质量合格的抗IL-17RA单克隆抗体；该方法与现有方法相比，通过该方法能够在最短时间内得到高收率的活性蛋白质，操作简单，而且成本较低，能够满足中试放大对抗IL-17RA单克隆抗体纯化要求。
进一步的，本发明提供的上述方法的步骤S1中，所述抗IL-17RA单克隆抗体选自以下任意一种：
(mAb-1)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-2)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-3)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-4)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-5)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-6)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；
(mAb-7)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；
(mAb-8)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；
(mAb-9)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；
(mAb-10)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；
(mAb-11)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13。
本发明提供的上述11种抗IL-17RA单克隆抗体具有较强的亲和力和良好的生物活性，能够与IL-17RA抗原特异性结合，阻断IL-17A与IL-17RA的结合，拮抗和阻断IL-17/IL-17R信号通路，是具有巨大潜力的自身免疫性疾病治疗药物，有效缓解自身免疫性疾病的症状，阻止疾病的进展，自身免疫性疾病包括但不局限于下列：银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎或硬皮病等。
进一步的，所述单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种，所述轻链恒定区为人的Cκ；
优选的，所述重链恒定区为人的IgG1。
进一步的，步骤S1中，所述亲和层析柱的介质为MabSelect SuRe、MabSelect SureLX或Eshmuno-A。优选的，本发明在亲和层析柱中选择MabSelect Sure LX作为介质可以捕获细胞上清中的抗体，去除大部分的杂质，缩小样品的体积，MabSelect Sure LX具有基架稳定、使用寿命长、配基脱落少等优点。
进一步的，步骤S1中，所述缓冲液A包括50mM的Tris-HCl、150～160mM的氯化钠，所述缓冲液A的pH为7.2～7.6，所述缓冲液A的电导率为15-20mS/cm；
所述缓冲液B包括50mM的醋酸钠，所述缓冲液B的pH为5.0～6.0，所述缓冲液B的电导率为2-5mS/cm；
所述缓冲液C包括醋酸钠、柠檬酸钠或甘氨酸，所述缓冲液C的pH为3.5～3.7。
进一步的，步骤S1中，所述缓冲液A由50mM的Tris-HCl和150mM的氯化钠组成，且所述缓冲液A的pH为7.4；所述缓冲液B的pH为5.0；所述缓冲液C为50mM的醋酸钠，且所述缓冲液C的pH为3.6。
缓冲液A主要用于减少非特异性结合的杂质，缓冲液A中含有的Tris和氯化钠提供合适的缓冲范围，保证蛋白的稳定性，从而使柱子能够结合目的蛋白，洗脱除去杂蛋白。此外，为了适应抗IL-17RA单克隆抗体的等电点，通过大量实验验证，pH为7.2-7.6缓冲液A能够满足纯化需求，而且在该pH范围内，缓冲液的缓冲能力较强，同时根据pH设定电导率为15-20mS/cm能够提高纯化效率。缓冲液B主要用于淋洗作用，去除宿主细胞，此外，缓冲液B中含有的醋酸钠能够提高目的蛋白的稳定性，为蛋白纯化提供基础。
本发明中亲和层析选择低pH溶液淋洗，电导低，恰适合第二步的阳离子交换层析，避免了现有的亲和层析选择高盐溶液淋洗后必须进行脱盐后才能进入阳离子交换层析的过程，大大缩短了纯化工艺的时间，提高了纯化效率。
进一步的，步骤S2中，所述阳离子交换层析柱的介质为Capto SP、Eshmuno CPX或Sepharose CM，优选的，所述阳离子交换层析柱的介质为Eshmuno CPX。阳离子交换层析选择Eshmuno CPX作为介质可以用于精细纯化抗体蛋白，进一步去除抗体蛋白中的杂质，而且能够分离酸碱异构体，提高主峰的含量，最终获得质量合格的抗IL-17RA单克隆抗体。
阴阳离子交换层析用于精细纯化蛋白，进一步去除产品杂质最终获得质量合格的抗IL-17RA单克隆抗体
进一步的，所述缓冲液D包括20mmol/L的磷酸钠、20mmol/L的柠檬酸钠或20mmol/L的MES缓冲液，所述缓冲液D的pH为6.0，且所述缓冲液D的电导率为2～4mS/cm；
所述缓冲液E包括20mmol/L的磷酸钠和10～20mmol/L的氯化钠，所述缓冲液E的pH为7.2～7.4，且所述缓冲液E的电导率为4～6mS/cm；
所述缓冲液F包括20mmol/L的磷酸钠和70～100mmol/L的氯化钠，所述缓冲液F的pH为7.2～7.4，且所述缓冲液F的电导率为7～15mS/cm；
优选的，所述缓冲液D为20mmol/L的磷酸钠。
本发明通过大量的实验筛选阳离子交换层析过程中所需的缓冲液成分，筛选出的缓冲液D、缓冲液E和缓冲液F能够适应阳离子交换层析中对抗IL-17RA单克隆抗体的精细纯化要求，同时通过制剂成分和pH值的摸索，能够直接进入阴离子交换层析，无需再次调节pH值，大大缩短了纯化时间，同时节省了物料。
进一步的，所述阴离子交换层析柱的介质为POROS XQ、Capto Q或Eshmuno Q；
优选的，所述阴离子交换层析柱的介质为POROS XQ。
进一步的，所述缓冲液G包括20mmol/L的磷酸钠和50～80mmol/L的氯化钠，所述缓冲液G的pH为7.2～7.4，且所述缓冲液G的电导率为6～12mS/cm。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种专门针对本发明提供的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，首先，本发明中用于纯化的抗IL-17RA单克隆抗体具有较强的亲和力和良好的生物活性，能够与IL-17RA抗原特异性结合，阻断IL-17A与IL-17RA的结合，拮抗和阻断IL-17/IL-17R信号通路，是具有巨大潜力的自身免疫性疾病治疗药物，有效缓解自身免疫性疾病的症状，阻止疾病的进展，自身免疫性疾病包括但不局限于下列：银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎或硬皮病等；其次，本发明提供的方法采用亲和层析和阴阳离子交换层析三步即可完成对抗IL-17RA单克隆抗体的纯化，亲和层析用于捕获目的蛋白，阳离子交换层析去除酸性峰，阴离子交换层析去除聚集体，最终获得质量合格的抗IL-17RA单克隆抗体，该方法相对现有技术提供的纯化方法而言，本发明易于中试放大生产，没有中间样品的调整步骤，各步工艺衔接顺畅，缩短工艺周期，将现有的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化时间从3天缩短到10-12小时，大大提高了纯化效率，此外，该方法适合连续流工艺生产，前一步工艺步骤的样品，能直接进入一下步工艺步骤中，无需对产品进行调整，所以本发明可以实现整个工艺在密闭***进行，减少污染的风险，保证了抗体的安全性。
附图说明
图1为本发明实施例1中pScFvDisb-s的质粒图谱；
图2为本发明实施例1中单克隆抗体噬菌体鉴定Elisa实验数据图；
图3为本发明实施例2中单克隆抗体纯化噬菌体梯度稀释Elisa实验数据图；
图4为本发明实施例3中pTSE的质粒图谱；
图5为本发明实施例4中抗IL-17RA全抗体与IL-17RA在分子水平上结合能力比较图；
图6为本发明实施例5中抗IL-17RA全抗体竞争抑制IL-17A与IL-17RA结合能力比较图；
图7为本发明实施例7中抗IL-17RA全抗体与IL-17RA在细胞水平上的结合能力比较图；
图8为本发明实施例8中抗IL-17RA抗体抑制HDF细胞中产生IL-6的生物活性实验比较图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1抗IL-17RA单克隆抗体的筛选
