CN110511875A - 一种复配生防菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种复配生防菌剂及其制备方法与应用 Download PDF

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CN110511875A CN201910456827.6A CN201910456827A CN110511875A CN 110511875 A CN110511875 A CN 110511875A CN 201910456827 A CN201910456827 A CN 201910456827A CN 110511875 A CN110511875 A CN 110511875A
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Abstract

本发明涉及一种复配生防菌剂及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。为解决单一菌种防效不稳定，抑菌谱范围窄的问题，本发明提供了一种复配生防菌剂，包括一定体积比的哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液，所述哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的活菌数均为106cfu/mL。本发明提供的复配生防菌剂抑菌谱广、拮抗作用强、持效期长、生产成本低、发酵工艺简单，将其应用于农业生物防治方面，可防治灰霉病菌、茎腐病菌、立枯病菌、炭疽病菌、镰刀菌和枯萎病菌等真菌引起的作物病害；其对农作物种子及幼苗具有促生作用，可促进种子萌发、胚根和幼苗生长，还具有防腐保鲜的作用，将其应用于果蔬防腐保鲜能够降低腐烂率和失重。

Description

一种复配生防菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种复配生防菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
目前农业生产上防治灰霉病仍采取以化学防治为主的防治对策。常用杀菌剂主要包括苯丙咪唑类、二甲酰亚胺类、N-苯基氨基甲酸酯类、苯胺基嘧啶类和保护性杀菌剂。这些化学杀菌剂作用机理各不相同，其中苯并咪唑类是通过与番茄灰霉病病菌的微管蛋白相结合，破坏其功能，从而抑制病菌菌丝的分隔和伸长，阻碍细胞的有丝***和形态建成；而二甲酰亚胺类杀菌剂的作用机理当前尚不明确，有报道称它可能是通过干扰病菌的细胞功能、影响膜渗透性使细胞破裂而实现。虽然上述化学机制防治效果可观，但由于灰霉病病菌在遗传上存在异核现象，种群中存在多样性，在药剂自然选择的作用下，易产生抗性菌株，从而导致药剂的使用效果逐步下降，甚至是丧失疗效。因而化学防治虽短期防效明显，但长期施用化学农药必定会使番茄果实品质下降、病原菌产生抗药性、严重污染环境、危及人畜健康，甚至破坏农业生态***。
但当前研究的针对番茄灰霉病的生防菌剂多数是基于单一菌种制成，其在实际的生产应用上经常存在防效不稳定、抑菌谱范围窄等现象。
发明内容
为解决单一菌种防效不稳定，抑菌谱范围窄的问题，本发明提供了一种复配生防菌剂及其制备方法与应用。
本发明的技术方案：
一种复配生防菌剂，包括一定体积比的哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液，所述哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的活菌数均为106cfu/mL。
进一步的，所述哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的体积比为0.5～1.5:1。
一种复配生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、取麸皮、稻糠、麦粒按照一定质量比配制固体发酵培养基，蒸汽压力灭菌；
步骤二、将哈茨木霉发酵种子液或粉红粘帚菌发酵种子液接种于步骤一制备的已灭菌固体发酵培养基中，室温发酵15天，每天保持对固体发酵培养基水平振荡一次；
步骤三、将步骤二完成发酵所得发酵物平铺至无菌托盘中，用无菌滤纸覆盖在发酵物上，每天对托板中的发酵物进行搅拌，持续10天，待托盘中的发酵物完全干燥，对发酵物进行粉碎、过筛得到哈茨木霉菌粉或粉红粘帚菌菌粉，分别取哈茨木霉菌粉或粉红粘帚菌菌粉与无菌水混合配制含有一定活菌数的哈茨木霉菌悬液或粉红粘帚菌菌悬液，按一定体积比将哈茨木霉菌悬液与粉红粘帚菌菌悬液混合即得到复配生防菌剂。
