CN111466266B

CN111466266B - 一种促进水稻生长和促进水稻铁缺乏环境下铁元素吸收的方法

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Publication number: CN111466266B
Application number: CN202010061326.0A
Authority: CN
Inventors: 朱咏华; 高艳; 曹力丹; 刘选明; 喻金兰; 卜志刚; 姚晴晴
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan Xinchangshan Agricultural Development Co ltd
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2040-01-19
Also published as: CN111466266A

Abstract

本发明公开了一种在正常生长环境中可以促进水稻生长和在缺乏可直接利用铁的环境中能够促进水稻对铁元素吸收的方法，该方法利用的是一株水稻内生放线菌Streptomycessp.OsiSh‑2，采用其孢子悬浮液，正常情况下的水稻可以用两种不同的手段对进行处理：1)在水稻叶表面喷施孢子悬浮液；2)以其孢子悬浮液包埋消毒后的水稻种子。本发明方法促进水稻的生长，提高叶绿素含量和光合作用速率，水稻的株高、根长和地上地下部分鲜干重等水稻生物量显著增加；在缺铁的逆境下，以其孢子悬浮液包埋消毒后的水稻种子，使水稻中铁含量得到显著的提高，保证水稻在缺铁胁迫下的正常生长。

Description

一种促进水稻生长和促进水稻铁缺乏环境下铁元素吸收的方法

技术领域

本发明属于生物肥料技术领域，具体涉及利用一株水稻内生放线菌，在正常生长情况下促进水稻生长和在缺乏可直接利用铁的环境中促进水稻对铁元素吸收，维持水稻的生长的方法。

背景技术

水稻是我国乃至全世界的重要粮食作物，其产量与质量与人类的健康息息相关。促进水稻生长的手段目前主要包括喷施化学或生物肥料，而随着我国化学肥料零增长策略的制定，环境友好的生物肥料研究越来越受到重视。例如，曾益波等报道的光合细菌中的沼泽红假单胞菌PSB06菌剂能促进水稻苗期生长；Doni Febri等报道的基于木霉属的Trichodermaspp.的生物肥料能够提高水稻产量达30%；Suárez-Moreno Zulma Rocío 等报道的Streptomyces sp. A20可以促进水稻生长。

植物内生菌是一类可以稳定定殖于植物组织内部，且不引起植物明显病症的微生物。由于内生菌长期生活在植物组织内部，可与植物协同进化，其分泌的物质能够快速被植物识别并利用，以形成更加协调的互惠共生关系，如内生菌可通过产生一系列生长相关的植物生长调节物质，如：IAA，ACC脱氨酶和铁载体等促进宿主的生长。同时，内生菌在植物体内独特的生态位，相较于易受环境影响的根际微生物更具生存优势。相较于真菌和细菌，放线菌能够产生丰富的次生代谢产物，在同等条件下其促生长潜力要优于其他微生物。基于此，植物内生放线菌适合作为生物肥料进行推广。如，Patel Janki K.等报道了一些内生放线菌Streptomyces spp.，通过在水稻水培液中加入放线菌孢子悬液的方法，可以促进水稻地上部分的生长；Wang Wenfeng等报道了内生放线菌Streptomycessp. A9, 采用孢子液浸泡水稻种子的方法，可以促进水稻幼苗生长；另外，Liotti Rhavena Graziela 等报道了一株内生放线菌Streptomyces griseocarneus R132，通过叶面喷菌液，可以促进辣椒地上部分的生长；Le Xuyen H. 等报道的Streptomyces spp. LuP30 and LuP47B，通过种子包埋放线菌孢子液，可以提高紫花苜蓿的地上部分干重；Ge Youyou等报道将内生放线菌Streptomyces sp. SSD49孢子液直接浇灌在植物生长的土壤中，可促进大豆、高粱和胡椒的生长。但目前基于放线菌，尤其是内生防线菌的生物肥料的专利基本很难看到。与普遍报道的方法所不同的是，本发明所述的方法是通过种子包埋或幼苗喷施孢子液的方式对水稻进行处理，保证内生菌和水稻形成互利共生的状态，最终促进水稻生长。

