CN110156601B - 一种从甜叶菊中制备高纯度绿原酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从甜叶菊中制备高纯度绿原酸的方法，属于天然产物化学的技术领域。本发明以甜菊叶为原料，以水为提取媒介，将浸提液经过滤、絮凝后，以聚酰胺树脂或类聚酰胺树脂进行纯化，以水为洗脱剂，洗脱液经浓缩结晶后，可制得绿原酸的质量含量为98％以上的产品。同时，在以树脂对绿原酸进行纯化的过程中，收集得到的其他成分可以用于分离提取其它甜菊多酚和甜菊糖苷。总的来说，本方法实现了以甜菊叶为原料制备高纯度绿原酸，产品中绿原酸质量含量可达到98％以上，工艺操作简单，几乎不使用有机溶剂，环保安全。

Description

一种从甜叶菊中制备高纯度绿原酸的方法

技术领域

本发明涉及一种从甜叶菊中制备高纯度绿原酸的方法，尤其是一种以水媒法从甜叶菊中提取高纯绿原酸的方法，属于天然产物化学的技术领域。

背景技术

绿原酸，又名咖啡鞣酸，属于绿原酸类物质的一种，是由咖啡酸与奎尼酸(1-羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。

绿原酸是一种重要的生物活性物质，在医药、卫生等领域具有很大的应用价值。绿原酸对消化、血液和生殖***有一定的药理作用，具有较广泛的抗菌消炎、利胆、止血作用；绿原酸具较强的抗菌抗病毒作用，可以有效抑制金黄葡萄球菌、溶血性链球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌；绿原酸是一种有效的酚型抗氧化剂，可以有效清除羟基自由基和超氧阴离子，从而保护机体免受氧化作用的损害；另外，绿原酸对心血管也有一定的保护作用，具有明显的降压作用。由于绿原酸的各种功效和生理活性，对绿原酸的提取和纯化也越来越引起人们的关注。

绿原酸在植物中广泛存在，主要来源于金银花、杜仲、咖啡豆、元宝枫叶、牛蒡叶、红薯叶等。甜叶菊为菊科多年生草本植物，含甜菊糖苷为甜叶菊干叶的8％-12％，主要被用作提取天然甜味剂甜菊糖苷。除甜菊糖苷之外，甜叶菊的醇、水或者醇水提取物中还含有甜菊酚、类黄酮、奎尼酸和咖啡酸及衍生物、氨基酸和脂肪酸及其衍生物，以及其它需要除去的单宁、鞣质、色素和果胶等杂质。甜菊中的酚类化合物主要包括简单酚酸类、绿原酸类、黄酮类、黄酮醇类、黄烷醇类、异黄酮类等。对于甜叶菊，国内外的研究主要集中在甜菊糖苷的制备分离上，而对于甜叶菊中多酚、绿原酸的提取分离报道较少。甜叶菊中的多酚或者随提取废渣一同废弃；或者从废渣中提出，纯度低，提取效率差。