进一步的，步骤一所述麸皮、稻糠、麦粒的质量比为1.67:1:7.23；所述固体发酵培养基的初始含水量为75％；所述蒸汽压力灭菌的温度为121℃，压力为20psig，灭菌时间为30min，重复灭菌3次；步骤二所述哈茨木霉发酵种子液或粉红粘帚菌发酵种子液的接种量为3mL/40g。
进一步的，步骤三所述发酵物粉碎所得菌粉为200目菌粉，所述哈茨木霉菌悬液或粉红粘帚菌菌悬液所含活菌数为106cfu/mL，所述哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的体积比为0.5～1.5:1。
本发明提供的一种复配生防菌剂在农业生物防治方面的应用。
进一步的，包括对灰霉病菌、茎腐病菌、立枯病菌、炭疽病菌、镰刀菌和枯萎病菌的防治。
进一步的，包括在提高农业生物抗病能力方面的应用。
本发明提供的一种复配生防菌剂在农作物种子及幼苗促生方面的应用。
本发明提供的一种复配生防菌剂在水果蔬菜防腐保鲜方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明将哈茨木霉和粉红粘帚菌两种生防真菌相复配，获得一种抑菌谱广、拮抗作用强、持效期长、生产成本低、发酵工艺简单的复合生防菌剂的复配生防菌剂，能够广泛应用于农业生物防治领域，可防治灰霉病菌、茎腐病菌、立枯病菌、炭疽病菌、镰刀菌和枯萎病菌等真菌引起的作物病害。
本发明提供的复配生防菌剂，不但能够有效抑制农作物病原真菌的生长，还能促使植物合成更多的水杨酸，从而增强植物的抗病性，能够从不同防治机理出发，获得更全面高效的防治效果、防治范围更广。
本发明提供的复配生防菌剂对农作物种子及幼苗具有促生作用，可提高种子胚根生长量，提高幼苗株高和茎粗。同时，复配生防菌机还具有防腐保鲜的作用，将其应用于果蔬降低腐烂率和失重。
附图说明
图1为实验例3不同处理方法作用下番茄幼苗的生长情况图片，图中由左至右依次为粉红粘帚菌生防菌剂处理组、哈茨木霉生防菌剂处理组、复配生防菌剂处理组、施倍健处理组和清水处理组；
图2为实验例8先施加生防菌再接种番茄灰霉病处理得到的番茄叶片所含PRO的对比图；
图3为实验例8先接种番茄灰霉病再施加生防菌处理得到的番茄叶片所含PRO的对比图；
图4为实验例8先施加生防菌再接种番茄灰霉病处理得到的番茄叶片所含POD的对比图；
图5为实验例8先接种番茄灰霉病再施加生防菌处理得到的番茄叶片所含POD的对比图；
图6为实验例8先施加生防菌再接种番茄灰霉病处理得到的番茄叶片所含MDA的对比图；
图7为实验例8先接种番茄灰霉病再施加生防菌处理得到的番茄叶片所含MDA的对比图；
图8为实验例8先施加生防菌再接种番茄灰霉病处理得到的番茄叶片所含APX的对比图；
图9为实验例8先接种番茄灰霉病再施加生防菌处理得到的番茄叶片所含APX的对比图；
图10为实验例8先施加生防菌再接种番茄灰霉病处理得到的番茄叶片所含SOD的对比图；
图11为实验例8先接种番茄灰霉病再施加生防菌处理得到的番茄叶片所含SOD的对比图；
图12为实验例9不同处理方法作用下番茄幼苗水杨酸含量的对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
本实施例提供了一种复配生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、取麸皮、稻糠、麦粒按照一定质量比配制固体发酵培养基，蒸汽压力灭菌；
步骤二、将哈茨木霉发酵种子液或粉红粘帚菌发酵种子液接种于步骤一制备的已灭菌固体发酵培养基中，室温发酵15天，每天保持对固体发酵培养基水平振荡一次；
步骤三、将步骤二完成发酵所得发酵物平铺至无菌托盘中，用无菌滤纸覆盖在发酵物上，每天对托板中的发酵物进行搅拌，持续10天，待托盘中的发酵物完全干燥，对发酵物进行粉碎、过筛得到哈茨木霉菌粉或粉红粘帚菌菌粉，分别取哈茨木霉菌粉或粉红粘帚菌菌粉与无菌水混合配制含有一定活菌数的哈茨木霉菌悬液或粉红粘帚菌菌悬液，按一定体积比将哈茨木霉菌悬液与粉红粘帚菌菌悬液混合即得到复配生防菌剂。
本发明使用的哈茨木霉来自东北农业大学番茄实验室，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCCNo.12165；本发明使用的粉红粘帚菌来自东北农业大学番茄实验室，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCCNo.1977。
实施例2
本实施例提供了一种复配生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、取麸皮、稻糠、麦粒按照质量比为1.67:1:7.23配制固体发酵培养基40g，将其置于组培瓶内，并摇匀；向组培瓶中加水使培养基初始含水量为75％，用两层封瓶膜封口，室温下静置1h，使发酵原料充分吸水，然后将组培瓶放入121℃、20psig蒸汽压力锅中灭菌30min，待压力锅压力降至为零时开锅取出，水平摇动避免结块，再置于室温晾凉，最后按前述方法重复灭菌3次；