抗体纯化是工艺开发最重要的一步，在本发明提供的抗体纯化方法之前，首先应获得抗IL-17RA单克隆抗体。本发明利用全合成ScFv单链噬菌体抗体库筛选获得全人源的特异性结合IL-17RA的单克隆抗体。目前，全人源抗体是治疗性抗体发展的主要方向，抗体库技术的出现为全人源抗体的制备筛选提供了良好的技术平台。抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必须的杂交瘤过程，甚至不需要经过免疫过程即可获得各种抗体基因及抗体分子片段。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最广泛的抗体库。噬菌体抗体库展示技术是由Smith首先建立的一种将编码外源蛋白或多肽的基因***噬菌体衣壳蛋白基因，使外源蛋白或多肽与噬菌体衣壳蛋白融合表达于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库利用了上述原理将不同特异性的抗体或其功能性片段(Fab、Fv、ScFv)表达在噬菌体表面，再用抗原进行筛选。噬菌体抗体库根据抗体基因的来源分为免疫库和非免疫库，非免疫库又包括天然库、半合成库和全合成库。噬菌体抗体库的筛选模拟了抗体亲和力成熟的过程，通常将抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体抗体库，通过数轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的过程(即淘选)直至筛选到特异性的高亲和力抗体。
具体的，抗IL-17RA单克隆抗体的生物淘选方法如下：
步骤一：噬菌体抗体库的筛选
采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名为pScFvDisb-s，其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建全合成噬菌体抗体库；
以IL-17RA-ECD-His为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μl/管，4℃包被过夜。用PBST-4％milk分别封闭免疫管和噬菌体抗体库(噬菌体投入量约为109-1012)，37℃封闭1h。封闭后的噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，37℃反应1h。PBST-PBS洗去未结合或结合较弱的噬菌体，通过0.1M pH 2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5MpH8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH 7.0左右。
将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至OD值约0.5-0.8的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，然后在150rpm摇床振荡培养1h。取出1％菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG小平皿上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，涂布于2YTAG大平皿，37℃过夜培养。将过夜培养菌转接至2YTAG液体培养基，在37℃，220rpm条件下的振荡培养至对数生长期，加入M13K07辅助噬菌体，在37℃的温度条件下静止感染30min后，150rpm振荡培养1h。在4000rpm下离心15min，弃去上清，菌体用50ml 2YTAKA培养基重悬，28℃，220rpm条件下的振荡培养过夜扩增噬菌体。第二天，PEG6000-NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选。按照此方法共进行三轮噬菌体库富集筛选后备用。
步骤二：单克隆抗体的ELISA鉴定
经过三轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有1ml 2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃，220rpm的条件下培养约5h至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min后，150rpm振荡培养1h。在4000rpm下离心15min，弃去上清，菌体用2YTAKA重悬，在28℃且220rpm的条件下培养过夜。第二天，在4000rpm且4℃温度条件下离心15min，吸取含噬菌体上清液进行单克隆的ELISA鉴定，结果如图2所示，筛选得到亲和力较高的单克隆抗体，分别命名为mAb-1、mAb-2、mAb-3、mAb-4、mAb-5、mAb-6、mAb-7、mAb-8、mAb-9、mAb-10、mAb-11，将上述11株单克隆菌液进行基因测序确定为正确的抗体序列。
经过测序，上述筛选的11株单克隆的抗体序列如下，而且本发明保护的单克隆抗体选自以下任意一种：
(mAb-1)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-2)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-3)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-4)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-5)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-6)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；
(mAb-7)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；
(mAb-8)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；
(mAb-9)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；
(mAb-10)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；
(mAb-11)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13。
具体的，SEQ ID NO:1(mAb-1中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSYSNYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYSKKLKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:2(mAb-2和mAb-11中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAWTRYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:3(mAb-3中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFSRFGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKHLLGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRFLKFDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:4(mAb-4中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAYSNYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKKFIGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:5(mAb-5中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFAFTRYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYADQFIGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:6(mAb-6中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTRYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKQFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:7(mAb-7中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKNLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:8(mAb-8中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYGFASRGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:9(mAb-9中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTWTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKKFLGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:10(mAb-10中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:11(mAb-1～5中轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDSSLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWANMPGTFGQGTKVEIK；
SEQ ID NO:12(mAb-6和mAb-7中轻链可变区的氨基酸序列)：
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQDISISLGWFQQKPGQAPRPLIYGWNTRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYSDPFLTFGGGTKVEIK；
SEQ ID NO:13(mAb-8～mAb-11中轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVHTGLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFEHNPLTFGQGIKVEIK。
进一步的，单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种，轻链恒定区为人的Cκ；
优选的，重链恒定区为人的IgG1。
实施例2、梯度稀释噬菌体Elisa比较抗IL-17RA单克隆抗体的亲和力
3.1单克隆抗体纯化噬菌体的制备：
将实施例1中获得的11株亲和力较高的单克隆抗体(mAb-1、mAb-2、mAb-3、mAb-4、mAb-5、mAb-6、mAb-7、mAb-8、mAb-9、mAb-10、mAb-11)的菌液转接至2YTAG液体培养基，振荡培养至对数生长期后加入M13K07辅助噬菌体感染，离心后菌体用2YTAKA重悬，28℃培养过夜扩增噬菌体，第二天PEG6000-NaCl沉降纯化噬菌体。制备上市产品Brodalumab的核心专利US7833527B2提供的抗IL-17RA单克隆抗体(AMH14/AML14)的纯化噬菌体作为阳性对照。
3.2噬菌体水平上的亲和力比较
用pH 7.2的0.01M PBS缓冲液包被IL-17RA-ECD-His，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜。第二天，使用PBST洗涤Elisa板3次，加入PBST-4％milk(200μl/孔)，在37℃温度下封闭1h。同时将实施例1中筛选得到的11株单克隆纯化噬菌体样品和专利US7833527B2提供的抗IL-17RA单克隆抗体(AMH14/AML14)制备的单克隆纯化噬菌体样品分别使用PBST-4％milk进行5倍梯度稀释，共稀释8个梯度，梯度稀释的噬菌体样品在37℃温度下封闭1h。将Elisa板中的PBST-4％milk弃掉，加入梯度稀释的噬菌体样品(100μl/孔)，37℃静置1h。用PBST洗涤Elisa板5次，再加入PBST-4％milk 1:5000稀释的anti-M13-HRP单克隆抗体(100μl/孔)，37℃放置1h。使用PBST洗涤Elisa板5次，TMB显色试剂盒显色(100μl/孔)，室温显色10min，用2M H2SO4(100μl/孔)终止显色。酶标仪波长450nm和630nm读数。使用软件GraphPad Prism 5Demo分析数据并作图，结果如图3和数据如表1所示。
表1、噬菌体水平上梯度稀释Elisa实验结果
抗体名称 EC50 抗体名称 EC50
Brodalumab 0.02327 mAb-6 0.01238
mAb-1 0.004287 mAb-7 0.01023
mAb-2 0.009335 mAb-8 0.003126
mAb-3 0.004054 mAb-9 0.003962
mAb-4 0.003761 mAb-10 0.004997
mAb-5 0.00844 mAb-11 0.006777
如图3所示，筛选出的11株不同的单克隆抗体均能够与IL-17RA进行结合，而且相对专利US7833527B2提供的抗IL-17RA单克隆抗体，本发明提供的单克隆抗体与IL-17RA结合能力更强，具有更高的亲和力。
实施例3、抗IL-17RA全抗体的制备
将实施例1筛选出来的11株单克隆抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区的载体pTSE(如图4所示)上，重链恒定区为人IgG1恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO:14)，轻链恒定区为κ链恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO:15)，载体pTSE以PTT载体为基础改造获得，制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段，结构如图4所示。
SEQ ID NO:14(人的IgG1的重链恒定区序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
SEQ ID NO:15(κ链的轻链恒定区序列)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
构建的载体测序成功后，使用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒的大量提取，将提取的质粒定量后，和转染试剂按一定的比例混合后，瞬时转染HEK293E细胞进行全抗体表达，培养4天后，收取上清。上清离心过滤后，使用AKTA仪器protein A亲和柱纯化获得全抗体蛋白。纯化获得蛋白通过超滤浓缩后，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白的定量，结果如表2所示。同时表达纯化上市产品Brodalumab的全抗体作为阳性对照。
表2、全抗体蛋白浓度数据表
抗体名称 浓度(mg/ml) 抗体名称 浓度(mg/ml)
Brodalumab 14.64 mAb-6 13.4
mAb-1 14.00 mAb-7 10.55
mAb-2 18.03 mAb-8 17.39
mAb-3 15.75 mAb-9 18.22
mAb-4 12.30 mAb-10 16.15
mAb-5 10.90 mAb-11 16.56
实施例4、抗IL-17RA全抗体与IL-17RA在分子水平上的结合实验
用pH 7.2的0.01M的PBS缓冲液包被IL-17RA-ECD-His，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜。第二天，使用PBST洗涤Elisa板3次，再加入PBST-4％milk(200μl/孔)，在37℃温度下封闭1h。使用PBST-4％milk梯度稀释实施例3中制备的全抗体和阳性对照抗体，所有抗体的起始最高浓度均是10μg/mL，5倍梯度稀释，每个全抗体均做8个梯度。将Elisa板中的PBST-4％milk弃掉，加入梯度稀释的全抗体样品(100μl/孔)，在37℃温度条件下孵育1h。使用PBST洗涤Elisa板5次，再加入用PBST-4％milk 1:5000稀释的山羊抗人的IgG-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。使用PBST洗涤Elisa板5次，TMB显色试剂盒显色(100μl/孔)，室温显色10min，然后用2M H2SO4(50μl/孔)终止显色。酶标仪波长450nm和630nm读数。使用软件GraphPad Prism 5Demo分析数据作图，实验结果如图5和表3所示。
