CN110075229B - 一种芦笋提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种芦笋提取物，具体涉及一种芦笋提取物及其制备方法与应用。所述芦笋提取物包括以下重量份的组分：50‑70份皂苷，6‑15份多酚，2‑5份黄酮，1‑2份γ‑氨基丁酸。该发明具有提取效率高、有效活性成分含量高的优点，在改善大气污染物丙烯醛引起的动脉粥样硬化、血脂代谢紊乱、肠道菌群紊乱或主动脉平滑肌细胞凋亡方面效果较好。

Description

一种芦笋提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种芦笋提取物，具体涉及一种芦笋提取物及其制备方法与应用。
背景技术
丙烯醛(CH2＝CH-CHO，acrolein)，环境污染物之一，一种活泼的α,β不饱和醛，是来源于人类生活环境的心血管有毒物质，暴露于人类相关的毒性丙烯醛主要分为食物源性、环境源性和内源性。在厨房烹饪、烧、烤煎、炸也能够产生丙烯醛，目前估计，丙烯醛每日耐受量为7.5μg/kg。环境中的丙烯醛是燃烧的副产物之一，石油燃料、生物柴油、塑料、纸质、木头等的燃烧会释放大量丙烯醛，此外，丙烯醛也是卷烟烟雾中的高毒性有机物。每根香烟能产生约10-500μg丙烯醛，是卷烟烟雾中多种有害成分之一。丙烯醛是一种常见的心血管毒物，能够引起主动脉、心瓣以及心肌损伤。由于人类接触途径广泛，流行病学将其定为心血管疾病的一个高危因素。在人体中，25-100mol/L的丙烯醛可以使心肌纤维细胞致死。有研究表明，用丙烯醛喂养小鼠，增加了主动脉瓣和主动脉弓中的动脉粥样硬化病变形成，同时增加了血浆中胆固醇的浓度，以及病变部位巨噬细胞的积聚。
我们每时每刻都在呼吸，一个人每天要呼吸两万多次，每天至少要与环境交换一万多升气体，可见空气质量的好坏与人的健康息息相关。丙烯醛作为大气污染物之一，有强烈的刺激性。人体吸入丙烯醛蒸气会损害呼吸道，出现咽喉炎、胸部压迫感、支气管炎，大量吸入可致肺炎、肺水肿，还可能出现休克、肾炎及心力衰竭，甚至可以致死。人体吸入丙烯醛还会导致人体内脂肪代谢失常，扰乱血浆中HDL、LDL、TG的水平，引起肠道菌群的紊乱，从而导致动脉粥样硬化。
目前对于动脉粥样硬化的治疗，多数国内、外西医研究者采用的方法为经皮介入治疗、长期抗血栓及抗凝治疗，或采用大剂量降脂药物治疗来使斑块破裂或腐蚀斑块。但是以上方法所使用的药物在长期服用时，会产生肝肾功能损伤等副作用，不利于患者恢复健康；同时治疗费用较高，对于患者的负担较重。因此，急需一种更为安全、治疗成本较低的抗动脉粥样硬化的保健品或功能食物来保护广大人民的身体健康。
芦笋(Asparagus officinalis L.)，学名石刁柏，别名龙须菜、文山竹。芦笋为天门冬科天门冬属多年生宿根草本植物，原产地为欧洲的地中海东岸以及小亚细亚一带，19世纪末20世纪初传入我国。芦笋，性味凉，甘、苦，具有润肺镇咳，祛痰杀虫的功效，是一种集药用和食用于一体的名贵蔬菜，在国际市场上被誉为蔬菜之王。据《中药大辞典》记载，芦笋的块根入药，利尿，可降低肾小管的再吸收。医学巨著《本草纲目》把芦笋列为上品，并对它的药用价值作了详细阐述。近几年来，芦笋作为药食两用的保健型蔬菜，因其众多的药用价值与营养价值而广受欢迎。芦笋中含大量皂苷、黄酮、多酚等成分，具有抗癌、提高机体免疫力、降血脂、抗衰老以及抗疲劳、护肝、抗溃疡、杀菌镇痛等作用。
专利CN201710237232公开了一种芦笋提取物及其制备方法和应用，将制备得到的芦笋提取物用于治疗心脑血管疾病的药物或保健品中。专利CN102190697B公开了一种超声强化提取及分级纯化芦笋皂苷的方法，将芦笋下脚料粉碎筛分，加入含水乙醇进行超声提取，再用水饱和正丁醇进行萃取，然后通入空气进行泡沫分离纯化，进一步采用大孔树脂柱层析纯化，即得高纯度芦笋皂苷。上述方法制备得到的高纯度芦笋皂苷的纯度为82-92％，虽然芦笋皂苷的纯度较高，但是黄酮、多酚等其他功能活性成分含量较低，影响了药物的药效。
因此，开发一种能用于改善大气污染物丙烯醛引起的动脉粥样硬化的芦笋提取物及其制备方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种提取效率高、有效活性成分含量高的芦笋提取物及其制备方法与应用。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种芦笋提取物，所述芦笋提取物包括以下重量份的组分：50-70份皂苷，6-15份多酚，2-5份黄酮，1-2份γ-氨基丁酸。
优选地，所述芦笋提取物包括以下重量份的组分：55-65份皂苷，8-12份多酚，3-5份黄酮，1.5-2份γ-氨基丁酸。
本发明还涉及上述芦笋提取物的制备方法，包括如下步骤：
1)将芦笋原料干燥、粉碎，过筛，调节pH值，加入酶进行酶解，加水微波辅助提取，过滤，得滤液1和滤出物A；
2)将滤出物A用有机溶剂超声辅助提取1-3次，过滤后合并得滤液2和滤出物B；
3)将滤出物B用有机溶剂超高压辅助提取1-3次，过滤后合并得滤液3；
4)合并滤液1、2、3，浓缩，得浓缩液4；
5)将浓缩液4加入正丁醇萃取2-5次，合并萃取液，浓缩、干燥得物质C，即为芦笋提取物。
优选地，所述步骤1)中，将芦笋原料干燥、粉碎，过10-60目筛，调节pH值至4-6。
优选地，所述步骤1)中，酶的质量为芦笋原料的0.1-5％。
更优选地，所述步骤1)中，酶的质量为芦笋原料的2-3％。
优选地，所述酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，两者质量比为1-3:1。
更优选地，纤维素酶和果胶酶的质量比为2-2.5:1。
优选地，所述步骤1)中，加10-30倍量的水微波辅助提取，微波功率100-300w，酶解温度30-60℃，酶解时间1-5h，过滤，得滤液1和滤出物A。
更优选地，所述步骤1)中，加15-20倍量的水微波辅助提取，微波功率150-200w，酶解温度40-50℃，酶解时间2-3h，过滤，得滤液1和滤出物A。
优选地，步骤1)中所述芦笋原料为芦笋茎、芦笋叶、芦笋下脚料、干芦笋中的一种或多种。
更优选地，所述步骤1)如下：将芦笋原料干燥、粉碎，过30-40目筛，调节pH值5-6，将纤维素酶和果胶酶按照质量比2-2.5:1加入到芦笋原料中进行酶解，纤维素酶和果胶酶的总质量为芦笋原料的2-3％，加15-20倍量的水微波辅助提取，微波功率150-200w，酶解温度40-50℃，酶解时间2-3h，过滤，得滤液1和滤出物A。
优选地，所述步骤2)中，滤出物A和有机溶剂的质量体积比为1:5-35g/mL。
更优选地，所述步骤2)中，滤出物A和有机溶剂的质量体积比为1:15-20g/mL。
优选地，所述有机溶剂为乙醇和丙酮的混合溶剂。
更优选地，所述有机溶剂为体积分数为70-95％的乙醇和丙酮的混合溶剂，两者体积比为1-3:1。
优选地，所述步骤2)中，超声时间0.5-3h，超声功率50-200w，过滤，重复提取1-3次，合并得滤液2和滤出物B。
更优选地，步骤2)如下：将滤出物A用体积分数为70-90％的乙醇和丙酮的混合溶剂超声辅助提取，乙醇和丙酮体积比为1-3:1，滤出物A和混合溶剂的质量体积比为1:15-20g/mL，超声时间1-2h，超声功率100-150w，过滤，重复提取2-3次，合并得滤液2和滤出物B。
优选地，所述步骤3)中，滤出物B和有机溶剂的质量体积比为1:20-60g/mL。
更优选地，所述步骤3)中，滤出物B和有机溶剂的质量体积比为1:40-50g/mL。
优选地，所述有机溶剂为乙醇和正己烷的混合溶剂。
更优选地，所述有机溶剂为体积分数为60-80％的乙醇和正己烷的混合溶剂，两者体积比为2-4:1。
优选地，所述步骤3)中，提取压力150-300MPa。
更优选地，所述步骤3)中，提取压力200-250MPa。
优选地，所述步骤3)中，提取时间1-5min，过滤，重复提取1-3次，合并得滤液3。
更优选地，所述步骤3)中，提取时间2-3min，过滤，重复提取2-3次，合并得滤液3。
更优选地，步骤3)如下：将滤出物B用体积分数为60-80％的乙醇和正己烷的混合溶剂超高压辅助提取，乙醇和正己烷体积比为2-4:1，滤出物B和混合溶剂的质量体积比为1:40-50g/mL，提取压力200-250MPa，提取时间2-3min，过滤，重复提取2-3次，合并得滤液3。
优选地，所述步骤4)如下：
合并滤液1、2、3，浓缩至相对密度1.0-1.4，得浓缩液4。
更优选地，所述步骤4)如下：
合并滤液1、2、3，浓缩至相对密度1.2-1.3，得浓缩液4。
优选地，所述步骤5)中，将浓缩液4加入10-20倍量的正丁醇萃取。
更优选地，所述步骤5)中，将浓缩液4加入15-20倍量的正丁醇萃取。
更优选地，所述步骤5)中，正丁醇为水饱和正丁醇。
优选地，所述步骤5)中，重复萃取2-5次，合并萃取液，浓缩、干燥得物质C，即为芦笋提取物。
更优选地，所述步骤5)中，重复萃取3-4次，合并萃取液，浓缩、干燥得物质C，即为芦笋提取物。
更优选地，所述步骤5)如下：将浓缩液4加入15-20倍量的水饱和正丁醇萃取，重复萃取3-4次，合并萃取液，浓缩、干燥得物质C，即为芦笋提取物。
优选地，所述制备方法还包括如下步骤，将物质C溶于去离子水中得溶液D，将溶液D加入大孔吸附树脂层析柱中进行纯化，洗脱，浓缩、干燥得芦笋提取物。
更优选地，将所述物质C溶于1-3倍量的去离子水中得溶液D。
更优选地，所述大孔吸附树脂选用的柱材料是AB-8、D101、HPD100、NKA-9中的一种。
更优选地，所述洗脱过程中用3-6倍柱体积的体积分数为20-50％的乙醇溶液洗脱。
更优选地，所述制备方法还包括如下步骤，将物质C溶于1-3倍量的去离子水中得溶液D，将溶液D加入大孔吸附树脂层析柱中进行纯化，用3-6倍柱体积的体积分数为20-50％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥得芦笋提取物。
更优选地，所述制备方法还包括如下步骤，将物质C溶于1-2倍量的去离子水中得溶液D，将溶液D加入大孔吸附树脂层析柱中进行纯化，用4-5倍柱体积的体积分数为30-40％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥得芦笋提取物。
本发明中芦笋提取物能够改善大气污染物丙烯醛促进的动脉粥样硬化斑块以及血脂代谢紊乱。
本发明中芦笋提取物通过调节肠道菌群逆转大气污染物丙烯醛促进的动脉粥样硬化。
本发明中芦笋提取物能够逆转大气污染物丙烯醛促进的主动脉平滑肌细胞(mVSMCs)凋亡。
本发明还涉及上述芦笋提取物或上述制备方法制备得到的芦笋提取物在制备改善大气污染物丙烯醛引起的动脉粥样硬化、血脂代谢紊乱、肠道菌群紊乱或主动脉平滑肌细胞凋亡的保健品或食品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明发现大气污染物丙烯醛能促进小鼠主动脉粥样硬化斑块的进展，扰乱血浆中HDL、LDL、TG的水平，引起肠道菌群的紊乱，而给以芦笋提取物喂养的小鼠则在斑块、血脂水平及肠道菌群水平上得到了很好的改善。因此，芦笋提取物可以通过调节血脂水平以及肠道菌群逆转大气污染物诱导的动脉粥样硬化的进展。本发明也发现在小鼠主动脉平滑肌细胞(mVSMCs)中，丙烯醛处理能够诱导mVSMCs凋亡，而芦笋提取物可以逆转这一过程。由此可见，芦笋提取物在上述疾病相关药物的制备中具有应用前景。
本发明通过将酶解和微波辅助提取联合，有利于缩短酶解时间，使纤维素酶和果胶酶快速酶解细胞壁以及细胞间的果胶，细胞壁内的有效成分完全释放出来，提高芦笋提取物中有效活性成分含量。
本发明通过将酶解、超声和超高压辅助提取联合，并将乙醇分别和丙酮、正己烷混合用于超声和超高压辅助提取，最后通过萃取，提高了芦笋中有效成分的提取效率和含量。
附图说明
图1表示小鼠主动脉和主动脉瓣粥样硬化斑块检测结果。
图2表示小鼠血浆中低密度脂蛋白胆固醇浓度。
图3表示小鼠血浆中高密度脂蛋白胆固醇浓度。
图4表示小鼠血浆中甘油三酯浓度。
图5表示小鼠血浆中总胆固醇浓度。
图6表示小鼠粪便中菌群分布。
图7表示小鼠肠道菌群在门水平分布的饼图。
图8表示流式分析小鼠主动脉平滑肌细胞凋亡结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
一种芦笋提取物的制备：
1)将20g芦笋原料干燥、粉碎，过10目筛，调节pH值4，将纤维素酶和果胶酶按照质量比1:1加入到芦笋原料中进行酶解，纤维素酶和果胶酶的总质量为芦笋原料的0.1％，加10倍量的水微波辅助提取，微波功率100w，酶解温度30℃，酶解时间1h，过滤，得滤液1和滤出物A；
2)将滤出物A用丙酮和体积分数为70％的乙醇的混合溶剂超声辅助提取，乙醇和丙酮体积比为1:1，滤出物A和混合溶剂的质量体积比为1:5g/mL，超声时间0.5h，超声功率50w，过滤，得滤液2和滤出物B；
3)将滤出物B用正己烷和体积分数为60％的乙醇的混合溶剂超高压辅助提取，乙醇和正己烷体积比为2:1，滤出物B和混合溶剂的质量体积比为1:20g/mL，提取压力150MPa，提取时间1min，过滤，重复提取1次，合并得滤液3；
4)合并滤液1、2、3，浓缩至相对密度1.0，得浓缩液4；
5)将浓缩液4加入10倍量的正丁醇萃取，重复萃取2次，合并萃取液，浓缩、干燥得物质C，即为芦笋提取物。
实施例2
一种芦笋提取物的制备：
1)将20g芦笋原料干燥、粉碎，过60目筛，调节pH值6，将纤维素酶和果胶酶按照质量比3:1加入到芦笋原料中进行酶解，纤维素酶和果胶酶的总质量为芦笋原料的5％，加30倍量的水微波辅助提取，微波功率300w，酶解温度60℃，酶解时间5h，过滤，得滤液1和滤出物A；
2)将滤出物A用丙酮和体积分数为90％的乙醇的混合溶剂超声辅助提取，乙醇和丙酮体积比为3:1，滤出物A和混合溶剂的质量体积比为1:35g/mL，超声时间3h，超声功率200w，过滤，重复提取3次，合并得滤液2和滤出物B；
3)将滤出物B用正己烷和体积分数为80％的乙醇的混合溶剂超高压辅助提取，乙醇和正己烷体积比为4:1，滤出物B和混合溶剂的质量体积比为1:60g/mL，提取压力300MPa，提取时间5min，过滤，重复提取3次，合并得滤液3；
4)合并滤液1、2、3，浓缩至相对密度1.4，得浓缩液4；
5)将浓缩液4加入20倍量的正丁醇萃取，重复萃取5次，合并萃取液，浓缩、干燥得物质C，即为芦笋提取物。
实施例3
一种芦笋提取物的制备：
1)将20g芦笋原料干燥、粉碎，过30目筛，调节pH值5，将纤维素酶和果胶酶按照质量比2:1加入到芦笋原料中进行酶解，纤维素酶和果胶酶的总质量为芦笋原料的2％，加15倍量的水微波辅助提取，微波功率200w，酶解温度45℃，酶解时间3h，过滤，得滤液1和滤出物A；
2)将滤出物A用丙酮和体积分数为80％的乙醇的混合溶剂超声辅助提取，乙醇和丙酮体积比为2:1，滤出物A和混合溶剂的质量体积比为1:15g/mL，超声时间2h，超声功率150w，过滤，重复提取2次，合并得滤液2和滤出物B；
3)将滤出物B用正己烷和体积分数为70％的乙醇的混合溶剂超高压辅助提取，乙醇和正己烷体积比为3:1，滤出物B和混合溶剂的质量体积比为1:40g/mL，提取压力250MPa，提取时间3min，过滤，重复提取2次，合并得滤液3；
4)合并滤液1、2、3，浓缩至相对密度1.2，得浓缩液4；
5)将浓缩液4加入15倍量的水饱和正丁醇萃取，重复萃取4次，合并萃取液，浓缩、干燥得物质C；
6)将物质C溶于3倍量的去离子水中得溶液D，将溶液D加入AB-8大孔吸附树脂层析柱中进行纯化，用6倍柱体积的体积分数为50％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥得芦笋提取物。
实施例4
一种芦笋提取物的制备：
1)将20g芦笋原料干燥、粉碎，过40目筛，调节pH值6，将纤维素酶和果胶酶按照质量比2.5:1加入到芦笋原料中进行酶解，纤维素酶和果胶酶的总质量为芦笋原料的3％，加20倍量的水微波辅助提取，微波功率150w，酶解温度40℃，酶解时间2h，过滤，得滤液1和滤出物A；
2)将滤出物A用丙酮和体积分数为85％的乙醇的混合溶剂超声辅助提取，乙醇和丙酮体积比为2:1，滤出物A和混合溶剂的质量体积比为1:20g/mL，超声时间2h，超声功率150w，过滤，重复提取2次，合并得滤液2和滤出物B；
3)将滤出物B用正己烷和体积分数为75％的乙醇的混合溶剂超高压辅助提取，乙醇和正己烷体积比为3:1，滤出物B和混合溶剂的质量体积比为1:45g/mL，提取压力200MPa，提取时间3min，过滤，重复提取3次，合并得滤液3；
4)合并滤液1、2、3，浓缩至相对密度1.3，得浓缩液4；
5)将浓缩液4加入10-20倍量的水饱和正丁醇萃取，重复萃取3次，合并萃取液，浓缩、干燥得物质C；
6)将物质C溶于2倍量的去离子水中得溶液D，将溶液D加入D101大孔吸附树脂层析柱中进行纯化，用4倍柱体积的体积分数为35％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥得芦笋提取物。
对比例1
与实施例4的区别仅在于步骤1)没有采用酶解，其余步骤均相同，具体如下：
将芦笋原料干燥、粉碎，过40目筛，调节pH值6，加20倍量的水微波辅助提取，微波功率150w，提取温度40℃，提取时间2h，过滤，得滤液1和滤出物A。
对比例2
与实施例4的区别仅在于步骤2)没有采用超声辅助提取，其余步骤均相同，具体如下：
将滤出物A用丙酮和体积分数为85％的乙醇的混合溶剂提取，乙醇和丙酮体积比为2:1，滤出物A和混合溶剂的质量体积比为1:20g/mL，过滤，重复提取2次，合并得滤液2和滤出物B。
对比例3
与实施例4的区别仅在于步骤2)采用的有机溶剂为体积分数为85％的乙醇，其余条件均相同，具体如下：
将滤出物A用体积分数为85％的乙醇超声辅助提取，滤出物A和乙醇的质量体积比为1:20g/mL，超声时间2h，超声功率150w，过滤，重复提取2次，合并得滤液2和滤出物B。
对比例4
与实施例4的区别仅在于步骤2)采用的有机溶剂为丙酮和体积分数为85％的乙醇的混合溶剂，乙醇和丙酮体积比为1:3，其余条件均相同。
对比例5
与实施例4的区别仅在于步骤3)没有采用超高压辅助提取，其余步骤均相同，具体如下：
将滤出物B用正己烷和体积分数为75％的乙醇的混合溶剂提取，乙醇和正己烷体积比为3:1，滤出物B和混合溶剂的质量体积比为1:45g/mL，提取时间3min，过滤，重复提取3次，合并得滤液3。
对比例6
与实施例4的区别仅在于步骤3)采用的有机溶剂为体积分数为75％的乙醇，其余条件均相同，具体如下：
将滤出物B用体积分数为75％的乙醇超高压辅助提取，滤出物B和乙醇的质量体积比为1:45g/mL，提取压力200MPa，提取时间3min，过滤，重复提取3次，合并得滤液3。
对比例7
与实施例4的区别仅在于步骤3)采用的有机溶剂为正己烷和体积分数为75％的乙醇的混合溶剂，乙醇和正己烷的体积比为1:2，其余条件均相同。
测试例1
对实施例1-4和对比例1-7制备得到的芦笋提取物中的活性成分进行测试。
其中皂苷检测依据DB 13/T 2818-2018芦笋汁(粉)中芦笋皂苷检测方法。
多酚检测依据福林酚法，以没食子酸为标品：
标准曲线：分别吸取5、4、3、2、1ml0.02％的没食子酸溶液于10ml容量瓶中，用水定容，取0.5ml容量瓶中的液体，加2.5mL0.2N的福林酚，震荡20秒，反应5min，再加2mL7.5％碳酸钠，震荡20s，反应2h，以2.0mL水按同样显色操作为空白，于760nm测光其吸光值。横坐标为没食子酸质量，纵坐标为吸光值，计算回归方程y＝ax+b(y为吸光值，x为试管中葡萄糖的质量，a为回归直线的斜率，b为回归直线的截距)；
样品测定：准确称取样品1g于1000ml容量瓶中，用水定容。吸取500μL容量瓶中的液体，加2.5mL0.2N的福林酚，震荡20秒，反应5min，再加2mL7.5％碳酸钠，震荡20s，反应2h，以2.0mL水按同样显色操作为空白，于760nm测光其吸光值。
黄酮检测依据亚硝酸钠-硝酸铝法，以芦丁为标品：
标准曲线：精密量取芦丁对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL容量瓶中，各加入30％乙醇至1.0mL，加入0.5mL0.05g/mLNaNO2溶液，放置6min后再加入0.3mL0.1g/mLA1(NO3)3溶液，摇匀，放置6min后加入3mL0.04g/mLNaOH溶液，用水定容至标线，摇匀，放置15min，在510nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁对照品溶液的质量为横坐标，计算回归方程y＝ax+b(y为吸光值，x为试管中芦丁的质量，a为回归直线的斜率，b为回归直线的截距)；
样品检测：准确称取样品1g于100ml容量瓶中，加入30％乙醇至1.0mL，加入0.5mL0.05g/mLNaNO2溶液，放置6min后再加入0.3mL0.1g/mLA1(NO3)3溶液，摇匀，放置6min后加入3mL0.04g/mLNaOH溶液，用水定容至标线，摇匀，放置15min，在510nm处测定吸光度。
γ-氨基丁酸检测依据QB/T 4587-2013γ-氨基丁酸标准。
上述测试结果用百分数表示，结果如表1所示。
表1芦笋提取物中的活性成分测试结果
皂苷(％) 多酚(％) 黄酮(％) γ-氨基丁酸(％)
实施例1 58.4 8.4 3.4 1.1
实施例2 62.2 10.9 4.1 1.5
实施例3 67.5 12.2 4.5 1.7
实施例4 70.1 14.8 5.0 1.9
对比例1 47.5 5.1 0.8 0.5
对比例2 45.3 4.7 1.1 0.4
对比例3 46.2 5.2 1.7 0.7
对比例4 43.4 4.3 1.5 0.8
对比例5 41.1 3.4 0.9 0.3
对比例6 42.9 3.6 1.3 0.6
对比例7 42.5 4.1 1.4 0.5
测试例2
丙烯醛(acrolein)，Sinopharm Chemical Reagent Company(Nanjing,China)即国药化学试剂公司(中国南京)。
载脂蛋白E缺陷型(apoE-/-)小鼠(南京大学模型动物研究中心)。
将24只7周龄雄性apoE-/-小鼠随机分为3组，每组8只，分别为对照组、丙烯醛组和丙烯醛+芦笋提取物组，具体如下：
(1)对照组：饮用水中没有添加补充剂。
(2)丙烯醛组：饲养1周后，在饮用水中添加3mg/kg/天的丙烯醛。
(3)丙烯醛+芦笋提取物组：饲养1周后，在饮用水中添加丙烯醛和实施例4制备的芦笋提取物(分别为3mg/kg/天和250μg/kg/天)。
同时3组小鼠给予高脂肪饮食(18.9％蛋白质，44.6％碳水化合物和36.5％kcal/g脂肪)13周。通过监测每日的水摄入量来确认丙烯醛和芦笋提取物的摄入量。所有动物实验均根据实验动物护理和使用指南进行，并且该方案已经由南京医科大学动物伦理和福利委员会(AEWC)审查和批准。
1.测试芦笋提取物对丙烯醛诱导的小鼠动脉粥样硬化斑块的影响
用10％***固定主动脉及主动脉瓣。冷冻切片后，用油红O染色，标记主动脉及主动脉瓣的动脉粥样硬化斑块区域。通过图像分析完成阳性染色区域的定量。结果如图1所示，其中图1A为小鼠主动脉的油红O染色，图1B是1A的斑块的定量结果，根据图示可见，丙烯醛促进了主动脉斑块的进展，而芦笋提取物可以逆转丙烯醛的这一促动脉粥样硬化作用。图1C和1D显示的是小鼠主动脉瓣的油红O染色，也证实了芦笋提取物可以改善丙烯醛的致动脉粥样硬化作用。*p<0.05,丙烯醛组vs.对照组,#p<0.05,丙烯醛+芦笋提取物联合组vs.丙烯醛组。
2.测试芦笋提取物对丙烯醛诱导的小鼠血脂水平紊乱的影响
使用南京建成生物工程研究所的生化诊断试剂盒A113-2，F003，F001，F002(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute,Nanjing,China)，进行血浆中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，甘油三酯(TG)和总胆固醇(T-CHO)的分析。结果如图2-5所示，丙烯醛处理明显提高了小鼠血浆中LDL和TG水平，而芦笋提取物作用之后LDL和TG水平得到了显著的改善。*p<0.05,**p<0.01,丙烯醛组vs.对照组,#p<0.05,##p<0.01,丙烯醛+芦笋提取物联合组vs.丙烯醛组.
3.测试芦笋提取物对丙烯醛诱导的小鼠肠道菌群紊乱的影响
在丙烯醛和/或芦笋提取物处理结束后，收集每只小鼠的新鲜粪便，并立即存放于-80℃。使用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen，Hilden，Germany)提取粪便微生物DNA，使用NanoDrop分光光度计(Thermo Electron)定量。使用引物338F和806R对微生物16SrRNA基因的V3-V4区域进行PCR扩增。将PCR混合物加热至95℃3分钟，27个循环，95℃30秒，55℃30秒，72℃45秒和72℃10分钟。用2％琼脂糖凝胶分析PCR产物。然后，根据标准方案在Illumina MiSeq平台(Illumina，San Diego，CA，USA)上进行合并和配对末端测序。测序完成后，所有原始读数都被解复用并通过Trimmomatic和FLASH进行质量过滤。使用UCHIME去除嵌合序列，并通过Quantitative Insights into Microbial Ecology(QIIME，版本1.7)将高质量序列聚集到操作分类单元(OTU)中。OTU被定义为基于16S rRNA序列具有97％相似性的读段簇。结果如图6和图7所示，根据图6A所示，对照组、丙烯醛组、丙烯醛+芦笋提取物组的稀释曲线均趋于平滑，说明三组的样本数充足。Sobs为观测到的OTU数，图6A显示丙烯醛+芦笋提取物组的稀释曲线位于最上方，丙烯醛组的稀释曲线位于最下方。图6B为所有样品的主成分分析(PCA)，结果显示三组的肠道菌群分为明显的三群，其中PC1解释了31.76％，PC2解释了17.69％。图7为肠道菌群在门水平分布的饼图，图7A、图7B、图7C分别表示对照组、丙烯醛组和丙烯醛+芦笋提取物组肠道菌群在门水平分布的饼图。如图7所示丙烯醛处理后厚壁菌门的比例升至56.25％，拟杆菌门的比例下降至33.8％。然而在联合芦笋提取物处理后，厚壁菌门和拟杆菌门的变化趋向对照组水平。综合可见，芦笋提取物(AE)改善了丙烯醛(Acrolein)诱导的小鼠肠道菌群紊乱，改善了丙烯醛(Acrolein)上调的小鼠肠道厚壁菌门/拟杆菌门比值。
4.芦笋提取物可以减缓丙烯醛诱导的血管平滑肌细胞的凋亡
小鼠主动脉血管平滑肌细胞系(mVSMCs)用含10％胎牛血清DMEM培养液培养，其中含有100UI/mL青霉素与100μg/mL链霉素，放置于培养箱中，在37℃、5％CO2饱和湿度条件下生长。0.25％胰酶-EDTA消化传代，取对数生长期的细胞用于实验。流式分析细胞凋亡结果如图8A和8B所示，根据图8可见，丙烯醛处理后细胞凋亡率由2.61增加到5.64，而芦笋提取物处理后凋亡下降至3.5。***p<0.001,丙烯醛组vs.对照组,###p<0.001,丙烯醛+芦笋提取物联合组vs.丙烯醛组。由此可见，芦笋提取物逆转丙烯醛诱导的主动脉平滑肌细胞凋亡。

Claims (7)

1.一种芦笋提取物，其特征在于，所述芦笋提取物包括以下重量份的组分：50-70份皂苷，6-15份多酚，2-5份黄酮，1-2份γ-氨基丁酸；
所述芦笋提取物的制备方法，包括如下步骤：
1）将芦笋原料干燥、粉碎，过10-60目筛，调节pH值4-6，加入酶进行酶解，酶的质量为芦笋原料的0.1-5%，加10-30倍量的水微波辅助提取，微波功率100-300w，酶解温度30-60℃，酶解时间1-5h，过滤，得滤液1和滤出物A；