步骤二、将哈茨木霉发酵种子液或粉红粘帚菌发酵种子液接种于步骤一制备的已灭菌固体发酵培养基中，接种量为3mL/40g，种子液接种后立即用封口膜封口，室温发酵15天，每天保持对固体发酵培养基水平振荡一次，水平反复震荡，勿将培养基震荡到瓶口；
步骤三、发酵15天后开瓶，将步骤二完成发酵所得发酵物平铺至无菌托盘中，用无菌滤纸覆盖在发酵物上，每天对托板中的发酵物进行搅拌，保证底物干燥均匀彻底，持续10天，待托盘中的发酵物完全干燥，对发酵物进行粉碎、过200目筛得到哈茨木霉菌粉或粉红粘帚菌菌粉，分别取哈茨木霉菌粉或粉红粘帚菌菌粉与无菌水混合配制所含活菌数为106cfu/mL的哈茨木霉菌悬液或粉红粘帚菌菌悬液，按体积比为0.5～1.5:1将哈茨木霉菌悬液与粉红粘帚菌菌悬液混合即得到复配生防菌剂。
实施例3
本实施例提供了一种复配生防菌剂，包括一定体积比的哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液，其中哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的活菌数均为106cfu/mL。
实施例4
本实施例提供了一种复配生防菌剂，包括体积比为0.5～1.5:1的哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液，其中哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的活菌数均为106cfu/mL。
实施例5
本实施例提供了一种复配生防菌剂，包括体积比为0.5:1的哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液，其中哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的活菌数均为106cfu/mL。
实施例6
本实施例提供了一种复配生防菌剂，包括体积比为0.67:1的哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液，其中哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的活菌数均为106cfu/mL。
实施例7
本实施例提供了一种复配生防菌剂，包括体积比为1:1的哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液，其中哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的活菌数均为106cfu/mL。
实施例8
本实施例提供了一种复配生防菌剂，包括体积比为1.5:1的哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液，其中哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的活菌数均为106cfu/mL。
对比例1
本对比例提供了一种单一粉红粘帚菌生防菌剂，由活菌数为106cfu/mL的粉红粘帚菌菌悬液制成。
对比例2
本对比例提供了一种单一哈茨木霉生防菌剂，由活菌数为106cfu/mL的哈茨木霉菌悬液制成。
实验例1：生防菌剂的真菌抑菌谱
供试菌株及来源见表1：
表1
菌株 拉丁文名称 宿主
番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea 番茄
玉米茎基腐病菌 Fusarium bulbigenum var.lycopersici 番茄
水稻立枯病菌 Fusarium oxysporum f.sp.niveum 西瓜
黄瓜炭疽病菌 Fusarium oxysporium Schelcht 水稻
轮枝镰刀菌 Fusarium verticillioides 玉米
尖孢镰刀菌 Colletotrichum lagenarium 黄瓜
西瓜枯萎病菌 Fusarium sp. 玉米
番茄枯萎病菌 Fusarium oxysporum 茄子
黄瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum 黄瓜
甜瓜枯萎病菌 Fusariumoxysporum(Schl.)f.Sp.melonis(LeachetCurrenee)SnyderetHansen 甜瓜