表3、全抗体亲和实验EC50值数据表
Figure BDA0002944812950000121
Figure BDA0002944812950000131
如图5和表3所示，筛选出的11株不同的单克隆抗体的全抗体均能与IL-17RA进行结合，本发明提供的11株不同的单克隆抗体的EC50值均明显低于专利US7833527B2提供的抗IL-17RA单克隆抗体的全抗体，说明本发明提供的单克隆抗体与IL-17RA结合的亲和力较高，具有较好的活性，此外，从图5和表3还可以得出，这11株全抗体中mAb-8的全抗体的EC50值最低，说明其与IL-17RA结合能力最好，亲和力最高，活性最好。
实施例5、全抗体竞争抑制IL-17A与IL-17RA的结合实验
用pH 7.2的0.01M PBS包被IL-17A-Fc(100ng/孔/100μl)，4℃包被过夜。第二天，使用PBST洗涤Elisa板3次，再加入PBST-4％milk，在37℃温度条件下封闭1h。使用PBST-4％milk稀释IL-17RA-ECD-His至浓度2μg/ml；使用PBST-4％milk梯度稀释实施例3中的全抗体和阳性对照抗体，所有抗体的起始最高浓度均是300μg/mL，3倍梯度稀释，每个全抗体均做8个梯度。将Elisa板中的PBST-4％milk弃掉，分别加入IL-17RA-ECD-His(50μl/孔)和梯度稀释的全抗体样品(50μl/孔)，在37℃温度条件下孵育2h。PBST洗涤Elisa板5次，加入PBST-4％milk稀释1:5000的小鼠抗His IgG-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。使用PBST洗涤Elisa板5次，TMB显色试剂盒显色(100μl/孔)，室温显色10min，用2M H2SO4(50μl/孔)终止显色。酶标仪波长450nm和630nm读数。使用软件GraphPad Prism5Demo作图，实验结果如图6和表4所示。
表4、全抗体竞争实验IC50值数据表
抗体名称 IC50(ng/ml) 抗体名称 IC50(ng/ml)
Brodalumab 3443 mAb-6 2905
mAb-1 2355 mAb-7 2166
mAb-2 2452 mAb-8 1576
mAb-3 2083 mAb-9 2322
mAb-4 2021 mAb-10 2802
mAb-5 1911 mAb-11 2666
如图6和表4所示，筛选出的11株不同的单克隆抗体的全抗体均能有效抑制IL-17A与IL-17RA的结合，本发明提供的11株不同的单克隆抗体的IC50值均明显低于阳性对照上市产品Brodalumab的全抗体，说明本发明提供的单克隆抗体对IL-17A与IL-17RA结合的抑制能力较强，此外，从图6和表4还可以得出，这11株全抗体中mAb-8的全抗体的IC50值最低，说明其对IL-17A与IL-17RA结合的抑制能力最强。
实施例6、BIAcore X100测定全抗体的亲和力
采用捕获法测定全抗体的亲和力：将山羊抗人IgG偶联到CM5芯片表面，抗体HBS-EP buffer分别稀释至浓度1μg/ml确保其可以被山羊抗人IgG捕获。将IL-17RA-ECD-His设置一系列的浓度梯度(20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0μg/ml)流经固定相表面，测定实施例3提供的11株全抗体和阳性对照上市产品Brodalumab的全抗体的亲和力，数据如下表。
表5、Biacore测定的全抗体亲和力结果数据表
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
mAb-1 8.077E+05 8.421E-05 1.042E-10
mAb-2 7.887E+05 5.732E-05 7.267E-11
mAb-3 1.126E+06 4.840E-05 4.298E-11
mAb-4 1.023E+05 6.571E-06 6.426E-11
mAb-5 1.022E+06 7.439E-05 7.275E-11
mAb-6 6.358E+04 1.066E-05 1.676E-10
mAb-7 7.517E+04 1.936E-05 2.575E-10
mAb-8 3.213E+05 4.923E-06 1.532E-11
mAb-9 8.160E+04 1.471E-06 1.803E-11
mAb-10 5.205E+05 3.413E-05 6.356E-11
mAb-11 1.001E+05 1.393E-05 1.392E-10
Brodalumab 1.504E+05 4.333E-05 2.882E-10
通过表5数据得出，本发明提供的11株单克隆抗体的全抗体都具有较高的亲和力，且KD(M)值明显低于阳性对照上市产品Brodalumab的全抗体，说明本发明提供的11株单克隆抗体具有较高的生物学活性。
实施例7、全抗体与细胞表面IL-17RA的结合特异性分析
采用现有方法构建过表达IL-17RA的CHO细胞来检测不同的抗IL-17RA抗体与细胞表面IL-17RA的结合情况。
梯度稀释实施例3中的全抗体和对照抗体，所有抗体的初始最高浓度为20μg/ml，5倍梯度稀释，每个全抗体均做8个梯度。离心收集CHO细胞，PBS+1％BSA洗涤3次并重悬细胞，调整细胞密度至2x 106个/mL，每孔加入50μl细胞，同时加入50μl梯度稀释的抗IL-17RA全抗体，室温孵育1小时。3000rpm离心去上清液，用PBS洗涤细胞3遍，加入50μl/孔稀释好的FITC标记的山羊抗人IgG抗体溶液重悬细胞，室温避光孵育1小时。3000rpm离心去上清液，再次使用PBS洗涤3遍，再用100μl PBS重悬，用流式细胞仪检测荧光强度。结果用GraphpadPrism5Demo作图分析，结果如图7和表6所示。
表6、抗IL-17RA全抗体与细胞表面的IL-17RA的结合实验
抗体名称 EC50(ng/ml) 抗体名称 EC50(ng/ml)
Brodalumab 272.9 mAb-6 213.1
mAb-1 176.8 mAb-7 216.1
mAb-2 130.7 mAb-8 48.45
mAb-3 78.14 mAb-9 66.14
mAb-4 106.3 mAb-10 101.4
mAb-5 146.0 mAb-11 189.6
通过上述数据及如图7所示，本发明制备的11株全抗体的EC50值均明显低于阳性对照上市产品Brodalumab的全抗体，说明本发明提供的11株抗体均能结合细胞表达的IL-17RA，而且这11株全抗体中mAb-8的全抗体的EC50值最低，说明其与IL-17RA抗原特异性结合能力最好，亲和力最强，活性最好。
实施例8、抗IL-17RA抗体抑制人皮肤成纤维细胞(HDF)产生IL-6的生物活性实验
使用0.25％胰蛋白酶消化HDF细胞，8000个/孔铺板，在37℃温度条件下过夜培养。使用PBS稀释IL-17A至浓度2μg/ml；使用PBS梯度稀释实施例3中的全抗体和对照抗体，全抗体的起始最高浓度均为200μg/ml，5倍梯度稀释，每个全抗均做8个梯度。每孔加入PBS稀释终浓度1μg/ml的IL-17A和梯度稀释的抗IL-17RA抗体和对照抗体(专利US7833527B2提供的抗IL-17RA单克隆抗体)，在37℃温度条件下过夜培养。取90μl上清液，使用IL-6ELISA检测试剂盒对细胞因子IL-6分泌水平进行定量分析，结果如图8和表7所示。
表7、抗IL-17RA抗体的生物学活性实验
Figure BDA0002944812950000151
Figure BDA0002944812950000161
通过上述表7数据及如图8所示，说明本发明提供的11株全抗体均能通过与IL-17A竞争性的结合IL-17RA，降低IL-6的分泌水平，此外，本发明提供的11株不同的单克隆抗体的IC50值均明显低于阳性对照上市产品Brodalumab全抗体，说明本发明提供的单克隆抗体与IL-17RA的结合能力强于阳性对照抗体与IL-17RA的结合能力，此外，通过上述数据还可以得出，这11株全抗体中mAb-8的全抗体的活性最好，与IL-17A竞争性最强。
实施例9
本发明实施例9将上述实施例1-8获得的亲和力最高的mAb-8抗IL-17RA单克隆抗体进行纯化工艺的制备，具体方法如下：
纯化之前首先进行细胞培养液预处理：将CHO细胞培养产生的mAb-8抗IL-17RA单克隆抗体细胞培养液进行深层过滤，所得细胞上清液在4℃保存，且保存天数为3天以内。然后具体的纯化方法如下：
