CN106883998A - 一种微生物多功能肥的制备方法与发酵培养基组成 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物多功能肥的制备方法与发酵培养基组成，属于微生物肥料制备技术领域，特别涉及一种微生物肥的制备方法。该微生物多功能肥的制备方法包括如下操作步骤：（1）培养基配制；（2）菌种活化；（3）液体种子制备；（4）液态发酵；（5） 拌种肥、叶面肥制备；（6）地面肥制备。发酵培养基组成为：葡萄糖15000g，蛋白胨10000g，酵母膏5000g，KH2PO41300g，K2HPO41000g，MgSO4·7H2O 500g，MnSO4·H2O 100g，FeSO4·7H2O 100g，CaC12·2H2O 1500g，加水至1000L，pH 7.0‑7.5。该制备方法操作简单，成本低，制得的微生物肥既能防治植物病害，又能促进植物生长，减少化肥和农药的用量，可有效解决农药污染，土地板结等问题。

Description

一种微生物多功能肥的制备方法与发酵培养基组成
技术领域
本发明涉及微生物肥料制备技术领域，具体涉及一种微生物多功能肥的制备方法与发酵培养基组成。
背景技术
我国人口多，人均耕地面积少，提高农作物产量具有重要意义。土壤施肥是一种常用的增产途径。目前，农业上使用的肥料包括微生物肥料和化学肥料。长期施用化学肥料会造成土壤板结；且当前基于“绿色”、“环保”的健康理念，人们对无污染、安全、卫生的绿色食品的需求日益增加，使得微生物肥料备受青睐。另外，施用微生物肥料可减少化学肥料的施用，改善土壤，提高农产品品质；而且微生物肥料具有长效、无毒、无污染、节约资源、成本低等特点，可弥补化学肥料的缺点和不足。
地面肥是植物吸收营养成分的重要途径，叶面肥是植物吸收营养成分的重要补充。随着植物生长过程中各种病虫害影响的加剧，如果施用既能促进植物生长又能拮抗植物病害的微生物肥料，将有利于植物、作物的增产增收，提高农户经济利益。因此，可以利用研发的优良菌株，进行发酵，获得的发酵产物，制备成地面肥、叶面肥、拌种肥等多功能微生物肥。
发明内容
本发明涉及一种应用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS501a制备微生物肥的方法和发酵生产微生物肥的培养基配方，制得的微生物多功能肥既能防治植物病害，又能促进植物生长，解决了现有技术中存在的问题。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种微生物多功能肥的制备方法，包括如下操作步骤：
（1）培养基配制：分别配制菌种活化培养基、种子培养基和发酵培养基，高温灭菌后备用；
所述菌种活化培养基为：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，加水至1L，pH7.0-7.5；
所述种子培养基为：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，加水至1L，pH7.0-7.5；
所述发酵培养基为：葡萄糖15000g，蛋白胨10000g，酵母膏5000g，KH2PO41300g，K2HPO41000g，MgSO4·7H2O 500g， MnSO4·H2O 100g，FeSO4·7H2O 100g，CaC12·2H2O1500g，加水至1000L，pH 7.0-7.5；
（2）菌种活化：挑取斜面保藏的Bacillus subtilis BS501a接种于步骤（1）制得的菌种活化培养基中，于35-37℃，180-220r/min摇床振荡培养16-24h，得活化枯草芽孢杆菌菌液；
（3）液体种子制备：按5％-10％（体积百分数）的接种量将步骤（2）活化的枯草芽孢杆菌菌液接种于步骤（1）制得的种子培养基中，于35-37℃，通无菌空气培养16-24h，得到液体种子；
（4）液态发酵：按5％-10％（体积百分数）的接种量将步骤（3）制得的液体种子接种于步骤（1）制得的发酵培养基中，于30℃，通无菌空气培养48h，经平板细菌计数，活菌数达1×109 - 9×109 CFU/mL，即得活菌体培养物；
（5）叶面肥和拌种肥制备：将步骤（4）制得的活菌体培养物静置，菌体沉淀。除去菌体，即得微生物叶面肥和拌种肥；
（6）地面肥的制备：将步骤（4）获得的活菌体培养物通风干燥，即获得地面肥。