试验方法：将保存于4℃冰箱的病原菌平面取出，挑取少量菌丝接种于新鲜的PDA培养基中传代两次，至于28℃恒温培养箱培养，使病原菌活化。在新的PDA培养基的平板中心接种病原菌饼，两端接种生防菌菌饼，菌饼直径8mm，3次重复，将只接种病原菌菌饼的PDA平板设置为对照组，在28℃恒温培养箱中培养，分别计算第十天实施例6提供的复配生防菌剂、对比例1粉红粘帚菌生防菌剂和对比例2提供的哈茨木霉生防菌剂的抑菌率，结果见表2。
表2
由表2数据可知，复配后的生防菌剂的抑菌效果显著优于单一生防菌剂的抑菌效果。
实验例2：不同处理对番茄种子萌发的促进作用
用实施例6提供的复配生防菌剂、对比例1粉红粘帚菌生防菌剂、对比例2提供的哈茨木霉生防菌剂、施倍健和清水分别浸泡番茄种子，每个处理分别放入200粒番茄种子，浸种3h后取出，放在无菌培养皿中，每皿50粒。统计2-5d种子萌发率，结果见表3。
表3
由表3数据可知，2d时，哈茨木霉、粉红粘帚菌、复配生防菌剂、施倍健各处理组间无显著差异，但均高于清水处理组。3d时，施倍健与清水无显著差异分别为76.67％及65.67％，其中哈茨木霉处理组的发芽率为72％比清水处理组的发芽率高9.63％，粉红粘帚菌处理组的发芽率为71.33％比清水处理组高8.62％，复配生防菌剂处理组的发芽率最高为76.67％比清水处理组的发芽率高16.74％。4d时哈茨木霉、粉红粘帚菌及施倍健处理组的发芽率无显著差异，分别为80.33％、82％及78.33％，同清水处理组的番茄种子发芽率相比分别高10.04％、12.33％及7.31％，复配生防菌剂处理组的番茄种子发芽率最高为83.67％比清水高21.46％。5d时，哈茨木霉、粉红粘帚菌、复配生防菌剂、施倍健处理组无显著差异分别为87.33％、88％、91.33％及87％分别比清水处理组高6.5％、7.3％、11.4％及6.1％。
通过统计2-5d番茄种子萌发率发现哈茨木霉及粉红粘帚菌均能够在一定程度上促进番茄种子萌发，并且将其复配在一起处理番茄种子，其促进番茄种子萌发的效用更为明显。
实验例3：不同处理对番茄幼苗生长的促进作用
用实施例6提供的复配生防菌剂、对比例1粉红粘帚菌生防菌剂、对比例2提供的哈茨木霉生防菌剂、施倍健和清水灌根处理2叶一心番茄幼苗，每钵20mL。将处理完成后的2叶一心番茄幼苗置于温室中常规管理，长至4-5叶期时，测定株高、茎粗和主根长，每个处理20株苗。3次重复，结果见表4和图1。
表4
处理 株高/cm 茎粗/mm 主根长/cm
哈茨木霉 21.37±0.27b 3.66±0.16b 7.71±0.41b
粉红粘帚菌 20.19±0.58b 3.67±0.02b 8.61±0.19c
复配菌剂 27.84±0.38a 4.45±0.12a 10.18±0.23a
施倍健 17.09±0.64c 3.49±0.06bc 6.91±0.47d
清水 12.71±0.42d 3.24±0.02c 6.59±0.48e
由表4和图1可知，哈茨木霉处理组在株高、茎粗及主根长方面分别高于清水对照组38.15％、13.06％及17.05％。粉红粘帚菌处理组高于清水对照组32.94％、13.17％及30.70％，并且在株高及茎粗方面哈茨木霉和粉红粘帚菌处理组无显著差异。复配生防菌剂处理组效果最显著，复配生防菌剂处理组的株高、茎粗及主根长分别为37.84cm、4.45mm及10.18cm，分别高于清水对照组66.61％、37.35％及54.48％。施倍健处理组对番茄幼苗也有一定的促生作用，但相较于生防菌处理组弱，其株高、茎粗及主根长分别高于对照19.27％、7.72％及4.91％。
实验例4：不同处理对番茄幼苗起防效作用时对番茄幼苗株高的影响
取2叶一心番茄幼苗置于温室中常规管理，用实施例6提供的复配生防菌剂、对比例1粉红粘帚菌生防菌剂、对比例2提供的哈茨木霉生防菌剂和施倍健灌根处理2叶一心番茄幼苗，每钵20mL。以无菌水为对照，并于24h后接种番茄灰霉病。测定各处理株高。每个处理20株苗。3次重复，结果如表5所示。
表5
处理 株高/cm 茎粗/mm 主根长/cm
哈茨木霉 21.44±0.12c 2.88±0.04c 6.62±0.23c
粉红粘帚菌 21.50±0.08c 2.87±0.02c 6.67±0.23c
复配菌剂 27.91±0.34a 3.44±0.06a 11.29±0.12a
施倍健 23.86±1.17b 3.05±0.07b 7.11±0.92b
由表5可以看出，复配生防菌剂的番茄幼苗长势最好且明显优于其他各组，其株高、茎粗及主根长分别为27.91cm、3.44mm及11.29cm。
实验例5：不同处理对番茄幼苗起防效作用时番茄幼苗的病情指数
将浸种催芽后的番茄种子播种到育苗盘中，浇足水分，培养15d后，分苗移栽到营养钵中，30d后进行温室防效试验。实验设计如下：
(1)病菌处理组：番茄灰霉病病原菌孢子稀释液喷洒番茄叶片。