S1、亲和层析；
S11、首先，用3-5CV的缓冲液A以100-200cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，将含有mAb-8抗IL-17RA单克隆抗体的细胞上清液以100-200cm/h的流速进行上样；
亲和层析柱的介质为MabSelect SuRe、MabSelect Sure LX或Eshmuno-A，本发明实施例9中亲和层析柱的介质为MabSelect Sure LX。
缓冲液A包括50mM的Tris-HCl、160mM的氯化钠，缓冲液A的pH为7.2，缓冲液A的电导率为15mS/cm；
S12、其次，上样结束后，使用缓冲液A第一次进行再平衡，待紫外信号平稳后，使用缓冲液B进行第二次淋洗，直至紫外吸收值的曲线降至平稳(基线或走平)后，停止冲洗；缓冲液B包括50mM的醋酸钠，缓冲液B的pH为5.5，缓冲液B的电导率为4mS/cm；
S13、最后，使用缓冲液C以100-200cm/h的流速对亲和层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时收集亲和洗脱液，当紫外吸收值降至100mAU时结束收集，备用；缓冲液C包括醋酸钠、柠檬酸钠或甘氨酸，缓冲液C的pH为3.5。
S2、阳离子交换层析；
S21、首先，使用3-5CV的缓冲液D以100-200cm/h的流速对阳离子交换层析柱进行平衡，将步骤S1中收集的亲和洗脱液以100-200cm/h的流速进行上样；阳离子交换层析柱的介质包括Capto SP、Eshmuno CPX或Sepharose CM；
本发明实施例9优选的，阳离子交换层析柱的介质为Eshmuno CPX。
缓冲液D为20mmol/L的柠檬酸钠，缓冲液D的pH为6.0，且缓冲液D的电导率为2mS/cm；
S22、其次，上样结束后，使用缓冲液D进行再平衡，待紫外吸收值平稳后，使用缓冲液E以100-200cm/h的流速对阳离子交换层析柱进行淋洗，冲洗的体积为5-15CV；缓冲液E包括20mmol/L的磷酸钠和10mmol/L的氯化钠，缓冲液E的pH为7.2，且缓冲液E的电导率为4mS/cm；
S23、最后，使用缓冲液F以100-200cm/h的流速对阳离子交换层析柱进行洗脱，当紫外吸收值开始上升时收集阳离子洗脱液，当紫外吸收值降至300mAU时结束收集，备用；缓冲液F包括20mmol/L的磷酸钠和70mmol/L的氯化钠，缓冲液F的pH为7.2，且缓冲液F的电导率为7mS/cm；
S3、阴离子交换层析；
S31、首先，使用7-10CV的缓冲液G以100-200cm/h的流速对阴离子交换层析柱进行平衡，将步骤S2中收集的阳离子洗脱液以100-200cm/h的流速进行上样；阴离子交换层析柱的介质为POROS XQ、Capto Q或Eshmuno Q；本发明实施例9优选的，阴离子交换层析柱的介质为POROS XQ。
S32、上样结束后，再次使用缓冲液G进行冲洗，待紫外吸收值上升至100mAU时，开始收集流穿液，待紫外吸收值降至200mAU时结束收集。缓冲液G包括20mmol/L的磷酸钠和50mmol/L的氯化钠，缓冲液G的pH为7.2，且缓冲液G的电导率为6mS/cm。
实施例10
本发明实施例10在实施例9的基础上，进一步限定了缓冲液A由50mM的Tris-HCl和150mM的氯化钠组成，且缓冲液A的pH为7.4，缓冲液A的电导率为18mS/cm；缓冲液B的pH为5.0，缓冲液B的电导率为2mS/cm；缓冲液C为50mM的醋酸钠，且缓冲液C的pH为3.6，其他方法和参数与实施例9全部相同。
实施例11
本发明实施例11在实施例9的基础上，进一步限定了缓冲液A由50mM的Tris-HCl和155mM的氯化钠组成，且缓冲液A的pH为7.6，缓冲液A的电导率为20mS/cm；缓冲液B的pH为6.0，缓冲液B的电导率为5mS/cm；缓冲液C为50mM的醋酸钠，且缓冲液C的pH为3.7，其他方法和参数与实施例9全部相同。
实施例12
本发明实施例12在实施例10的基础上，进一步限定了缓冲液D为20mmol/L的磷酸钠，缓冲液D的pH为6.0，且缓冲液D的电导率为3mS/cm；缓冲液E包括20mmol/L的磷酸钠和15mmol/L的氯化钠，缓冲液E的pH为7.3，且缓冲液E的电导率为5mS/cm；缓冲液F包括20mmol/L的磷酸钠和70mmol/L的氯化钠，缓冲液F的pH为7.3，且缓冲液F的电导率为11mS/cm，其他方法和参数与实施例10全部相同。
实施例13
本发明实施例13在实施例10的基础上，进一步限定了缓冲液D为20mmol/L的MES缓冲液，缓冲液D的pH为6.0，且缓冲液D的电导率为4mS/cm；缓冲液E包括20mmol/L的磷酸钠和20mmol/L的氯化钠，缓冲液E的pH为7.4，且缓冲液E的电导率为6mS/cm；缓冲液F包括20mmol/L的磷酸钠和100mmol/L的氯化钠，缓冲液F的pH为7.4，且缓冲液F的电导率为15mS/cm，其他方法和参数与实施例10全部相同。
实施例14
本发明实施例14在实施例12的基础上，进一步的限定了缓冲液G包括20mmol/L的磷酸钠和65mmol/L的氯化钠，缓冲液G的pH为7.3，且缓冲液G的电导率为9mS/cm，其他方法和参数与实施例12全部相同。
实施例15
本发明实施例15在实施例12的基础上，进一步的限定了缓冲液G包括20mmol/L的磷酸钠和80mmol/L的氯化钠，缓冲液G的pH为7.4，且缓冲液G的电导率为12mS/cm，其他方法和参数与实施例12全部相同。
对照例1
本发明对照例1提供了一种抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，该方法在实施例9的基础上，仅去除了缓冲液B的淋洗，其他方法步骤和步骤参数全部相同。
对照例2
本发明对照例2提供了一种抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，该方法在实施例9的基础上，更换了阳离子交换层析的填料，方法步骤和步骤参数全部相同，具体的，阳离子填料为GE公司的Capto SP。
对照例3
本发明对照例3提供了一种抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，该方法在实施例9的基础上，仅去除了缓冲液E的淋洗，其他方法步骤和步骤参数全部相同。
实验一、抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法纯度分析实验
采用本发明实施例9-15及对照例1-3提供的纯化方法纯化的IL-17RA单克隆抗体，纯化过程中多次进行纯度检测；运用凝胶色谱技术手段，分析蛋白液中聚集体、单体以及降解产物含量，同时，运用离子色谱技术手段，分析酸碱峰的含量，此外，通过专用的试剂盒检测工艺相关杂质的含量，检测结果如下：
表8、抗IL-17RA单克隆抗体的纯化分析表
Figure BDA0002944812950000191
Figure BDA0002944812950000201
通过以上实验结果表明：如表8所示，实施例9与对照例1相比，对照例1中去除缓冲液B的淋洗后，通过数据可知，实施例9和对照例1均通过亲和层析后，对照例1中的宿主蛋白(HCP)、proteinA等工艺杂质含量明显高于实施例9，而且纯度和主峰均较低，所以与对照例1相比，本发明实施例9-11提供的纯化方法在亲和层析步骤中加入高盐和低pH溶液淋洗，能显著降低抗IL-17RA单克隆抗体蛋白产品中宿主蛋白(HCP)、proteinA等工艺杂质的含量，此外，实施例9-11相比，实施例10进一步限定了缓冲液A、缓冲液B和缓冲液C的成分及含量和pH值，能够提高抗IL-17RA单克隆抗体蛋白产品纯度，同时主峰值明显高于实施例9和11，残留HCP含量低于2000ppm，确保最终产品的残留HCP符合质量标准，所以通过数据对比，实施例10经过亲和层析后，宿主蛋白(HCP)、proteinA等工艺杂质也均低于实施例9和11，为此可以说明，本发明实施例10进一步限定的缓冲液A、缓冲液B和缓冲液C能够提高亲和层析的纯化效果。
进一步的，通过实施例10、实施例12和实施例13相比，本发明实施例12进一步限定了缓冲液D、缓冲液E和缓冲液F的成分、含量、pH值和电导率值，通过表8数据得知，实施例12经过阳离子交换层析后，抗IL-17RA单克隆抗体蛋白纯度明显提高，与实施例10和实施例13相比，实施例12对残留HCP和DNA有显著地去除效果，同时去除酸性异构体，所以本发明针对阳离子交换层析的缓冲液优选为：缓冲液D为20mmol/L的磷酸钠，缓冲液D的pH为6.0，且缓冲液D的电导率为3mS/cm；缓冲液E包括20mmol/L的磷酸钠和15mmol/L的氯化钠，缓冲液E的pH为7.3，且缓冲液E的电导率为5mS/cm；缓冲液F包括20mmol/L的磷酸钠和70mmol/L的氯化钠，缓冲液F的pH为7.3，且缓冲液F的电导率为11mS/cm。