目前工业化提取和纯化绿原酸的原料主要来源于金银花、杜仲叶和咖啡豆等。中国专利 CN103288644A介绍了一种从金银花中提取绿原酸的制备方法，将金银花清洗干燥粉碎得到粉末；多次水提后，调节pH，大孔树脂吸附，然后醇洗脱得到粗提物，经萃取分离，浓缩干燥后得到成品绿原酸。中国专利CN1974527A的中国专利介绍了一种从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法，是将干燥后杜仲叶粉碎，用乙醇提取；然后经大孔树脂柱吸附，再过硅胶柱，减压浓缩，用丙酮或水重结晶，得到纯度96％-99％绿原酸精品。专利CN109096110A 介绍了一种从咖啡豆中分离纯化99％绿原酸的工艺，咖啡豆粉碎过筛得到粗粉，乙醇提取，搅拌离心，过滤后，滤液经大孔吸附树脂吸附，解析液经纳滤膜处理，脱色、过滤、减压浓缩后，结晶得到粗品，用稀乙醇重结晶得到99％的绿原酸。专利CN03134575.1A介绍了一种从元宝枫叶中提取绿原酸的工艺方法，从元宝枫叶中提取绿原酸，采用低温提取，控制时间和pH值，料液比等条件下，该工艺的固溶物浸出率高，效果较好，操作简单，得到的绿原酸纯度为40％左右。专利CN1651398A介绍了一种从牛蒡叶中提取绿原酸的生产工艺，新鲜的牛蒡叶经洗净去杂、氯仿脱脂、脱色后，用酸水回流提取，再用乙酸乙酯萃取、减压浓缩后用AB－8树脂柱吸附，经乙醇洗脱、洗脱液浓缩、重结晶而制得绿原酸纯品。专利CN200510094347.8介绍了一种从葵花粕中提取纯化绿原酸的方法，用乙醇水溶液萃取葵花粕，萃取液经浓缩去醇、酸沉分离蛋白后，再用乙酸乙酯萃取、分离浓缩得到纯度70％的绿原酸粗品，最后用D101大孔树脂进一步纯化，得到含量为92％的绿原酸。

综上所述，目前提取绿原酸的原料大多都是一些绿原酸含量相对较高的中草药和资源不丰富的材料。而以甜菊叶作为原料，提取分离得到绿原酸的相关报道较少，专利CN102924544A中采用甜菊叶作为原料，分步制备甜菊糖和绿原酸的方法，冷水浸泡提取甜菊叶，加二价铁盐后调pH值进行絮凝，过滤得滤液和滤饼，滤液用大孔吸附树脂进行吸附、解析、精制处理后得到甜菊糖；滤饼用水溶解后调酸，经大孔吸附树脂吸附、解析、浓缩干燥、醇重结晶后得到绿原酸。专利CN105001281A介绍了一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的生产方法，甜菊叶经水提、絮凝后，过滤得到滤泥和滤液，滤液经树脂纯化得甜菊糖苷产品；滤泥经醇水溶液溶解后经大孔吸附树脂吸附，然后梯度解析，低浓度醇解析液制备得绿原酸，高浓度醇解析液浓缩经有机溶剂萃取，得到黄酮。该方法实现了甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的同时提取，提高了甜叶菊的综合利用价值，但是得到的绿原酸纯度不高。

可见，目前提取绿原酸的工艺比较成熟，但是也存在一些问题。首先是原料来源问题，绿原酸原料来源较为单一，大多是一些中草药和资源不丰富的材料，集中在金银花、咖啡豆、杜仲叶上。其次是工艺提取步骤太多，所用到的有机试剂较多，增加了成本，另外也存在安全隐患。更重要的是，现有公开的从甜菊叶中提取甜菊多酚的技术中，大都获得的是甜菊多酚混合物，而且是从甜菊叶经水提、絮凝后过滤得到的滤渣中提取，提取效率和产品纯度都低。此外，现有技术中，在其它植提过程中用到的聚酰胺树脂多为30-60目(即0.25-0.5mm) 的粒子，不利于规模化提取。

发明内容

[技术问题]

解决绿原酸的提取来源单一、制备过程复杂、使用大量有机溶剂、产量低的问题。

[技术方案]

本发明以甜菊叶为原料，以水为提取媒介，制备得到高纯度的绿原酸。本发明提供的技术方案包括以下步骤：

(1)甜菊叶的浸提和絮凝：加水浸泡甜菊干叶片，逆流浸提，过滤并收集滤液即得到甜叶菊提取液，调节所得甜叶菊提取液的pH至酸性，然后边搅拌边向上述甜菊叶提取液中加入壳聚糖静置絮凝，收集经絮凝后的上清液；

(2)色谱纯化：将上述絮凝上清液经板框压滤，所得滤液用聚酰胺树脂吸附，流出液留作它用；然后，先用酸化水洗脱聚酰胺树脂，收集水洗液用于提取绿原酸；再用体积分数80％以上的甲醇或乙醇溶液洗脱聚酰胺树脂，收集醇解析液，将醇解析液浓缩喷雾干燥后留作它用；