(2)先接生防菌后接病原菌处理组：先将实施例6提供的复配生防菌剂、对比例1粉红粘帚菌生防菌剂、对比例2提供的哈茨木霉生防菌剂和施倍健，灌根处理每钵20mL，以无菌水为对照，并于24h后接种番茄灰霉病。
经过各种处理后，25℃保湿培养，第20d观察番茄植株的发病情况。依照番茄灰霉病分级标准调查叶片受害级别，统计并计算病情指数和防治效果。按照如下公式计算，结果如表6所示。
番茄灰霉病分级标准：
按单叶片病斑个数和占叶面积的比例进行番茄灰霉病分级：0级，无病斑；1级，单叶片有病斑3个；3级，单叶片有病斑4～6个；5级，单叶片有病斑7～10个；7级，单叶片有病斑11～20个，部分密集成片；9级，单叶片有密集病斑，占叶面积1/4以上。
表6
处理 发病率/％ 病情指数 防效/％
哈茨木霉 12.57±0.39d 8.70±0.19c 84.02±0.78b
粉红粘帚菌 13.47±0.27c 8.72±0.28c 85.09±0.68b
施倍健 20.42±0.23b 10.91±0.57b 74.59±0.60c
复配菌剂 9.37±0.07e 6.30±0.77d 92.33±0.85a
对照 72.62±0.51a 43.71±0.52a <sub>_</sub>
由表6可以看出，清水对照组的发病率最高为72.62％，病情指数为43.71％。其它各处理中复配生防菌剂处理的番茄幼苗发病率及病情指数最低，分别是9.37％和6.3％，比清水对照分别减少了87.09％及85.59％。施倍健处理组效果优于粉红粘帚菌处理组优于哈茨木霉处理组。施倍健处理组的防效为74.59％，粉红粘帚菌处理组的防效为85.09％，哈茨木霉处理组的防效为84.02％。由此可知，复配生防菌剂的对番茄灰霉病的防效最好。
实验例6：先施加病原菌灰霉后施加生防菌对番茄幼苗生长的的影响
取2叶一心番茄幼苗置于温室中常规管理，接种番茄灰霉病24h后，用实施例6提供的复配生防菌剂、对比例1粉红粘帚菌生防菌剂、对比例2提供的哈茨木霉生防菌剂和施倍健灌根处理2叶一心番茄幼苗，每钵20mL。以无菌水为对照，测定各处理株高。每个处理20株苗。3次重复，结果见表7。
表7
处理 株高/cm 茎粗/mm 主根长/cm
哈茨木霉 25.29±0.42b 2.48±0.04c 8.37±0.19b
粉红粘帚菌 23.51±0.21c 2.59±0.04b 7.88±0.46c
复配菌剂 33.39±0.11a 2.94±0.03a 10.27±0.85a
施倍健 15.45±0.11d 1.93±0.06d 6.32±0.12d
由表7可以看出，复配菌剂处理组的长势最好且明显优于其他各组，其株高、茎粗及主根长分别为33.39cm、2.94mm及34.27cm。
实验例7：先施加病原菌灰霉后施加生防菌对番茄幼苗病情指数的影响
将浸种催芽后的番茄种子播种到育苗盘中，浇足水分，培养15d后，分苗移栽到营养钵中，30d后进行温室疗效试验。实验设计如下：
(1)病菌处理组：番茄灰霉病病原菌孢子稀释液喷洒番茄叶片。
(2)先接病原菌后接生防菌处理组：先接种番茄灰霉病并于24h后，用实施例6提供的复配生防菌剂、对比例1粉红粘帚菌生防菌剂、对比例2提供的哈茨木霉生防菌剂和施倍健，灌根处理，每钵20mL，以无菌水为对照，
经过各种处理后，25℃保湿培养，第20d观察番茄植株的发病情况。依照番茄灰霉病分级标准调查叶片受害级别，统计并计算病情指数和防治效果。按照如下公式计算，结果见表8。
表8
处理 发病率/％ 病情指数 防效/％
哈茨木霉 18.47±0.10d 10.33±0.09c 70.73±0.69b
粉红粘帚菌 21.66±1.31c 10.17±0.07c 70.83±2.65b
施倍健 24.42±0.14b 12.82±0.32b 66.37±2.65c
复配菌剂 15.73±0.47e 7.03±0.54d 79.93±0.44a
对照 72.62±0.51a 43.71±0.52a _
由表8可知，在番茄灰霉病的治疗试验中，清水对照组的发病率最高为72.62％，病情指数为43.71％。其它各处理中复配菌剂处理的番茄幼苗防病率及病情指数最低分别是15.73％和7.03％，比清水对照分别减少了78.2％及83.91％。对番茄灰霉病的治疗效果粉红粘帚菌处理组及哈茨木霉处理组防效优于施倍健处理组。粉红粘帚菌处理组的防效为70.83％，哈茨木霉处理组的防效为70.73％，施倍健处理组的防效为66.37％。
实验例8：不同复配生防菌剂施加方法对番茄幼苗抗病相关酶活性的影响
将浸种催芽后的番茄种子播种到育苗盘中，浇足水分，培养15d后，分苗移栽到营养钵中，30d后进行温室疗效试验。实验设计如下：
(1)先将实施例6提供的复配生防菌剂、对比例1粉红粘帚菌生防菌剂、对比例2提供的哈茨木霉生防菌剂和施倍健，灌根处理2叶一心番茄幼苗，每钵20mL，以无菌水为对照，并于24h后接种番茄灰霉病；