再进一步的，如表8数据所示，经过实施例12、14和15数据对比，实施例14在实施例12的基础上进一步限定了阴离子交换层析中缓冲液G的成分、含量和pH值，能够显著提高纯化后的抗体蛋白纯度，纯度最终达到了99.99％，符合纯化要求，明显高于实施例12和实施例15，同时对残留HCP和DNA有显著地去除效果，最后确保纯化后的抗体蛋白产品中残留HCP和DNA符合质量标准。
此外，纯化过程中使用GE公司新一代亲和层析介质MabSelect Sure LX捕获细胞培养液中的目的蛋白，与传统的亲和层析介质相比，MabSelect Sure LX具有稳定性好、使用寿命长，配基脱落少等优点。因此，亲和层析洗脱的过程样品中残留Protein A的含量不仅已经达到质量标准(≤10ppm)，还能提高填料的寿命，降低成本。
实施例9-15与对照例2相比，本发明阳离子交换层析选用Merck的Eshmuno CPX填料，不但能够比较容易的去除杂质HCP和DNA，而且能分离酸碱异构体，提高主峰的含量，而对照例2选择GE公司的Capto SP后，阳离子交换层析后，纯度明显低于实施例9-15，所以本发明优选使用Merck的Eshmuno CPX填料。
实施例9-15与对照例3相比，对照例3中去除缓冲液D的淋洗后，阳离子交换层析后，抗体蛋白纯度明显低于实施例9-15，所以本发明提供的缓冲液D能够提高对抗IL-17RA单克隆抗体的纯化效果。
同时，实施例12和13探索了不同pH值和氯化钠浓度分离酸性峰。实施例12对缓冲液E的限定，不仅能够加大冲洗的体积，同时能有效去除酸性峰又不影响蛋白的回收率，实验中冲洗体积达到8CV。
此外，本发明实施例9-15中阴离子交换层析选用Thermo的POROS XQ填料，有效去除聚集体，样品最终的纯度在99％以上。在实施例14和15中，优化了pH值和氯化钠浓度的参数，阳离子交换层析收集的样品，无需处理后再上阴离子交换层析，可以直接进行阴离子交换层析，大大的节约了纯化时间，阴阳离子交换层析衔接好，提高了纯化效率。
实验二、抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法纯化蛋白活性、回收率分析实验
采用本发明实施例9-15及对照例1-3提供的方法纯化抗IL-17RA单克隆抗体，纯化前统计细胞上清液中抗体蛋白的总量(g)，通过以下公式计算蛋白回收率：
回收率＝纯化后抗体蛋白总量(g)/起始纯化前抗体总量(g)*100％；
同时检测最终得到的蛋白液中抗IL-17RA单克隆抗体的生物学活性。本发明使用ELISA手段，分析纯化后的抗IL-17RA单克隆抗体与IL-17RA的特异性结合能力，以评价结合纯化后的抗体活性。抗IL-17RA单克隆抗体具体测试结果如下。检测结果如下：
表9、抗IL-17RA单克隆抗体的回收率分析表
实施例 回收率(％) 生物学活性(％)
实施例9 72.0 83.2
实施例10 76.9 90.2
实施例11 70.4 85.4
实施例12 81.6 105.2
实施例13 78.1 112.9
实施例14 85.7 101.4
实施例15 80.6 107.4
对照例1 42.3 130.7
对照例2 42.8 68.7
对照例3 38.9 60.7
数据如表9所示，本发明实施例9-15中，实施例14提供的纯化方法得到的抗IL-17RA单克隆抗体蛋白产品的纯化回收率最高，而且生物学活性最好，因此使用本发明实施例14提供的纯化方法能够在保证抗体生物学活性的基础上，提高抗IL-17RA单克隆抗体的纯化回收率，其他任意参数、pH值或电导率的改变，均有可能造成回收率降低。
此外，实施例9-15与对照例1相比，对照例1中去除缓冲液B的淋洗后，抗IL-17RA单克隆抗体的回收率下降明显，且活性较差，为此，本发明提供的缓冲液B是抗IL-17RA单克隆抗体纯化必不可少的。
实施例9-15与对照例2相比，对照例2改变了阳离子交换层析介质，这降导致其纯化回收率和抗体产品的生活学活性降低，为此，本发明优选使用Merck的Eshmuno CPX填料能够有效保证抗IL-17RA单克隆抗体的生物学活性，同时能够提高回收率。
实施例9-15与对照例3相比，对照例3中去除缓冲液E的淋洗后，不仅导致抗IL-17RA单克隆抗体的回收率降低，而且其产品活性降低，主峰含量降低，为此可以证明，本发明提供的缓冲液E是抗IL-17RA单克隆抗体在阳离子交换层析过程中必不可少的缓冲液。
本发明提供的纯化方法易于中试放大生产，没有中间样品的调整步骤，工艺衔接顺畅，可以实现整个工艺在密闭***进行，减少污染的风险。此纯化工艺适合连续流工艺生产，前一步工艺步骤的样品，能直接进入一下步工艺步骤中，无需对产品进行调整，为此，本发明将现有的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化时间从3天缩短到10-12小时，大大的节省了工艺流程，提高了纯化效率。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技股份有限公司
<120> 一种抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ser Lys Lys Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Trp Thr Arg Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys His Leu
50 55 60
Leu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Phe Leu Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Tyr Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Ile Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Gln Phe
50 55 60
Ile Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Gln Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Asn Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe Ala Ser Arg
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Trp Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Leu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Ser Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Asn Met Pro Gly
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile Ser
20 25 30
Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Trp Asn Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Pro Phe Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val His Thr Gly
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Glu His Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 329
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 14
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 15
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (10)

1.一种抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、亲和层析；
S11、首先，用3-5CV的缓冲液A以100-200cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，将含有抗IL-17RA单克隆抗体的细胞上清液以100-200cm/h的流速进行上样；