铁是所有生物体的必需营养素，参与多种生物化学反应过程，具有重要的生理生化功能。虽然土壤中铁的总含量非常丰富，但是土壤中铁的有效含量很低，特别是中性和石灰性土壤中，多以三价阳离子形式存在，溶解度极低，难以被植物吸收利用。缺铁会导致农作物叶绿素合成减少，光合速率降低，生物量下降，进而会引起动物和人类对铁的摄取不足。目前对于植物缺铁症的治理也仍是以化学肥料作为主要手段。利用微生物来增强植物应对缺铁胁迫的能力，已成为一种急需的新型生物治理技术。目前关于内生菌加强植物对缺铁胁迫的耐受性的报道还很少，仅有Streptomycessp. GMKU 3100被报道指出，因其产生的铁载体，在缺铁环境中能够帮助植物维持正常的生长。不同于该报告采取的放线菌孢子悬液对水稻幼苗的根部进行浸泡的处理方法，本发明方法是将内生防线菌的孢子悬液对水稻种子进行包埋处理，这种处理手段有利于水稻从种子萌发时期就与内生菌相互接触，使水稻从种子萌发开始就能够接收到内生菌对其生长的有利影响。

发明内容

为了解决现有技术中存在的水稻生产需求，本发明提供了一种促进水稻生长和促进水稻铁缺乏环境下铁元素吸收的方法，本发明采用如下技术方案：

本发明方法使用的是一株水稻内生放线菌Streptomycessp. OsiSh-2,其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC No.8716。

本发明提供一种促进水稻生长或/和促进水稻铁缺乏环境下铁元素吸收的方法，该方法采用上述的水稻内生放线菌Streptomycessp. OsiSh-2，在水稻叶表面喷施其孢子悬浮液或以其孢子悬浮液包埋消毒后的水稻种子。

所述的方法，所述孢子悬浮液的浓度为1×10⁷~1×10⁹CFU/mL，优选浓度为1×10⁸CFU/mL。

上述的方法，所述方法是促进水稻生长的方法，该方法在水稻叶表面喷施水稻内生放线菌Streptomycessp. OsiSh-2孢子悬浮液或以水稻内生放线菌Streptomycessp.OsiSh-2孢子悬浮液包埋消毒后的水稻种子，或先以水稻内生放线菌Streptomycessp.OsiSh-2孢子悬浮液包埋消毒后的水稻种子再在水稻叶表面喷施水稻内生放线菌Streptomycessp. OsiSh-2孢子悬浮液。

所述的方法，（1）在水稻叶表面喷施孢子悬浮液，其中添加0.2%（v/v）的Tween 20作为表面活性剂，使用剂量以满足整株水稻叶面均接触有孢子悬浮液为准，一般对于处于三叶期水稻，为5mL/株水稻；（2）以孢子悬浮液包埋消毒后的水稻种子，使用比例为种子/0.3%（v/v）黄原胶/孢子液=1g / 463 μl / 51 μl。

上述的方法，所述方法是促进水稻铁缺乏环境下铁元素吸收的方法，该方法以孢子悬浮液包埋消毒后的水稻种子，优选地，孢子悬浮液使用比例为种子/0.3%（v/v）黄原胶/孢子液=1g / 463 μl / 51 μl。

本发明将所用的内生放线菌Streptomycessp. OsiSh-2制备成其孢子悬浮液，方法具体如下：

（1）将菌株接种到ISP-2固体培养基上，于30 ℃恒温培养箱中静置培养14天。

（2）用接种环收集步骤1）中成熟的菌体，将其转移到含有无菌蒸馏水和玻璃珠的三角瓶中，剧烈晃动后过滤，得到孢子悬浮液。

（3）用血球计数板对步骤（2）得到的孢子悬浮液进行计数调整其浓度为1×10⁷~1×10⁹CFU/mL。

本发明利用的浓度为1×10⁸CFU/mL的Streptomycessp. OsiSh-2孢子悬浮液，在正常条件下生长，可以通过两种不同的方式处理水稻达到促生长的目的：

（1）在水稻叶表面喷施孢子悬浮液，其中添加0.2%（v/v）的Tween 20作为表面活性剂提高在水稻上的附着能力，使用剂量以满足整株水稻叶面均接触有孢子悬浮液为准，如对于处于三叶期水稻，为5mL/株水稻;