上述微生物多功能肥的使用方法：拌种使用时，拌种肥用水100倍稀释，拌种使用；叶面喷洒使用时，叶面肥用水100倍稀释，在农作物苗期叶面喷施、果实期喷洒；地面肥于耕种时地面播撒。
本发明的有益效果是：
1、本发明枯草芽孢杆菌兼具促进植物生长和拮抗植物病原菌功能，经其发酵制备所得的微生物多功能肥兼具促进作物生长、防治植物叶面病害和果实病害的双重作用，可减少化肥和农药用量，改善土壤，改善农田环境质量，提高农产品的品质。本发明枯草芽孢杆菌可成功定殖于植物根际、体表或体内，分泌抗菌物质抑制病原菌生长，具有生防效果，对多种植物、农作物病原真菌都有很强的抑制作用；
2、在本发明制备方法中，发酵培养基可提升发酵产物中枯草芽孢杆菌的数量；通过微生物代谢，提高拮抗代谢产物的分泌量，在充分发挥活菌体促植物生长的同时，能保证在植物或作物的整个生长周期内发挥有效的生物杀菌剂作用，增强植物或作物抗病能力。培养基中富含氮、磷、钾，及各种矿物质，可增强土壤肥力，减少土壤施肥量。
具体实施方式
实施例1 正交实验法优化获得发酵培养基
为提高B. subtilis BS501a发酵产物的拮抗能力，采用单因素试验和正交试验优化了发酵培养基组成和发酵条件，得到最佳培养基组成为：葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，KH2PO4 0.13%, K2HPO4 0.1%, MgSO4·7H2O 0.05%, MnSO4·H2O 0.01%, FeSO4·7H2O 0.01%, CaC12·2H2O 0.15%, pH 7.0；最适发酵温度30℃, 最适发酵时间48h。
实施例2 枯草芽孢杆菌BS501a发酵液抗菌谱
采用对峙试验测枯草芽孢杆菌BS501a的抗菌谱。由于植物病原真菌生长速度不同，为准确判断枯草芽孢杆菌BS501a的拮抗活性，采用枯草芽孢杆菌BS501a与植物病原真菌分期或同期培养的方法。对生长速度较快的植物病原真菌，先在新鲜PDA平板上呈对角线接种枯草芽孢杆菌BS501a，26℃培养24h后，在平板中央移入受试真菌菌饼，而后继续培养48h，测量拮抗带宽度。对生长速度中等的植物病原真菌，采用在新鲜 PDA平板中央接种受试真菌菌饼，同时围绕菌饼呈对角线接种枯草芽孢杆菌BS501a菌株，26℃培养72h，测量拮抗带宽度。对生长速度较慢的植物病原真菌，采用在新鲜PDA平板中央接种受试真菌菌饼，26℃培养24h后，在平板上呈对角线接种枯草芽孢杆菌BS501a，继续培养72h，测量拮抗带宽度。结果如表1所示。
表1 枯草芽孢杆菌BS501a抗菌谱
受试真菌 拮抗带宽度/mm
稻瘟病菌 （7.4±0.23）a
黄瓜镰刀菌 （6.98±0.21）a
禾生腐霉 （3.06±0.15）b
西瓜枯萎病菌 （5.25±0.34）c
辣椒枯萎病菌 （4.73±0.30）c
玉米串珠镰孢 （3.50±0.21）d
玉米青枯病菌 （4.25±0.16）cd
小麦根腐病菌 （8.58±0.47）a
玉米小斑病菌 （7.18±0.32）b
小麦赤霉病菌 （5.38±0.36）c
苹果腐烂病菌 （5.00±0.20）c
苹果轮纹病菌 （4.72±0.38）c
黄瓜灰霉病菌 （8.03±0.71）ab
小麦纹枯病菌 （9.10±0.12）a
番茄早疫病菌 （8.65±0.43）ab
棉花枯萎病菌 （7.10±0.21）bc
棉花黄萎病菌 （7.25±0.09）b
注：英文字母相同表示差异不显著，不相同表示差异显著。
以拮抗带宽度4.25mm为临界点，拮抗带宽度大于4.25mm为抑制作用强，拮抗带宽度小于4.25mm为抑制作用弱。对峙试验结果表明枯草芽胞杆菌BS501a发酵液对小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、黄瓜灰霉病菌、黄瓜镰刀菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、辣椒枯萎病菌、水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、西瓜枯萎病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌的抑制作用强；对玉米青枯菌、玉米串珠镰孢菌、禾生腐霉的抑制作用较弱。
实施例3 枯草芽胞杆菌BS501a发酵液生物安全性测定