(3)重结晶：将步骤(2)所得水洗液用聚酰胺树脂进行吸附，再用酸化水洗脱聚酰胺树脂，收集水洗液，即得到经富集后的水洗液，浓缩后，调节pH和温度，边搅拌边结晶，抽滤得到滤饼；再用水为重结晶溶剂，调节pH，重结晶至绿原酸的质量含量为98％以上。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，对甜菊叶浸提时，甜菊干叶片与水的料液质量比为1：(3-12)，浸提水温为20℃-60℃；调节甜叶菊提取液的pH为3.5-5.0。优选地，浸提水温为35℃-60℃；调节甜叶菊提取液的pH为3.5-4.0。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，所用壳聚糖的脱乙酰度为80％-90％，添加壳聚糖的质量为甜菊干叶片投料质量的0.1％-0.2％，静置絮凝的时间为20min-1h。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)和步骤(3)富集所用的聚酰胺树脂为聚酰胺树脂或类聚酰胺树脂；包括聚酰胺6(PA6)、LX-16、LX-8、聚酰胺66(PA66)或聚己二酰间苯二甲胺(MXD6)中的一种。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)和步骤(3)中的酸化水是用稀酸调节pH至3.5-5.0得到的酸性水溶液，所用酸化水的量为3-5倍柱体积。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，调节pH为3.5-5.0、调节结晶温度为0℃ -25℃，结晶溶剂为水。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，重结晶溶剂为水，调节pH为3.5-5.0、结晶温度为0℃-25℃，重结晶次数为1-2次，搅拌速度为10-30rpm。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中的流出液和醇解析液含有其它多酚和甜菊糖苷等，通过进一步的分离提取可得到其它甜菊多酚和甜菊糖苷。

[有益效果]

本发明提供的方法操作简单，得到的绿原酸纯度最高达99％；绿原酸的制备全程水媒，绿色环保。

本发明提供的方法拓展了甜叶菊的利用领域，在制备高纯度的绿原酸的同时，不影响提取甜菊糖苷和甜菊多酚，实现了甜叶菊的综合利用。

附图说明

图1实施例1所得绿原酸的HPLC图(绿原酸含量99.1％)

图2实施例1中对照例1所得绿原酸的HPLC图(绿原酸含量92.49％)

图3实施例2所得中间产品绿原酸的HPLC图(绿原酸含量63.2％)

图4实施例2所得绿原酸的HPLC图(绿原酸含量98.5％)

图5实施例3所得绿原酸的HPLC图(绿原酸含量99％)

图6实施例3中对照例2所得绿原酸的HPLC图(绿原酸含量80.68％)

图7实施例4所得绿原酸的HPLC图(绿原酸含量98.0％)

图8对照例3用大孔树脂XDA-8制备的绿原酸的HPLC图(绿原酸含量60.44％)

具体实施方式

绿原酸的含量检测方法(HPLC)：绿原酸的含量测定参照中国医药保健品进出口商会团体标准T/CCCMHPIE 1.16-2016，做适当修改。以绿原酸作为标准品。色谱条件：紫外检测器检测波长：330nm。色谱柱：C18(2)，

4.6×250mm；柱温：25℃。流动相：乙腈-水-甲酸梯度洗脱，流速为1.0mL/min。进样量为10μL。流动相A：乙腈-水-甲酸(250:750:1， mL/mL)，流动相B：乙腈-水-甲酸(100:900:1，mL/mL)，梯度运行条件如下表1：