(2)先接种番茄灰霉病并于24h后，再用实施例6提供的复配生防菌剂、对比例1粉红粘帚菌生防菌剂、对比例2提供的哈茨木霉生防菌剂和施倍健，灌根处理，每钵20mL；将上述两种处理完成后的2叶一心番茄幼苗置于温室中常规管理，25℃保湿培养，分别称取培养时间为1-5天各处理组番茄叶片测定脯氨酸-PRO、过氧化物酶-POD、丙二醛-MDA、抗坏血酸过氧化物酶-APX和超氧化物歧化酶-SOD，结果如图2-11所示。
图2为先施加生防菌再接种番茄灰霉病处理得到的番茄叶片所含PRO的对比图；
图3为先接种番茄灰霉病再施加生防菌处理得到的番茄叶片所含PRO的对比图；
由图2可以看出，各处理组均表现为1-4d时变化不明显，在5d时急剧上升，粉红粘帚菌处理组、哈茨木霉处理组、混菌处理组及施倍健处理组的PRO含量分别为59.24μg/g、69.73μg/g、70.71μg/g、53.35μg/g。
由图3可以看出，各处理组的PRO含量均为先上升后下降，可以看出混菌处理组番茄幼苗的PRO含量高于其他各组，在第3天时最高为85.52μg/g。哈茨木霉处理组次之，在第4天时其处理的番茄幼苗PRO含量最高为78.45μg/g。粉红粘帚菌处理组和施倍健处理组对番茄幼苗脯氨酸(PRO)含量的影响无明显差别。
图4为先施加生防菌再接种番茄灰霉病处理得到的番茄叶片所含POD的对比图；
图5为先接种番茄灰霉病再施加生防菌处理得到的番茄叶片所含POD的对比图；
由图4可以看出，粉红粘帚菌处理组处理的番茄幼苗POD含量呈现先下降后上升在下降的趋势，在3d时达到最大32.48U/mgprot。哈茨木霉处理组处理的番茄幼苗的POD含量为先下降后上升在下降在上升最后下降的趋势，在3d时达到最大值为32.67U/mgprot。混菌处理组处理的番茄幼苗POD含量表现为先上升后下降在2d时最高为37.39U/mgprot。施倍健处理组处理的番茄幼苗POD含量先上升后下降的趋势，在第3d时最大，但也低于其他各组。
由图5可以看出，粉红粘帚菌、哈茨木霉和混菌处理组均在第一天POD含量最高分别为30.99U/mgprot、31.67U/mgprot、32.04U/mgprot，施倍健处理组在第二天时POD含量最高为26.24U/mgprot。
图6为先施加生防菌再接种番茄灰霉病处理得到的番茄叶片所含MDA的对比图；
图7为先接种番茄灰霉病再施加生防菌处理得到的番茄叶片所含MDA的对比图；
由图6可以看出，粉红粘帚菌处理组处理的番茄幼苗1d、2d、3d、4d、6d、8d其MDA含量分别为1.75nmol/mgprot、2.20nmol/mgprot、1.85nmol/mgprot、1.76nmol/mgprot、1.68nmol/mgprot、1.88nmol/mgprot。哈茨木霉处理组处理的番茄幼苗1d、2d、3d、4d、6d、8d其MDA含量分别为1.77nmol/mgprot、2.38nmol/mgprot、1.94nmol/mgprot、1.92nmol/mgprot、2.06nmol/mgprot、2.04nmol/mgprot。混菌处理组处理的番茄幼苗1d、2d、3d、4d、6d、8d其MDA含量分别为1.73nmol/mgprot、2.16nmol/mgprot、1.92nmol/mgprot、1.86nmol/mgprot、1.75nmol/mgprot、1.82nmol/mgprot。施倍健处理组处理的番茄幼苗1d、2d、3d、4d、6d、8d其MDA含量分别为1.92nmol/mgprot、1.91nmol/mgprot、2.32nmol/mgprot、1.89nmol/mgprot、1.97nmol/mgprot、1.77nmol/mgprot。各处理组整体均表现出先升高后降低的模式，并且粉红粘帚菌、哈茨木霉、混菌在第二天达到最高点，施倍健在第三天达到最高点，不同生防菌剂对番茄幼苗丙二醛含量的影响差异不显著。
由图7可以看出，各处理组的MDA含量均呈现在1-2d内先急剧上升，后维持在相对较高水平3nmol/mgprot上下，从第4天时开始略有下降。且各处理组MDA含量差别不大。
图8为先施加生防菌再接种番茄灰霉病处理得到的番茄叶片所含APX的对比图；
图9为先接种番茄灰霉病再施加生防菌处理得到的番茄叶片所含APX的对比图；
由图8可以看出，粉红粘帚菌处理组处理的番茄幼苗APX含量先上升后又下降，在2d时最高为0.10U/mgprot。哈茨木霉处理组处理的番茄幼苗APX含量先下降后略有上升，1-2d时最高为0.11U/mgprot。混菌处理组处理的番茄幼苗APX含量先上升后下降在上升的趋势，2d时最高为0.15U/mgpro。施倍健处理组处理的番茄幼苗其APX含量先下降后略有上升，1d时最高为0.09U/mgprot。并且混菌处理组显著优于其他各组。