S12、其次，上样结束后，使用所述缓冲液A第一次进行再平衡，待紫外信号平稳后，使用缓冲液B进行第二次淋洗，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗；
S13、最后，使用缓冲液C以100-200cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时收集亲和洗脱液，当所述紫外吸收值降至100mAU时结束收集，备用；
所述缓冲液A包括50mM的Tris-HCl、150～160mM的氯化钠，所述缓冲液A的pH为7.2～7.6，所述缓冲液A的电导率为15-20mS/cm；所述缓冲液B包括50mM的醋酸钠，所述缓冲液B的pH为5.0～6.0，所述缓冲液B的电导率为2-5mS/cm；所述缓冲液C包括醋酸钠、柠檬酸钠或甘氨酸，所述缓冲液C的pH为3.5～3.7；
S2、阳离子交换层析；
S21、首先，使用3-5CV的缓冲液D以100-200cm/h的流速对阳离子交换层析柱进行平衡，将步骤S1中收集的所述亲和洗脱液以100-200cm/h的流速进行上样；
S22、其次，上样结束后，使用所述缓冲液D进行再平衡，待所述紫外吸收值平稳后，使用缓冲液E以100-200cm/h的流速对所述阳离子交换层析柱进行淋洗，冲洗的体积为5-15CV；
S23、最后，使用缓冲液F以100-200cm/h的流速对所述阳离子交换层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值开始上升时收集阳离子洗脱液，当所述紫外吸收值降至300mAU时结束收集，备用；
所述缓冲液D包括20mmol/L的磷酸钠、20mmol/L的柠檬酸钠或20mmol/L的MES缓冲液，所述缓冲液D的pH为6.0，且所述缓冲液D的电导率为2～4mS/cm；所述缓冲液E包括20mmol/L的磷酸钠和10～20mmol/L的氯化钠，所述缓冲液E的pH为7.2～7.4，且所述缓冲液E的电导率为4～6mS/cm；所述缓冲液F包括20mmol/L的磷酸钠和70～100mmol/L的氯化钠，所述缓冲液F的pH为7.2～7.4，且所述缓冲液F的电导率为7～15mS/cm；
S3、阴离子交换层析；
S31、首先，使用7-10CV的缓冲液G以100-200cm/h的流速对阴离子交换层析柱进行平衡，将步骤S2中收集的所述阳离子洗脱液以100-200cm/h的流速进行上样；
S32、上样结束后，再次使用所述缓冲液G进行冲洗，待所述紫外吸收值上升至100mAU时，开始收集流穿液，待所述紫外吸收值降至200mAU时结束收集；
所述缓冲液G包括20mmol/L的磷酸钠和50～80mmol/L的氯化钠，所述缓冲液G的pH为7.2～7.4，且所述缓冲液G的电导率为6～12mS/cm；
步骤S1中，所述抗IL-17RA单克隆抗体选自以下任意一种：
mAb-1，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:11；
mAb-2，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:11；
mAb-3，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:11；
mAb-4，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:11；
mAb-5，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:11。
2.如权利要求1所述的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种，所述轻链恒定区为人的Cκ。
3.如权利要求2所述的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述重链恒定区为人的IgG1。
4.如权利要求1所述的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述亲和层析柱的介质为MabSelect SuRe、MabSelect Sure LX或Eshmuno-A。
5.如权利要求1所述的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述缓冲液A由50mM的Tris-HCl和150mM的氯化钠组成，且所述缓冲液A的pH为7.4；所述缓冲液B的pH为5.0；所述缓冲液C为50mM的醋酸钠，且所述缓冲液C的pH为3.6。
6.如权利要求1所述的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤S2中，所述阳离子交换层析柱的介质包括Capto SP、Eshmuno CPX或SepHarose DEAE。
7.如权利要求6所述的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换层析柱的介质为Eshmuno CPX。
8.如权利要求1所述的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液D为20mmol/L的磷酸钠。
9.如权利要求1所述的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析柱的介质为POROS XQ、Capto Q或Eshumuno Q。
10.如权利要求9所述的抗IL-17RA单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析柱的介质为POROS XQ。
CN202110189506.1A 2020-06-19 2020-06-19 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法 Active CN113150148B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110189506.1A CN113150148B (zh) 2020-06-19 2020-06-19 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110189506.1A CN113150148B (zh) 2020-06-19 2020-06-19 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法
CN202010562714.7A CN111690065B (zh) 2020-06-19 2020-06-19 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010562714.7A Division CN111690065B (zh) 2020-06-19 2020-06-19 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113150148A CN113150148A (zh) 2021-07-23
CN113150148B true CN113150148B (zh) 2021-10-08

Family

ID=72481880

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110189508.0A Active CN113150149B (zh) 2020-06-19 2020-06-19 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法
CN202010562714.7A Active CN111690065B (zh) 2020-06-19 2020-06-19 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法
CN202110189506.1A Active CN113150148B (zh) 2020-06-19 2020-06-19 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110189508.0A Active CN113150149B (zh) 2020-06-19 2020-06-19 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法
