CN109997872A - 一种微生物菌肥及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物菌肥及其制备方法和应用，微生物菌肥由枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌按照(1～3)∶(1～3)复配而成；枯草芽胞杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌的菌液浓度均为5x108cfu/ml。本发明的微生物菌肥对柿树炭疽病防治效果好、无化学残留且不易产生抗药性，还能促进柿树增产20％以上。
Description
技术领域
本发明涉及肥料生产技术领域，更具体的说是涉及一种微生物菌肥及其制备方法和应用。
背景技术
炭疽病是柿树最严重的病害之一，特别是近几年来，许多种植户由于此病害而造成严重的减产，甚至无果可收，受其危害会严重落叶、落果，新梢枯死，甚至整株死亡。果实染病，多发生在6月下旬至7月上旬，也可延续到采收期；初在果面产生针头大小深褐色至黑色小斑点，后扩大为圆形或椭圆形，稍凹陷，***呈黄褐色，直径5～25微米；中央密生灰色至黑色轮纹状排列的小粒点，遇雨或高湿时，溢出粉红色粘状物质；病斑常深入皮层以下，果内形成黑色硬块，一个病果上一般生1～2个病斑，多者数十个，常早期脱落。叶片染病，多发生于叶柄和叶脉，初黄褐色，后变为黑褐色至黑色，长条状或不规则形。新梢染病，多发生在5月下旬至6月上旬，最初于表面产生黑色圆形小斑点，后变暗褐色，病斑扩大呈长椭圆形，中部稍凹陷并现褐色纵裂，其上产生黑色小粒点，即病菌分生孢子盘。天气潮湿时黑色病斑上涌出红色粘状物，即孢子团。病斑长10～20毫米，其下部木质部腐朽，病梢极易折断；当枝条上病斑大时，病斑以上枝条易枯死。
目前，对于柿树炭疽病的防治，在加强栽培管理措施、提高植株抗病能力的基础上，仍以化学药剂为主，常用杀菌剂有咪鲜胺、苯醚甲环唑、戊唑醇、代森猛锌、甲基硫菌灵、百菌清、多菌灵、异菌脲、敌菌灵、多效唑等。然而，由于化学农药的连续、不合理使用，不仅造成了农药残留和环境污染，也使病原菌产生了抗药性，降低了防治效果。
因此，提供一种对柿树炭疽病防治效果好、无化学残留、不易产生抗药性的微生物菌肥及其制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种微生物菌肥及其制备方法和应用，该微生物菌肥对柿树炭疽病防治效果好、无化学残留且不易产生抗药性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种微生物菌肥，由枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌按照(1～3)∶(1～3)复配而成；所述枯草芽胞杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌的菌液浓度均为5x108cfu/ml。
进一步，一种微生物菌肥的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌菌液：
a、菌种培养：将保存的枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌分别转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于30～37℃培养15～20h，取此斜面菌种转接含有液体培养基的摇瓶培养，于30～37℃培养24～36h；
b、种子罐培养：在种子罐中加入液体培养基，装液量为30％～60％，调节pH至6.6～7.8，121℃灭菌20～30min，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压为0.04～0.06MPa，当温度降至30～37℃时，将摇瓶中的菌体用100～200ml无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持30～37℃、罐压0.04～0.06MPa，进行深层通气搅拌培养16～24h；
c、发酵罐培养：将种子罐中的培养液以5％～10％的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中，保持30～37℃、罐压0.04～0.06MPa，进行深层通气搅拌培养24～30h，使枯草芽胞杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌的菌液浓度达到5x108cfu/ml；
(2)枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液混合：
将步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液按体积比(1～3)∶(1～3)混合均匀，即得微生物菌肥。
进一步，所述固体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏7g，氯化钠7g，蒸馏水定容至1000ml，调节pH 7.2～7.4，加入18～20g琼脂。
进一步，所述液体培养基的配方为：蛋白胨20g，酵母膏5g，磷酸氢二钾0.2g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.1g，葡萄糖8g，碳酸钙10g，蒸馏水定容至1000ml。
所述微生物菌肥的使用方法，将枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液按体积比(1～3)∶(1～3)混合均匀，用水稀释100～500倍，喷施于柿树。
所述微生物菌肥在防治柿树炭疽病中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种微生物菌肥及其制备方法和应用，该微生物菌肥由枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌按照(1～3)∶(1～3)复配而成，对柿树炭疽病防治效果好、无化学残留且不易产生抗药性，还能促进柿树增产20％以上。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)编号为ATCC 21951；洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)编号为ATCC 25416；均为购买获得。
实施例1
一种微生物菌肥的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌菌液：
a、菌种培养：将保存的枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌分别转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于30℃培养20h，取此斜面菌种转接含有液体培养基的摇瓶培养，于30℃培养36h；