由图9可以看出，各处理组均呈现在1-3天为吃在较高水平，第4天时快速下降，第6天时有有所回升。其中混菌处理组番茄幼苗的抗坏血酸过氧化物酶含量平均高于其他各组。含量分别为0.12U/mgprot、0.11U/mgprot、0.11U/mgprot、0.05U/mgprot、0.04U/mgprot、0.07U/mgprot。
图10为先施加生防菌再接种番茄灰霉病处理得到的番茄叶片所含SOD的对比图；
图11为先接种番茄灰霉病在施加生防菌处理得到的番茄叶片所含SOD的对比图；
由图10可以看出，各处理组的SOD含量变化趋势不大。但从图中可以看出混菌处理组番茄幼苗SOD平均含量高于粉红粘帚菌处理组高于哈茨木霉处理组高于施倍健处理组，混菌处理组的SOD含量在第2天时最高为208.00U/mgprot。
由图11可以看出，各处理组番茄幼苗的SOD含量均呈现先上升后下降的趋势。其中混菌处理组的SOD含量略高于其他各组，最高时为206.28U/mgprot。哈茨木霉处理组番茄幼苗的SOD变化不显著。施倍健处理组番茄幼苗平均SOD含量最低。
结合以上保护酶系活性的综合分析，得知从侵染后保护酶的反应时间来看，接种番茄灰霉病菌后再用复配生防菌的番茄叶片要先于只接种番茄灰霉菌植株；从侵染后保护酶的变化幅度来看，接种番茄灰霉病菌后再用生防真菌诱导的番茄叶片也要大于只接种番茄灰霉菌的叶片，说明用生防菌的诱抗作用远大于病原菌接种所引起的抗性反应。番茄叶片在遇到灰霉菌的侵染时，做出相应的一些固有的应急反应，使体内保护酶系活性升高，来抵抗病原菌的侵染，但这种响应在时间上持续的时间短，强度上也不大，所以抗病的效果不佳；而用生防菌诱导的番茄叶片，诱导了植物体本身的一系列反应，促使保护酶系活性增长的趋势延长，幅度有所增大，可以增强植物体对病原菌的侵染能力，该处理并不是两种作用的简单叠加，其处理后的酶活性值，升高幅度大，作用时间长，既是后期下降也比较平缓，幅度不大，且均是植物非寄主抗性的关键酶，因此，粉红粘帚菌及哈茨木霉可能诱导了番茄对灰霉菌的非寄主抗性。而且，由于复配组合中各菌株间的相互作用使它们的防治效果得到了显著提高。
实验例9：不同复配生防菌剂施加方法对番茄幼苗水杨酸-SA含量的影响
取一号处理(清水)、二号处理(先用20mL哈茨木霉和粉红粘帚菌最优配比菌液即3：2灌根处理番茄幼苗，并在24小时后喷施10mL孢子数为106cfu/mL的番茄灰霉病稀释液)、三号处理(先喷施喷施10mL孢子数为106cfu/mL的番茄灰霉病稀释液，24小时后用20mL哈茨木霉和粉红粘帚菌最优配比菌液即3：2灌根处理番茄幼苗)、四号处理(用20mL哈茨木霉和粉红粘帚菌最优配比菌液即3：2灌根处理番茄幼苗，10mL哈茨木霉和粉红粘帚菌最优配比菌液即3：2喷施处理番茄幼苗)、五号处理(喷施喷施10mL孢子数为106cfu/mL的番茄灰霉病稀释液，在用20mL孢子数为106cfu/mL的番茄灰霉病稀释液灌根处理番茄幼苗)的番茄叶片各0.5g，液氮研磨，每隔一周各样品水杨酸含量变化情况，结果如图12所示。
图12为实验例9不同处理方法作用下番茄幼苗水杨酸含量的对比图；由图12可以看出，一号处理组即清水处理组的水杨酸含量变化差异不大，为27.43μg/g左右。二号处理组水杨酸含量呈现先下降后上升的趋势，并且在第四周时含量最高为35.04μg/g。三号处理组与四号处理组水杨酸含量变化呈现先上升后下降在上升的趋势，并且在第四周时含量最高，且三号处理组略高于四号处理组。五号处理组的水杨酸含量呈现下降趋势，刚处理时其水杨酸含量最高为37.72μg/g，第四周时其水杨酸含量最低为9.91μg/g。
由本实施例的分析可以看出，混菌处理组的SA含量略高于清水处理组，并且在防病及治病处理组中其水杨酸含量均有所上升，说明粉红粘帚菌与哈茨木霉混合菌剂的施加，有助于提高水杨酸的含量。而水杨酸含量的提高能更大可能诱导番茄产生抗病性，进而说明粉红粘帚菌与哈茨木霉复配菌剂的使用有助于提高番茄的抗病性。
实验例10、复配生防菌剂对番茄果实品质的保鲜防腐作用
1、腐烂率
选取新鲜且无损伤和病害的市售小番茄用于试验。将番茄果实用无菌水清洗后自然晾干，每组取30个称重，放入实施例6提供的复配生防菌剂、对比例1粉红粘帚菌生防菌剂、对比例2提供的哈茨木霉生防菌剂，置于无菌袋中并于室温下进行贮藏。以21d为贮藏周期，每隔3d对番茄果实的腐烂情况进行调查并记录。腐烂率按照以下公式计算：
清水处理组果实腐烂率最高为77.33％，而粉红粘帚菌单独处理组的腐烂率为55％，哈茨木霉处理组的腐烂率为52.33％，相比于清水处理组果实腐烂率分别降低了28.88％和32.33％，复配生防菌剂处理组的果实腐烂率为38.67％。这说明复配生防菌能显著降低番茄的腐烂率。
2、失重率：
选取新鲜且无损伤和病害的市售小番茄用于试验。将番茄果实用无菌水清洗后自然晾干，每组取30个称重，放入实施例6提供的复配生防菌剂、对比例1粉红粘帚菌生防菌剂、对比例2提供的哈茨木霉生防菌剂，每隔3d对番茄果实的质量进行称重并记录。失重率按照以下公式计算：