表1

时间/min	流动相A％	流动相A％
			0-20	0	100
20-35	100	0
			35-37	100→0	0→100
37-45	0	100

除特别说明外，所用壳聚糖的脱乙酰度为80％-90％。所用聚酰胺和类聚酰胺树脂中，聚酰胺6(PA6)，牌号1013B，密度为1.14g/cm³，颗粒直径约为1-3mm，日本宇部兴产株式会社出品；聚酰胺66(PA66)，牌号EPR27，密度为1.14g/cm³，颗粒直径约为1-3mm，平顶山神马工程塑料有限公司出品；LX-16和LX-8，所选颗粒直径约为0.8-1.25mm，西安蓝晓科技新材料股份有限公司出品；聚己二酰间苯二甲胺(MXD6)，牌号S6002，密度为1.22g/cm³，颗粒直径为1-2.2mm，日本三菱瓦斯化学株式会社出品。

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：

将1kg甜叶菊干叶片置于储罐中，用3×4L的水在35℃下提取，所得甜叶菊提取液用 0.1mol/L盐酸调节pH至3.5。边搅拌边向提取液加入120mL的1wt％壳聚糖溶液，静置50min 絮凝除杂。絮凝除杂后的上清液用板框过滤，过滤后的清液通过PA6树脂吸附后，流出液留作它用；再用3倍柱体积水洗脱树脂，收集水洗脱液用作提取绿原酸。然后，用体积浓度为80％的甲醇水溶液解析PA6树脂，收集醇解析液，醇解析液进一步浓缩干燥后留作它用。利用PA6树脂吸附富集水洗脱液中的绿原酸，然后，再用3倍柱体积水洗脱树脂，收集并浓缩水洗液，并用0.1mol/L盐酸调节流出液pH至3.5，20℃、10rpm下结晶12h，抽滤得到滤饼；再用水为重结晶溶剂，再次在20℃、pH 3.5、10rpm下结晶18h。抽滤、烘干滤渣得到含量为 99.1％的绿原酸(HPLC图谱见图1)。

对照例1：在pH 7.0下提取，其余条件同实施例1。

将1kg甜叶菊干叶片置于储罐中，用3×4L的水在35℃下提取，所得甜叶菊提取液用 0.05mol/L碳酸氢钠调节pH至7.0。边搅拌边向提取液加入120mL的1wt％壳聚糖溶液，静置50min絮凝除杂。絮凝除杂后的上清液用板框过滤，过滤后的清液通过PA6树脂吸附后，流出液留作它用；再用3倍柱体积水洗脱树脂，收集水洗脱液用作提取绿原酸。然后，用体积浓度为80％的甲醇水溶液解析PA6树脂，收集醇解析液，醇解析液进一步浓缩干燥后留作它用。利用PA6树脂吸附富集水洗脱液中的绿原酸，然后，再用3倍柱体积水洗脱树脂，收集并浓缩水洗液，并用0.05mol/L碳酸氢钠调节流出液pH至7.0，20℃、10rpm下结晶12h；再次在20℃、pH 7.0、10rpm下结晶18h。抽滤、烘干滤渣得到含量为92.49％的绿原酸(HPLC 图谱见图2)。对比图1、图2可以看出，调整pH至中性后，所得的绿原酸的纯度下降至 92.4％。

实施例2：

将1kg甜叶菊干叶片置于储罐中，用3×2.5L的水在60℃下提取，所得甜叶菊提取液用 0.1mol/L醋酸调节pH至4.5。搅拌下向提取液加入100mL的1％壳聚糖溶液，静置20min絮凝除杂。去絮凝除杂后的上清液用板框过滤，过滤后的清液通过PA66树脂吸附后，流出液留作它用；再用4倍柱体积水洗脱树脂，水洗脱液用作提取绿原酸。然后，用80％乙醇解析PA66树脂，醇解析液进一步浓缩干燥后留作它用。利用PA66树脂吸附富集水洗脱液中的绿原酸，然后，再用4倍柱体积水洗脱树脂，收集得到的绿原酸含量为63.2％(HPLC图谱见图3)；浓缩后，用0.1mol/L盐酸调节其pH至4.5，然后在0℃、10rpm下结晶12h；再次在0℃、pH4.5、10rpm下结晶12h。抽滤、烘干滤渣得到含量为98.5％的绿原酸(HPLC图谱见图4)。

实施例3：

将1kg甜叶菊干叶片置于储罐中，用3×3L的水在50℃下提取，所得甜叶菊提取液用 0.1mol/L盐酸调节pH至4.0。搅拌下向提取液加入120mL的1％壳聚糖溶液，静置50min絮凝除杂。去絮凝除杂后的上清液用板框过滤，过滤后的清液通过LX-16树脂吸附后，流出液留作它用；再用5倍柱体积水洗脱树脂，洗脱液用作提取绿原酸。然后用85％甲醇解析LX-16树脂，醇解析液进一步浓缩干燥后留作它用。利用LX-16树脂吸附富集水洗脱液中的绿原酸，然后，再用5倍柱体积水洗脱树脂，收集并浓缩水洗液，并用0.1mol/L盐酸调节流出液pH至 4.0，20℃、10rpm下结晶12h；再次在20℃、pH 4.0、10rpm下结晶16h。抽滤、烘干滤渣得到含量为99.0％的绿原酸(HPLC图谱见图5)。

对照例2：降低壳聚糖的脱乙酰度，其余条件同实施例3。

将1kg甜叶菊干叶片置于储罐中，用3×3L的水在50℃下提取，所得甜叶菊提取液用 0.1mol/L盐酸调节pH至4.0。搅拌下向提取液加入120mL的1％壳聚糖(脱乙酰度为70％)溶液，静置50min絮凝除杂。去絮凝除杂后的上清液用板框过滤，过滤后的清液通过LX-16树脂吸附后，流出液留作它用；再用5倍柱体积水洗脱树脂，洗脱液用作提取绿原酸。然后用85％甲醇解析LX-16树脂，醇解析液进一步浓缩干燥后留作它用。利用LX-16树脂吸附富集水洗脱液中的绿原酸，然后，再用5倍柱体积水洗脱树脂，收集并浓缩水洗液，并用 0.1mol/L盐酸调节流出液pH至4.0，20℃、10rpm下结晶12h；再次在20℃、pH 4.0、10rpm 下结晶16h。抽滤、烘干滤渣得到含量为80.68％的绿原酸(HPLC图谱见图6)。

实施例4：

将1kg甜叶菊干叶片置于储罐中，用3×2L的水在60℃下提取，所得甜叶菊提取液用 0.1mol/L盐酸调节pH至4.0。搅拌下向提取液加入100mL的1％壳聚糖溶液，静置40min絮凝除杂。去絮凝除杂后的上清液用板框过滤，过滤后的清液通过LX-8树脂吸附后，流出液留作它用；再用水洗脱树脂，洗脱液用作提取绿原酸。然后用90％乙醇解析LX-8树脂，醇解析液进一步浓缩干燥后留作它用。水洗脱液经LX-8树脂富集绿原酸，浓缩经树脂富集后的流出液，并用0.1mol/L盐酸调节流出液pH至4.0，10℃、30rpm下结晶12h；再次在10℃、 pH4.0、30rpm下结晶16h。抽滤、烘干滤渣得到含量为98.0％的绿原酸(HPLC图谱见图7)。

对照例3：

将1kg甜叶菊干叶片置于储罐中，用3×3L的水在50℃下提取，所得甜叶菊提取液用 0.1mol/L盐酸调节pH至3.5。搅拌下向提取液加入100mL的1％壳聚糖溶液，静置30min絮凝除杂。去絮凝除杂后的上清液用板框过滤，过滤后的清液通过XDA-8树脂吸附后，流出液留作它用；再用水洗脱树脂，洗脱液用作提取绿原酸。然后用85％甲醇解析XDA-8树脂，醇解析液进一步浓缩干燥后留作它用。水洗脱液经XDA-8树脂富集绿原酸，浓缩经树脂富集后的流出液，并用0.1mol/L盐酸调节流出液pH至3.5，5℃、10rpm下结晶12h；再次在5℃、 pH3.5、10rpm下结晶12h。抽滤、烘干滤渣得到含量为60.44％的绿原酸(HPLC图谱见图 8)。

实施例5：

将1kg甜叶菊干叶片置于储罐中，用3×3L的水在40℃下提取，所得甜叶菊提取液用 0.1mol/L盐酸调节pH至4.0。搅拌下向提取液加入120mL的1％壳聚糖溶液，静置50min絮凝除杂。去絮凝除杂后的上清液用板框过滤，过滤后的清液通过MXD6树脂吸附后，流出液留作它用；再用3倍柱体积的水洗脱树脂，洗脱液用作提取绿原酸。然后用85％甲醇解析 MXD6树脂，醇解析液进一步浓缩干燥后留作它用。利用MXD6树脂吸附富集水洗脱液中的绿原酸，然后，再用3倍柱体积水洗脱树脂，收集并浓缩流出的水洗脱液，并用0.1mol/L盐酸调节流出液pH至4.0，20℃、10rpm下结晶12h；再次在20℃、pH 4.0、10rpm下结晶16h。抽滤、烘干滤渣得到含量为98.9％的绿原酸。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人权利要求书所界定的为准，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种从甜叶菊中制备绿原酸的方法，其特征在于，以水为提取媒介，包括以下步骤：

(1)甜菊叶的浸提和絮凝：加水浸泡甜菊干叶片，逆流浸提，过滤并收集滤液即得到甜叶菊提取液，调节所得甜叶菊提取液的pH至3.5-5.0，然后边搅拌边向上述甜菊叶提取液中加入脱乙酰度为80％-90％的壳聚糖静置絮凝，收集经絮凝后的上清液；

(2)色谱纯化：将上述絮凝上清液经板框压滤，所得滤液用聚酰胺树脂吸附，流出液留作它用；然后，先用酸化水洗脱聚酰胺树脂，收集水洗液用于提取绿原酸；再用体积分数80％以上的甲醇或乙醇溶液洗脱聚酰胺树脂，收集醇解析液，将醇解析液浓缩喷雾干燥后留作它用；

(3)重结晶：将步骤(2)所得水洗液用聚酰胺树脂进行吸附，再用酸化水洗脱聚酰胺树脂，收集水洗液，即得到经富集后的水洗液，浓缩后，调节pH至3.5-5.0，并调节温度0℃-25℃，边搅拌边结晶，抽滤得到滤饼；再用水为重结晶溶剂，调节pH至3.5-5.0，重结晶至绿原酸的质量含量为98％以上；

所述步骤(2)和步骤(3)富集所用的聚酰胺树脂为聚酰胺6、LX-16、LX-8、聚酰胺66或聚己二酰间苯二甲胺中的一种。

2.根据权利要求1所述的一种从甜叶菊中制备绿原酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对甜菊叶浸提时，甜菊干叶片与水的料液质量比为1：(3-12)，浸提水温为20℃-60℃；调节甜叶菊提取液的pH为3.5-5.0。

3.根据权利要求1或2所述的一种从甜叶菊中制备绿原酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所用壳聚糖的脱乙酰度为80％-90％，添加壳聚糖的质量为甜菊干叶片投料质量的0.1％-0.2％，静置絮凝的时间为20min-1h。

4.根据权利要求1所述的一种从甜叶菊中制备绿原酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中的酸化水是用稀酸调节pH至3.5-5.0得到的酸性水溶液，所用酸化水的量为3-5倍柱体积。

5.根据权利要求1所述的一种从甜叶菊中制备绿原酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，调节pH为3.5-5.0、调节结晶温度为0℃-25℃，结晶溶剂为水。

6.根据权利要求1所述的一种从甜叶菊中制备绿原酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，重结晶溶剂为水，调节pH为3.5-5.0、结晶温度为0℃-25℃，重结晶次数为1-2次，搅拌速度为10-30rpm。

7.根据权利要求1所述的一种从甜叶菊中制备绿原酸的方法，其特征在于，步骤(2)中的流出液和醇解析液含有其它多酚和甜菊糖苷，通过进一步的分离提取可得到其它甜菊多酚和甜菊糖苷。

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