2）将滤出物A用有机溶剂超声辅助提取，所述有机溶剂为体积分数为70-95%的乙醇和丙酮的混合溶剂，两者体积比为1-3:1；滤出物A和有机溶剂的质量体积比为1:5-35g/mL，超声时间0.5-3h，超声功率50-200w，过滤，重复提取1-3次，合并得滤液2和滤出物B；
3）将滤出物B用有机溶剂超高压辅助提取，滤出物B和有机溶剂的质量体积比为1:20-60g/mL，提取压力150-300MPa，提取时间1-5min，过滤，重复提取1-3次，合并得滤液3；
4）合并滤液1、2、3，浓缩至相对密度1.0-1.4，得浓缩液4；
5）将浓缩液4加入10-20倍量的正丁醇萃取，重复萃取2-5次，合并萃取液，浓缩、干燥得物质C，即为芦笋提取物；
所述酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，两者质量比为1-3:1；所述纤维素酶和果胶酶的质量比为2-2.5:1；
步骤3）中所述有机溶剂为体积分数为60-80%的乙醇和正己烷的混合溶剂，两者体积比为2-4:1。
2.根据权利要求1所述的芦笋提取物，其特征在于，所述芦笋提取物包括以下重量份的组分：55-65份皂苷，8-12份多酚，3-5份黄酮，1.5-2份γ-氨基丁酸。
3.一种权利要求1或2所述芦笋提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将芦笋原料干燥、粉碎，过10-60目筛，调节pH值4-6，加入酶进行酶解，酶的质量为芦笋原料的0.1-5%，加10-30倍量的水微波辅助提取，微波功率100-300w，酶解温度30-60℃，酶解时间1-5h，过滤，得滤液1和滤出物A；
2）将滤出物A用有机溶剂超声辅助提取，所述有机溶剂为体积分数为70-95%的乙醇和丙酮的混合溶剂，两者体积比为1-3:1；滤出物A和有机溶剂的质量体积比为1:5-35g/mL，超声时间0.5-3h，超声功率50-200w，过滤，重复提取1-3次，合并得滤液2和滤出物B；
3）将滤出物B用有机溶剂超高压辅助提取，滤出物B和有机溶剂的质量体积比为1:20-60g/mL，提取压力150-300MPa，提取时间1-5min，过滤，重复提取1-3次，合并得滤液3；
4）合并滤液1、2、3，浓缩至相对密度1.0-1.4，得浓缩液4；
5）将浓缩液4加入10-20倍量的正丁醇萃取，重复萃取2-5次，合并萃取液，浓缩、干燥得物质C，即为芦笋提取物；
所述酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，两者质量比为1-3:1；
步骤3）中所述有机溶剂为体积分数为60-80%的乙醇和正己烷的混合溶剂，两者体积比为2-4:1。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述芦笋原料为芦笋茎、芦笋叶、芦笋下脚料、干芦笋中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下步骤，将物质C溶于去离子水中得溶液D，将溶液D加入大孔吸附树脂层析柱中进行纯化，洗脱，浓缩、干燥得芦笋提取物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述物质C与去离子水的质量比为1:1-3；所述洗脱过程中用3-6倍柱体积的体积分数为20-50%的乙醇溶液洗脱；所述大孔吸附树脂选用的柱材料为AB-8、D101、HPD100、NKA-9中的一种。
7.一种权利要求1-2任一项所述芦笋提取物或权利要求3-6任一项所述制备方法制备得到的芦笋提取物在制备改善大气污染物丙烯醛引起的动脉粥样硬化、血脂代谢紊乱、肠道菌群紊乱或主动脉平滑肌细胞凋亡的药物中的应用。
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