随着贮藏时间增长失重率呈现上升趋势，无论是单独处理还是不同比例的生防菌混配处理番茄果实，其果实的失重率均显著低于水处理组，水处理组的失重率为15.12％，粉红粘帚菌单独处理组和哈茨木霉单独处理组的果实失重率分别为10.24％及11.23％，同清水处理组相比分别下降了32.27％和25.72％；复配生防菌处理组失重率为9.48％，同清水处理组相比均下降了35％以上。
3、番茄果实硬度
选取新鲜且无损伤和病害的市售小番茄用于试验。将番茄果实用无菌水清洗后自然晾干，每组取30个称重，放入实施例6提供的复配生防菌剂、对比例1粉红粘帚菌生防菌剂、对比例2提供的哈茨木霉生防菌剂，置于无菌袋中并于室温下进行贮藏。以21d为贮藏周期，贮藏结束后，取番茄果实最大直径处削去果皮，用无菌水调零的GY-4果实硬度计测试过时的硬度并记录数据。多次取样测试，计算平均值。
培养21天时各处理组硬度下降率无显著差别，复配生防菌处理组、粉红粘帚菌处理组和哈茨木霉处理组的硬度下降率分别是9.05％、9.35％、9.25％。
4、番茄果实甜度
贮藏结束后，取番茄果实用榨汁器进行榨汁，之后用无菌水把手持折光仪调零，取番茄汁2-3滴于折光平面，记录读数。多次取样测试，计算平均值。
处理21天时，无论是单独处理还是不同比例的生防菌混配处理番茄果实，其果实的甜度下降率均显著低于水处理组，清水处理组的糖下降率最大为62.67％，粉红粘帚菌单独处理组和哈茨木霉单独处理组的果实甜度下降率分别为22.08％及26.06％，同清水处理组相比分别下降了58.84％；复配生防菌处理组表现最好，在21天时其甜度下降率为13.46％，同清水处理组相比均下降了70％以上。

Claims (10)

1.一种复配生防菌剂，其特征在于，包括一定体积比的哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液，所述哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的活菌数均为106cfu/mL。
2.根据权利要求1所述一种复配生防菌剂，其特征在于，所述哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的体积比为0.5～1.5:1。
3.一种复配生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、取麸皮、稻糠、麦粒按照一定质量比配制固体发酵培养基，蒸汽压力灭菌；
步骤二、将哈茨木霉发酵种子液或粉红粘帚菌发酵种子液接种于步骤一制备的已灭菌固体发酵培养基中，室温发酵15天，每天保持对固体发酵培养基水平振荡一次；
步骤三、将步骤二完成发酵所得发酵物平铺至无菌托盘中，用无菌滤纸覆盖在发酵物上，每天对托板中的发酵物进行搅拌，持续10天，待托盘中的发酵物完全干燥，对发酵物进行粉碎、过筛得到哈茨木霉菌粉或粉红粘帚菌菌粉，分别取哈茨木霉菌粉或粉红粘帚菌菌粉与无菌水混合配制含有一定活菌数的哈茨木霉菌悬液或粉红粘帚菌菌悬液，按一定体积比将哈茨木霉菌悬液与粉红粘帚菌菌悬液混合即得到复配生防菌剂。
4.根据权利要求3所述一种复配生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤一所述麸皮、稻糠、麦粒的质量比为1.67:1:7.23；所述固体发酵培养基的初始含水量为75％；所述蒸汽压力灭菌的温度为121℃，压力为20psig，灭菌时间为30min，重复灭菌3次；步骤二所述哈茨木霉发酵种子液或粉红粘帚菌发酵种子液的接种量为3mL/40g。
5.根据权利要求3或4所述一种复配生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤三所述发酵物粉碎所得菌粉为200目菌粉，所述哈茨木霉菌悬液或粉红粘帚菌菌悬液所含活菌数为106cfu/mL，所述哈茨木霉菌悬液和粉红粘帚菌菌悬液的体积比为0.5～1.5:1。
6.一种如权利要求1或2所述的复配生防菌剂在农业生物防治方面的应用。
7.根据权利要求6所述一种复配生防菌剂在农业生物防治方面的应用，其特征在于，包括对灰霉病菌、茎腐病菌、立枯病菌、炭疽病菌、镰刀菌和枯萎病菌的防治。
8.根据权利要求6或7所述的复配生防菌剂在农业生物防治方面的应用，其特征在于，包括在提高农业生物抗病能力方面的应用。
9.一种如权利要求1或2所述的复配生防菌剂在农作物种子及幼苗促生方面的应用。
10.一种如权利要求1或2所述一种复配生防菌剂在水果蔬菜防腐保鲜方面的应用。
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