（2）以孢子悬浮液包埋消毒后的水稻种子，使用比例为种子/0.3%（v/v）黄原胶/孢子液=1g / 463 μl / 51 μl。

在缺铁条件下生长，可以通过一种方式处理水稻达到促进铁元素吸收的目的：以孢子悬浮液包埋消毒后的水稻种子，使用比例为种子/0.3%（v/v）黄原胶/孢子液=1g / 463μl / 51 μl。

与现有促进水稻生长和促进水稻在缺铁胁迫环境中吸收铁元素的方法对比，本发明具有以下明显优点：

1.水稻内生放线菌Streptomycessp. OsiSh-2可以产生丰富的活性物质，如铁载体和植物生长调节物质，可以有效促进水稻生长发育，使水稻稳产、高产；利用自身分泌铁还原酶、酚类物质和铁载体可以促进植物吸收环境中难以利用得到的铁元素，提高植株中的铁含量，增加水稻的营养价值。

2.该方法为在水稻还处于种子时期就将内生菌包埋水稻种子，或者在幼苗期就可对水稻进行喷施，水稻内生菌的外源施用在与宿主重新建立共生关系时不会引起水稻疾病发生，保证从水稻生长初期就能发挥其促生长和促进铁元素吸收的功能。

3.水稻内生菌分离自水稻体内，相较化学肥料对于环境更加安全，不会影响农业生态环境和人类身体健康。

4.水稻内生菌的处理更加方便简洁和多样化，相较于其他的土地治理方法而言，既省时又省事，同时也不受地域和人力的限制，适合广泛推广。

附图说明

图1：正常生长环境下叶面喷施Streptomycessp. OsiSh-2 孢子悬浮液后水稻的生长情况；

图2：正常情况下用Streptomycessp. OsiSh-2孢子悬浮液包埋的水稻的生长情况；

图3：缺铁胁迫环境下用Streptomycessp. OsiSh-2孢子悬浮液包埋的水稻生长情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：正常情况下，叶面喷施Streptomycessp. OsiSh-2，促进水稻生长

实验场地：温室土培

试验作物：水稻（籼稻93-11）。

实验处理组：制备Streptomycessp. OsiSh-2的孢子悬浮液，浓度为1×10⁸CFUmL^-1，加入0.2% Tween 20进行处理；以含0.2% Tween 20的水作为对照。制备孢子悬浮液的具体方法如下：

每个盆中种植四株长势相似的水稻苗，每个处理三个重复。待水稻长到分蘖期，于傍晚喷施处理水稻，连续喷施两天，使用总剂量为5mL/株水稻。至喷施孢子悬浮液一个月之后检测植物的农艺性状。

试验结果请见表1：在水稻叶面喷施了Streptomycessp. OsiSh-2的孢子悬浮液，可以显著提高水稻的生长状况。相较于对照，水稻株高，分蘖数，净光合速率和叶绿素含量分别提高了12.6%、25.1%、18.5%和23.5%（请参见图1）。

表1

	株高/cm	分蘖数/个	净光合速率	叶绿素含量/SPAD
					Control	59.91±0.306	7.86±0.340	15.77±0.294	33.53±0.273
OsiSh-2	67.46±0.838**	9.71±0.454**	19.73±0.414**	39.73±0.186**

表中** P≤0.01为显著性水平，下同。

实施例2：正常情况下，Streptomycessp. OsiSh-2包埋水稻种子，促进水稻生长

实验条件：水稻在温室恒温光照培养箱中水培种植，光周期为16小时光照/8小时黑暗，培养温度为28-30℃，空气湿度为60-70%

试验作物：水稻（籼稻93-11）。

实验处理组：依照实施例1的方法制备Streptomycessp. OsiSh-2的孢子悬浮液，浓度为1×10⁸ CFU mL^-1，以水稻种子/0.3%（v/v）黄原胶/孢子悬浮液的比例为1g / 463 μl/ 51 μl 对消完毒的水稻种子进行包埋处理，以水稻种子/0.3%（v/v）黄原胶/无菌水的比例为1g / 463 μl / 51 μl，作为对照。每个处理重复三遍，每组包含48株水稻苗。催芽后种植三周观察水稻的生长状况，并测量其农艺性状。