CN202010562714.7A Active CN111690065B (zh) 2020-06-19 2020-06-19 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (3) CN113150149B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023031965A1 (en) * 2021-09-03 2023-03-09 Dr. Reddy’S Laboratories Limited Method to obtain a purified antibody composition

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2013202561A1 (en) * 2006-10-02 2013-05-02 Kirin-Amgen, Inc IL-17 receptor A antigen binding proteins
FR3050535A1 (fr) * 2016-04-25 2017-10-27 Hospices Civils Lyon Anticorps anti il17
CN109679920A (zh) * 2018-12-26 2019-04-26 北京贝来生物科技有限公司 一种表达il-17a信号通路阻断剂的间充质干细胞
CN110272491A (zh) * 2018-03-13 2019-09-24 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种抗pd-1抗体的纯化工艺
CN110551215A (zh) * 2018-05-30 2019-12-10 中山康方生物医药有限公司 抗白细胞介素-17a抗体、其药物组合物及其用途

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101541833B (zh) * 2006-10-02 2014-01-29 麒麟-安姆根有限公司 Il-17受体a抗原结合蛋白质
CN105017418B (zh) * 2014-03-27 2021-02-23 上海药明康德新药开发有限公司 单克隆抗体纯化工艺方法
CN103936854B (zh) * 2014-04-30 2016-08-17 北京精益泰翔技术发展有限公司 抗il-17a单克隆抗体及其制备与应用
CN106146660B (zh) * 2015-04-16 2020-01-14 湖北生物医药产业技术研究院有限公司 分离纯化单克隆抗体的方法
CN107964044B (zh) * 2016-10-19 2021-11-19 无锡科捷诺生物科技有限责任公司 从乳样中纯化抗cd20单克隆抗体的方法
CN107698679B (zh) * 2017-01-22 2019-03-01 北京东方百泰生物科技有限公司 抗pcsk9单克隆抗体
WO2019160907A1 (en) * 2018-02-14 2019-08-22 University Of Virginia Patent Foundation Regulating cd4+ t cells to treat clostridium difficile infection
CN109678969B (zh) * 2018-12-29 2020-02-07 北京东方百泰生物科技有限公司 一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法
CN110840830B (zh) * 2019-10-25 2020-07-24 北京东方百泰生物科技有限公司 一种抗ctla-4单克隆抗体的注射制剂
CN114805577B (zh) * 2019-12-31 2023-11-21 南京融捷康生物科技有限公司 针对il-17ra蛋白的抗体及其制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2013202561A1 (en) * 2006-10-02 2013-05-02 Kirin-Amgen, Inc IL-17 receptor A antigen binding proteins
FR3050535A1 (fr) * 2016-04-25 2017-10-27 Hospices Civils Lyon Anticorps anti il17
CN110272491A (zh) * 2018-03-13 2019-09-24 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种抗pd-1抗体的纯化工艺
CN110551215A (zh) * 2018-05-30 2019-12-10 中山康方生物医药有限公司 抗白细胞介素-17a抗体、其药物组合物及其用途
CN109679920A (zh) * 2018-12-26 2019-04-26 北京贝来生物科技有限公司 一种表达il-17a信号通路阻断剂的间充质干细胞

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Interleukin-17 inhibition: role in psoriasis and inflammatory bowel disease;Megan Hohenberger，等;《J Dermatolog Treat》;20180228;第29卷(第1期);第13-18页 *
抗人白介素-17RA单克隆抗体的制备及活性检测;徐真真，等;《中国医学科学院学报》;20160830(第04期);第428-433页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113150148A (zh) 2021-07-23
CN111690065B (zh) 2021-04-02
CN113150149B (zh) 2021-10-08
CN111690065A (zh) 2020-09-22
CN113150149A (zh) 2021-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101498772B1 (ko) 항체 생성의 최적화 방법
KR101671955B1 (ko) 항 ＴＮＦ-α/ＣＸＣＬ10 이중 타겟 항체 및 그의 용도
CN110964111B (zh) 一种抗pd-l1单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
CN114621345B (zh) 一种抗lag-3的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
CN111840217B (zh) 一种抗il-17ra单克隆抗体的注射制剂
CN113150148B (zh) 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法
CN110655579B (zh) 一种新型抗ctla-4单克隆抗体及其应用
CN112010970B (zh) 一种去除重组表达抗体聚体和降解产物的方法
CN114106171A (zh) 抗aqp4抗体及其应用
CN111848795B (zh) 一种抗il-17ra单克隆抗体及其应用
CN114621344B (zh) 一种抗lag-3单克隆抗体的纯化方法
CN112159473B (zh) 重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的纯化方法
CN114057878A (zh) 降低单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法
CN116217725B (zh) 一种抗tslp单克隆抗体的纯化方法
CN112010972A (zh) 与人lag-3蛋白结合的抗体及其编码基因和应用
CN111234021B (zh) 一种抗ccr5抗体及其在***中的应用
CN113896793A (zh) 一种抗人il-17rc的单克隆抗体及其应用
CN117990807A (zh) 一种抗tslp单克隆抗体电荷异质性的检测方法
CN116178551A (zh) 一种抗nkg2a单克隆抗体的纯化方法
CN117736324A (zh) 一种抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法
CN116203146A (zh) 一种抗lilrb4单克隆抗体电荷异质性的检测方法
CN113817058A (zh) 一种抗人il-17rc的单克隆抗体及其应用
CN116769049A (zh) 一种双功能融合蛋白的纯化方法
CN116284401A (zh) 人源抗il-1r3抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant