CN113151296B - 一种烟草热激蛋白相关的基因及其应用 - Google Patents

一种烟草热激蛋白相关的基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种烟草热激蛋白相关的基因及应用，核苷酸序列如SEQ I D NO.1所示。本发明提供的烟草热激蛋白相关的基因命名为NtDnaJ/HSP40，利用CR I SPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NtDnaJ/HSP40基因获得表达量降低的基因编辑植株，通过荧光定量PCR发现，在正常条件下，在基因编辑植株对照植株中不同组织进行NtDnaJ/HSP40基因表达量分析，结果表明在根、茎、叶三个植物组织中NtDnaJ/HSP40基因表达量在编辑植株中均低于对照植株，其中在叶中表达量降低得最为明显。这为烟草热激蛋白研究及烟草抗逆性研究提供遗传材料和理论依据。

Description

一种烟草热激蛋白相关的基因及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种烟草热激蛋白相关的基因及其应用。
背景技术
生物体遭受胁迫后，体内正常蛋白的合成受到抑制，细胞转向合成一类特殊的蛋白，此类蛋白被命名为热激蛋白(heat shock proteins，HSPs)。除热胁迫以外，其他环境胁迫因子如干旱、低温、重金属离子等也会诱导植物体内HSPs的大量合成。HSPs是一类氨基酸序列与功能极为保守的蛋白质。HSPs热激蛋白具有分子伴侣功能，主要参与生物体内新生肽的运输、折叠、组装、定位以及变性蛋白的复性和降解，在细胞生命活动中起着重要作用。过量表达HSPs热激蛋白可以提高生物对高温胁迫和过氧化伤害的抗性。
烟草作为我国重要的经济作物和模式作物，研究烟草热激蛋白基因响应非生物逆境胁迫的分子机制具有重要意义。在热激蛋白基因克隆与功能研究方面，有研究者发现烟草热激蛋白HSP22与烟草色素类物质含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中色素类物质含量发生了明显降低。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种烟草热激蛋白相关的基因及其应用，为研究烟草抗逆能力与基因功能提供遗传材料和理论依据。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种烟草热激蛋白相关的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括423bp个碱基，该基因来源于烟草(Nicotiana tabacum)并命名为NtDnaJ/HSP40。
优选的，所述烟草热激蛋白相关的基因的编码蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括140个氨基酸。
本发明还提供上述烟草热激蛋白的基因在烟草抗逆方面的应用。将该基因编辑后，烟草在种子萌发苗期对于盐胁迫的抗性降低。通过实时荧光定量PCR发现，在正常条件下，在基因编辑植株对照植株中不同组织进行NtDnaJ/HSP40基因表达量分析，结果表明在根、茎、叶三个植物组织中NtDnaJ/HSP40基因表达量在编辑植株中均低于对照植株，其中在叶中表达量降低得最为明显。这为基因功能的研究将为烟草遗传改良提供遗传材料和理论依据。
本发明的有益效果是：
本发明通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtDnaJ/HSP40基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtDnaJ/HSP40基因发生编辑的烟草植株。本发明通过在种子萌发苗期进行不同程度盐胁迫处理，发现NtDnaJ/HSP40基因编辑植株在盐胁迫处理条件下，生长(地上部分、根长)均明显低于对照(未转化)植株。
本发明提供的烟草热激蛋白相关的基因NtDnaJ/HSP40，通过荧光定量PCR发现，在正常条件下，在基因编辑植株对照植株中不同组织进行NtDnaJ/HSP40基因表达量分析，结果表明在根、茎、叶三个植物组织中NtDnaJ/HSP40基因表达量在编辑植株中均低于对照植株，其中在叶中表达量降低得最为明显。
综上所述，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NtDnaJ/HSP40基因获得在正常条件下表达量降低的基因编辑植株，这为烟草热激蛋白研究及烟草抗逆性研究提供遗传材料和理论依据。
附图说明
图1A和图1B为对照(未转化)植株和基因编辑植株萌发苗期在不同浓度处理条件下(盐胁迫)对比图，其中(图1A)为培养皿分布示意图，(图1B)为盐胁迫对照图；
图2为对照(未转化)植株和基因编辑植株正常条件下不同组织(根、茎、叶)中NtDnaJ/HSP40的相对表达量。
具体实施方式
以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。
在本申请的各实施例中，没有注明具体技术或条件者，按照本领域内现有技术或条件进行，所使用的材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，否则百分号为体积百分数，比例为体积比。
本申请以下各实施例中所使用的烟草品种为红花大金元，一种商品化烟草品种。
实施例1
本实施例主要就烟草热激蛋白相关的基因NtDnaJ/HSP40的获得过程，简要介绍如下。
以栽培种烟草红花大金元叶片为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNA，反转录为cDNA备用：
按照植物RNA提取试剂盒说明书提取烟草总RNA。
1μg从叶片中提取总RNA用于反转录，转录体系如下：
Total RNA 1μg
Oligo(dT)(10μM) 1.5μL
ddH2O up to 15μL
将上述体系混匀后置于PCR中，70℃保温5min，去除后立即置于冰上5min，之后向体系中加入以下试剂：
Figure BDA0002986987220000031
Figure BDA0002986987220000041
上述体系放入PCR仪中，42℃65min，65℃10min，4℃保温，之后置于-20℃冰箱中保存使用。
通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：
F：5’-ATGGATTGTACGTTAAAG-3’，(SEQ ID No.3)
R：5’-TCAACCTAAGCATCTAAC-3’；(SEQ ID No.4)
以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增：