试验结果请见表2：水稻种子包埋了本实施例的Streptomycessp. OsiSh-2孢子悬浮液，在正常的条件下进行培养，水稻的株高、根长、地上部分的鲜干重和地下部分鲜干重相对于未包埋处理的水稻分别提高了15.1%、12.7%、50%、35.7%、26.7%和30.8%；水稻的叶绿素含量和光合作用速率也显著提高，分别为15.6%和35.5%，表明该方法达到了促进水稻生长的效果（请参见图2）。

表2

株高/cm

总根长/cm

地上部分鲜重/g

地下部分鲜重/g

地上部分干重/g

地下部分干重/g

叶绿素含量/SPAD

净光合速率

Control

19.24±0.159

67.66±0.618

0.08±0.002

0.14±0.003

0.015±0.0001

0.013±0.0003

32.54±0.672

2.846±0.011

OsiSh-2

22.14±0.276**

76.27±1.425**

0.12±0.003**

0.19±0.002**

0.019±0.0013**

0.017±0.0004**

37.61±0.410**

3.857±0.011**

实施例3：在缺铁情况下，Streptomycessp. OsiSh-2包埋水稻种子，促进水稻生长和铁的吸收

试验作物：水稻（籼稻93-11）。

实验处理组：依照实施例1的方法制备Streptomycessp. OsiSh-2的孢子悬浮液，浓度为1×10⁸ CFU mL^-1，以水稻种子/0.3%（v/v）黄原胶/孢子悬浮液的比例为1g / 463 μl/ 51 μl 对消完毒的水稻种子进行包埋处理，以水稻种子/0.3%（v/v）黄原胶/无菌水的比例为1g / 463 μl / 51 μl，作为对照，每个处理重复三遍，每组包含48株水稻苗子。催芽后在正常情况下种植一周，随后缺铁的水培液培养两周，观察水稻的生长状况，并测量其农艺性状以及水稻不同部位的铁含量。

试验结果见表3和表4：包埋了本实施例的Streptomycessp. OsiSh-2孢子悬浮液的水稻，在缺铁条件下进行培养，有促进水稻生长的作用。其中水稻的株高、根长、地上部分的鲜干重和地下部分鲜干重见表3，分别提高了18.6%、36.7%、37.5%、37.5%、50.0%和25.0%，水稻的叶绿素含量和光合作用（见表3）也都分别显著提高26.1%和92.8%（请参见图3）。水稻的地上部分和地下部分的铁离子含量见表4，均提高显著，分别为26.6%和20.7% 。

表3

株高/cm

总根长/cm

地上部分鲜重/g

地下部分鲜重/g

地上部分干重/g

地下部分干重/g

叶绿素含量/SPAD

净光合速率

Control

16.86±0.302

89.31±2.951

0.08±0.002

0.16±0.003

0.012±0.0003

0.016±0.0003

25.27±0.912

1.39±0.031

OsiSh-2

20.00±0.347**

122.06±1.865**

0.11±0.003**

0.22±0.003**

0.018±0.0030**

0.020±0.0004**

31.86±0.834**

2.68±0.011**

表4

	地上部分铁含量（mg/Kg）	地下部分铁含量（mg/Kg）
			Control	1.90±0.026	8.38±0.117
OsiSh-2	2.91±0.017**	12.72±0.127**

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种促进水稻铁缺乏环境下铁元素吸收以促进水稻生长的方法，其特征在于：所述方法采用一种水稻内生放线菌Streptomycessp. OsiSh-2，以其孢子悬浮液包埋消毒后的水稻种子，以所述内生放线菌来促进铁缺乏环境下水稻对铁元素的吸收，以利于水稻生长发育；所述水稻内生放线菌Streptomycessp.OsiSh-2，其保藏号为CGMCC No. 8716。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述孢子悬浮液的浓度为1×10⁷~1×10⁹CFU/mL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述孢子悬浮液的浓度为1×10⁸ CFU/mL。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：孢子悬浮液使用比例为种子/0.3%（v/v）黄原胶/孢子液=1g / 463 μL/ 51 μL。