b、种子罐培养：在种子罐中加入液体培养基，装液量为30％，调节pH至6.6，121℃灭菌20min，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压为0.04MPa，当温度降至30℃时，将摇瓶中的菌体用100ml无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持30℃、罐压0.04MPa，进行深层通气搅拌培养24h；
c、发酵罐培养：将种子罐中的培养液以10％的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中，保持30℃、罐压0.04MPa，进行深层通气搅拌培养30h，使枯草芽胞杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌的菌液浓度达到5x108cfu/ml；
(2)枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液混合：
将步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液按体积比1∶3混合均匀，即得微生物菌肥。
实施例2
一种微生物菌肥的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌菌液：
a、菌种培养：将保存的枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌分别转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于37℃培养15h，取此斜面菌种转接含有液体培养基的摇瓶培养，于37℃培养24h；
b、种子罐培养：在种子罐中加入液体培养基，装液量为40％，调节pH至7.8，121℃灭菌30min，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压为0.06MPa，当温度降至37℃时，将摇瓶中的菌体用200ml无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持37℃、罐压0.06MPa，进行深层通气搅拌培养16h；
c、发酵罐培养：将种子罐中的培养液以5％的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中，保持37℃、罐压0.06MPa，进行深层通气搅拌培养24h，使枯草芽胞杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌的菌液浓度达到5x108cfu/ml；
(2)枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液混合：
将步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液按体积比1∶1混合均匀，即得微生物菌肥。
实施例3
一种微生物菌肥的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌菌液：
a、菌种培养：将保存的枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌分别转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于35℃培养18h，取此斜面菌种转接含有液体培养基的摇瓶培养，于35℃培养30h；
b、种子罐培养：在种子罐中加入液体培养基，装液量为50％，调节pH至7.2，121℃灭菌25min，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压为0.05MPa，当温度降至35℃时，将摇瓶中的菌体用150ml无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持35℃、罐压0.05MPa，进行深层通气搅拌培养20h；
c、发酵罐培养：将种子罐中的培养液以8％的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中，保持35℃、罐压0.05MPa，进行深层通气搅拌培养27h，使枯草芽胞杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌的菌液浓度达到5x108cfu/ml；
(2)枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液混合：
将步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液按体积比3∶1混合均匀，即得微生物菌肥。
实施例4
一种微生物菌肥的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌菌液：
a、菌种培养：将保存的枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌分别转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于30℃培养20h，取此斜面菌种转接含有液体培养基的摇瓶培养，于30℃培养36h；
b、种子罐培养：在种子罐中加入液体培养基，装液量为30％，调节pH至6.6，121℃灭菌20min，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压为0.04MPa，当温度降至30℃时，将摇瓶中的菌体用100ml无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持30℃、罐压0.04MPa，进行深层通气搅拌培养24h；
c、发酵罐培养：将种子罐中的培养液以10％的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中，保持30℃、罐压0.04MPa，进行深层通气搅拌培养30h，使枯草芽胞杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌的菌液浓度达到5x108cfu/ml；
(2)枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液混合：
将步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液按体积比1∶2混合均匀，即得微生物菌肥。
实施例5
一种微生物菌肥的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌菌液：
a、菌种培养：将保存的枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌分别转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于30℃培养20h，取此斜面菌种转接含有液体培养基的摇瓶培养，于30℃培养36h；
b、种子罐培养：在种子罐中加入液体培养基，装液量为30％，调节pH至6.6，121℃灭菌20min，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压为0.04MPa，当温度降至30℃时，将摇瓶中的菌体用100ml无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持30℃、罐压0.04MPa，进行深层通气搅拌培养24h；