扩增体系(50μL)：
Figure BDA0002986987220000042
混匀离心后进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃10sec，52℃30sec，72℃2.5min，共30个循环；72℃10min；12℃Hold。
对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草热激蛋白相关的基因NtDnaJ/HSP40序列，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，共包括423bp个碱基。对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示，共包括140个氨基酸，进一步对比分析表明，该蛋白含有同源性很高的序列，高度保守。
实施例2
利用实施例1中所获得烟草热激蛋白相关的基因NtDnaJ/HSP40，本发明进一步构建了CRISPR/Cas9载体，以及利用叶盘法转化获得基因编辑植株。
选择NtDnaJ/HSP40基因中较特异的20nt核苷酸序列(CTATGATAAGTCTGTACCAGAGGSEQ ID No.5)为CRISPR/Cas9的引导序列，并将该序列片段与CRISPR/Cas9载体(由西南大学提供)进行连接，获得转化的克隆子，进行PCR扩增检测，后将PCR阳性克隆送测序公司进行测序确认，最后得到CRISPR/Cas9-NtDnaJ/HSP40编辑载体。
利用上一步所构建的CRISPR/Cas9-NtDnaJ/HSP40编辑载体质粒，以红花大金元为例，进行遗传转化试验，以敲除植物体内的烟草热激蛋白相关的基因NtDnaJ/HSP40，相关实验过程简要介绍如下。
将烟草种子点种于培养皿中，待长到4片子叶(15-20d)，便可将其移入培养瓶中(含80mL MS液体培养基)，每瓶2株，于25±1℃、光照强度30-50μmol/(m2〃s)，光照时间为16h/d条件继续培养40d，备用。
取出-80℃保存的LBA4404电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融。待感受态刚刚解冻时，加入含有编辑NtDnaJ/HSP40基因的2μL质粒，轻轻弹混匀，置于冰上。后将混匀的液体转移至预冷的电转杯中，将电转杯置于电转仪中进行转化，转化完成后加入1mL的YEB液体培养基与转化液进行混合，后置于摇床28℃，200rpm培养1.5-2h。8,000rpm离心菌体弃掉上清培养基，然后用200μL的YEB液体培养基悬浮菌体，涂于含50mg/L利福平、50mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上28℃倒置黑暗培养2-3d。
在超净工作台中制作烟草叶盘成边长为1cm的方形叶盘，用MS液体制备含有CRISPR/Cas9-NtDnaJ/HSP40编辑载体的农杆菌菌落成悬浮菌液(OD600＝0.6-0.8)。利用悬浮农杆菌菌液浸泡侵染烟草叶盘10min。之后将叶盘置于含2.0mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA的MS固体培养基上，28℃，黑暗，共培养3d。之后进行继代培养，放置于含2.0mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+250mg/L Cb+50mg/L Kan的MS固体培养基上，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2〃s)，25℃黑暗培养8h/d，培养45-60d，直至分化芽形成，每7-10d更换一次分化培养培养基，更换5-6次；培养至分化芽形成；将已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有500mg/L羧苄青霉素与50mg/L卡那霉素的MS培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高，培养条件与分化培养条件一致，培养8-14d；再生植株生根培养，将分化芽切下，***含有500mg/L羧苄青霉素与50mg/L卡那霉素的MS培养基上进行生根培养，培养条件与分化培养条件一致，培养7-10d，获得经LBA4404农杆菌介导转化NtDnaJ/HSP40基因的再生植株，后进行转化植株叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得NtDnaJ/HSP40基因编辑植株。
实施例3
利用实施例2中分子检测确定为NtDnaJ/HSP40基因敲除植株，进行收种获得基因编辑素材。随后进行种子抗逆胁迫处理，选择NtDnaJ/HSP40基因编辑烟草种子与对照(未转化)种子，选取饱满无明显缺陷的种子进行表面消毒，之后分别点种于MS培养基中进行培养；培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2〃s)，光照时间为16h/d的条件下，水平放置进行培养，并进行观察。
盐胁迫(100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L NaCl)处理培养基和MS培养基的制备。
待烟草种子生长约3-4d，待种子露白时选取同一时期种子(10-20颗)小心移至于步骤(2)中盐胁迫(100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L NaCl)处理培养基和MS培养基上；培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2〃s)，光照时间为16h/d的条件下培养12-25d，垂直放置进行培养，并进行观察。放置MS培养基上露白的原因，以防止由于种子活力不同，发芽时间不一致。垂直放置培养，保证幼苗垂直向下，以便根长测量。
观察记录根长及根的状态、叶片大小及叶色等，初步确定烟草种子在萌发期的抗逆性。
同一培养皿中处理包括(对照)及基因编辑材料种子(结果如图1所示)。
实施例4
为了检测烟草热激蛋白NtDnaJ/HSP40基因在不同胁迫处理下表达情况，利用实时荧光定量PCR方法检测该基因在叶片的表达量。实时荧光定量PCR试剂用的是TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq TMⅡ。具体检测方法如下：
选择现蕾期烟草植株，采取在正常条件下，对NtDnaJ/HSP40基因编辑植株与对照(未转化)植株根系、茎及叶片进行取样；随后标记放置于液氮中保存，以便后续RNA提取及实时荧光定量PCR检测试验。
NtDnaJ/HSP40 qPCR扩增引物如下：
qPCR-Nt NtDnaJ/HSP40-F1：TTTTCAACAGGAGCACAGGC(SEQ ID NO.6)
qPCR-Nt NtDnaJ/HSP40-R1：CACCATTTATTTGCATTGCCCG(SEQ ID NO.7)
内参基因(18S)扩增引物如下：
18S-F：CCTACGCTCTGTATACATTAGC(SEQ ID NO.8)
18S-R：GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC(SEQ ID NO.9)
每个样品进行三次技术重复，反应体系如下：
Figure BDA0002986987220000071
扩增条件：95℃30s；95℃10s，60℃10s，共40个循环。
溶解曲线：95℃10s，60℃60s,95℃-0.29℃/s。
结果表明，烟草热激蛋白相关的基因NtDnaJ/HSP40在正常条件下不同组织(根、茎、叶)中有表达(结果如图2所示)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 云南中烟工业有限责任公司
<120> 一种烟草热激蛋白相关的基因及其应用
<130> WPC210666
<140> 2021103028102
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列(NtDnaJ/HSP40)
<400> 1
atggattgta cgttaaagat atcatcttcc tcagtttgcc ttcccaaatt ttcgccaatt 60
tcgattttca acaggagcac aggcttgttc tttccaagac ccattttcag aaatacccca 120
aacaatgtta tttctcaatc tccctcacca cgggcaatgc aaataaatgg tgtaggtgat 180
gctcacaaac gaataagcag tcttgaatct ctgttttgct atgataagtc tgtaccagag 240
gaaagaattg agaagccaac tggattgtcc ttggccaaga aaagtattgg agataatcct 300
cattgtcccg gatgtgaagc taaaggtgct gtcctttgca ccacctgctc cggtacaggg 360
ctatatgttg attctataat ggaaagtcag gggataattg tcaaagttag atgcttaggt 420
tga 423
<210> 2
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列(NtDnaJ/HSP40)
<400> 2
Met Asp Cys Thr Leu Lys Ile Ser Ser Ser Ser Val Cys Leu Pro Lys
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ile Ser Ile Phe Asn Arg Ser Thr Gly Leu Phe Phe Pro
20 25 30
Arg Pro Ile Phe Arg Asn Thr Pro Asn Asn Val Ile Ser Gln Ser Pro
35 40 45
Ser Pro Arg Ala Met Gln Ile Asn Gly Val Gly Asp Ala His Lys Arg
50 55 60
Ile Ser Ser Leu Glu Ser Leu Phe Cys Tyr Asp Lys Ser Val Pro Glu
65 70 75 80
Glu Arg Ile Glu Lys Pro Thr Gly Leu Ser Leu Ala Lys Lys Ser Ile
85 90 95
Gly Asp Asn Pro His Cys Pro Gly Cys Glu Ala Lys Gly Ala Val Leu
100 105 110
Cys Thr Thr Cys Ser Gly Thr Gly Leu Tyr Val Asp Ser Ile Met Glu
115 120 125
Ser Gln Gly Ile Ile Val Lys Val Arg Cys Leu Gly
130 135 140
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(NtDnaJ/HSP40)
<400> 3
atggattgta cgttaaag 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(NtDnaJ/HSP40)
<400> 4
tcaacctaag catctaac 18
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(NtDnaJ/HSP40)
<400> 5
ctatgataag tctgtaccag agg 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(NtDnaJ/HSP40)
<400> 6
ttttcaacag gagcacaggc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(NtDnaJ/HSP40)
<400> 7
caccatttat ttgcattgcc cg 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(NtDnaJ/HSP40)
<400> 8
cctacgctct gtatacatta gc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(NtDnaJ/HSP40)
<400> 9
gtgttgagtc aaattaagcc gc 22

Claims (2)

1.一种烟草热激蛋白相关的基因NtDnaJ/HSP40，其特征在于，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种烟草热激蛋白相关的基因NtDnaJ/HSP40的应用，其特征在于，基因编辑NtDnaJ/ HSP40获得植株盐胁迫的抗性降低；
基因编辑是通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtDnaJ/HSP40的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtDnaJ/HSP40发生编辑的烟草植株。
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