c、发酵罐培养：将种子罐中的培养液以10％的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中，保持30℃、罐压0.04MPa，进行深层通气搅拌培养30h，使枯草芽胞杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌的菌液浓度达到5x108cfu/ml；
(2)枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液混合：
将步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液按体积比2∶1混合均匀，即得微生物菌肥。
对比例1
一种微生物菌肥，只含有枯草芽孢杆菌，枯草芽胞杆菌的菌液浓度为5x108cfu/ml。
对比例2
一种微生物菌肥，只含有洋葱伯克霍尔德氏菌，洋葱伯克霍尔德氏菌的菌液浓度为5x108cfu/ml。
(一)分别将实施例1-5，对比例1-2获得的微生物菌肥稀释100倍，用于喷施。
柿树炭疽病防治试验采用田间试验，选取长势相近，炭疽病病症基本一致的柿树；每个处理小区50株，每个处理(实施例1-5，对比例1-2的微生物菌肥稀释100倍；对照例：清水)各3个重复，采用随机区组排列，处理小区间留一行作保护行，用背负式电动喷雾器在上午露水干后进行喷洒，喷施于柿树的树干、枝条和叶；在5月上旬，开始喷洒，每隔15d喷施一次，共喷施4次；在下一次喷施前记录每次喷施后3个重复的平均病株数，最后一次喷施后15d记录3个重复的平均病株数，以及第二年和第三年的炭疽病复发情况，并计算与对照例相比，各处理第一年的增产率，结果如表1所示。
表1
由表1可知，采用本发明的微生物菌肥，能够高效防治柿树炭疽病，防治效果明显优于单独使用枯草芽孢杆菌或洋葱伯克霍尔德氏菌；且使用3年后基本不复发。
(二)分别将实施例1-5，对比例1-2获得的微生物菌肥稀释300倍，用于喷施。
柿树炭疽病防治试验采用田间试验，选取长势相近，炭疽病病症基本一致的柿树；每个处理小区50株，每个处理(实施例1-5，对比例1-2的微生物菌肥稀释300倍；对照例：清水)各3个重复，采用随机区组排列，处理小区间留一行作保护行，用背负式电动喷雾器在上午露水干后进行喷洒，喷施于柿树的树干、枝条和叶；在5月上旬，开始喷洒，每隔15d喷施一次，共喷施4次；在下一次喷施前记录每次喷施后3个重复的平均病株数，最后一次喷施后15d记录3个重复的平均病株数，以及第二年和第三年的炭疽病复发情况，并计算与对照例相比，各处理第一年的增产率，结果如表2所示。
表2
由表2可知，采用本发明的微生物菌肥，能够高效防治柿树炭疽病，防治效果明显优于单独使用枯草芽孢杆菌或洋葱伯克霍尔德氏菌；且使用3年后基本不复发。
(三)分别将实施例1-5，对比例1-2获得的微生物菌肥稀释500倍，用于喷施。
柿树炭疽病防治试验采用田间试验，选取长势相近，炭疽病病症基本一致的柿树；每个处理小区50株，每个处理(实施例1-5，对比例1-2的微生物菌肥稀释500倍；对照例：清水)各3个重复，采用随机区组排列，处理小区间留一行作保护行，用背负式电动喷雾器在上午露水干后进行喷洒，喷施于柿树的树干、枝条和叶；在5月上旬，开始喷洒，每隔15d喷施一次，共喷施4次；在下一次喷施前记录每次喷施后3个重复的平均病株数，最后一次喷施后15d记录3个重复的平均病株数，以及第二年和第三年的炭疽病复发情况，并计算与对照例相比，各处理第一年的增产率，结果如表3所示。
表3
由表3可知，采用本发明的微生物菌肥，能够高效防治柿树炭疽病，防治效果明显优于单独使用枯草芽孢杆菌或洋葱伯克霍尔德氏菌；且使用3年后基本不复发。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种微生物菌肥，其特征在于，由枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌按照(1～3)∶(1～3)复配而成；所述枯草芽胞杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌的菌液浓度均为5x108cfu/ml。
2.根据权利要求1所述的一种微生物菌肥的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)制备枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌菌液：
a、菌种培养：将保存的枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌分别转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于30～37℃培养15～20h，取此斜面菌种转接含有液体培养基的摇瓶培养，于30～37℃培养24～36h；
b、种子罐培养：在种子罐中加入液体培养基，装液量为30％～60％，调节pH至6.6～7.8，121℃灭菌20～30min，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压为0.04～0.06MPa，当温度降至30～37℃时，将摇瓶中的菌体用100～200ml无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持30～37℃、罐压0.04～0.06MPa，进行深层通气搅拌培养16～24h；
c、发酵罐培养：将种子罐中的培养液以5％～10％的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中，保持30～37℃、罐压0.04～0.06MPa，进行深层通气搅拌培养24～30h，使枯草芽胞杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌的菌液浓度达到5x108cfu/ml；
(2)枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液混合：
将步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌与洋葱伯克霍尔德氏菌菌液按体积比(1～3)∶(1～3)混合均匀，即得微生物菌肥。
3.根据权利要求2所述的一种微生物菌肥的制备方法，其特征在于，所述固体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏7g，氯化钠7g，蒸馏水定容至1000ml，调节pH 7.2～7.4，加入18～20g琼脂。
4.根据权利要求2所述的一种微生物菌肥的制备方法，其特征在于，所述液体培养基的配方为：蛋白胨20g，酵母膏5g，磷酸氢二钾0.2g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.1g，葡萄糖8g，碳酸钙10g，蒸馏水定容至1000ml。
5.根据权利要求1所述的一种微生物菌肥，在防治柿树炭疽病中的应用。
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