根据药典，采用急性毒性实验检测枯草芽胞杆菌BS501a发酵液的生物安全性。将枯草芽胞杆菌BS501a发酵液冷冻干燥，制成冻干粉。将冻干粉用生理盐水依次稀释至5×10-2g/mL，5×10-3g/mL，5×10-4g/mL，5×10-5g/mL，5×10-6g/mL等不同浓度。将48只3周龄昆明小鼠进行7d的喂养观察，观察期内小鼠自由采食、饮水。观察期结束后，将小鼠随机分成6组，每组8只。小鼠给药前禁食，但不禁水。过夜后，称重。取5组小鼠，根据体重，每只小鼠经口灌胃0.2ml 枯草芽胞杆菌BS501a发酵液冻干粉溶液，使5组小鼠枯草芽胞杆菌BS501a发酵液冻干粉的剂量分别为500mg/kg，50 mg/kg，5 mg/kg，0.5 mg/kg，0.05 mg/kg。第6组小鼠设为空白对照组，经口灌胃0.2ml生理盐水。给药后间隔2h进食，连续观察7d。饲养过程中观察小鼠外观、精神表现、采食情况、体重变化。7d后解剖，观察内脏病理变化。
根据国家技术监督局GB15670-1995急性经口毒性分级标准，枯草芽胞杆菌BS501a发酵液冻干粉的LD50值>500 mg/kg，证明属于低毒级，符合绿色生物农药要求。
实施例5 枯草芽胞杆菌BS501a发酵液盆栽防治效果
将水稻培养3周左右，待大部分水稻长至三叶一心时，采用喷壶向水稻的叶和茎喷洒稻瘟病菌孢子悬液5mL（加0.5%的吐温80），喷洒24h后，叶面喷洒枯草芽孢杆菌BS501a发酵上清液（加0.5%的吐温80）对水稻进行防治，每天1次，每次5mL。对照用去离子水处理。28℃条件下，100%光照14h、黑暗10h交替培养6d（从喷洒稻瘟病菌孢子悬液开始计时），调查水稻染病情况。调查分级标准以叶片为单位（IRRI）：
0级为无病
1级为叶片病斑少于5个，长度小于1cm
3级为叶片病斑6-10个，部分病斑长度大于1cm
5级为叶片病斑11-25个，部分连成片，占面积10%-25%
7级为叶片病斑26个以上，部分连成片，占面积26%-50%
9级为叶片病斑连成片，占叶片面积50%以上或全部枯死。
在喷洒稻瘟病菌孢子悬液2-3d后，水稻叶片上就可以看出稻瘟病菌侵染痕迹。未喷洒枯草芽孢杆菌BS501a发酵上清的水稻叶片受稻瘟病菌侵染显著，大部分叶片上都有明显的稻瘟病病斑，且个数多，面积大，还有部分病斑已经扩散至整个叶片，染病的叶片明显发黄，像火烧过一样。喷洒了枯草芽孢杆菌BS501a发酵上清的水稻，大部分叶片保持鲜绿色，少部分被侵染叶片病斑个数少、面积小。具体的病情指数以及防治效率见表2。
表2 枯草芽孢杆菌BS501a发酵上清的防治效率
注：
实施例6 枯草芽孢杆菌BS501a发酵液对水稻的促生长作用
将健康稻种浸泡在100倍稀释的枯草芽孢杆菌发酵液中24h后，播种在塑料纱盘内，表面均匀覆盖细纱，于多波段培养箱中模拟自然光照，培养育苗，视需要沿纱盘边沿加清水。每个处理100粒。对照用清水浸种。当水稻长至二叶一心时测发芽率和秧苗的鲜重。结果表明，与对照相比，经枯草芽孢杆菌BS501a发酵液浸泡处理后秧苗鲜重提高了15.93%，但发酵液对水稻种子的发芽率没有影响。

Claims (2)

1.一种微生物多功能肥的制备方法与发酵培养基组成，其特征为：包括如下操作步骤：
（1）培养基配制：分别配制菌种活化培养基、种子培养基和发酵培养基，高温灭菌后备用；
所述菌种活化培养基为：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，加水至1L，pH 7.0-7.5；
所述种子培养基为：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，加水至1L，pH 7.0-7.5；
所述发酵培养基为：葡萄糖15000g，蛋白胨10000g，酵母膏5000g，KH2PO4 1300g，K2HPO41000g，MgSO4·7H2O 500g， MnSO4·H2O 100g，FeSO4·7H2O 100g，CaC12·2H2O 1500g，加水至1000L，pH 7.0-7.5；
（2）菌种活化：挑取斜面保藏的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS501a接种于步骤（1）制得的菌种活化培养基中，于35-37℃，180-220r/min摇床振荡培养16-24h，得活化枯草芽孢杆菌菌液；
（3）液体种子制备：按5％-10％（体积百分数）的接种量将步骤（2）活化的枯草芽孢杆菌菌液接种于步骤（1）制得的种子培养基中，于35-37℃，通空气培养16-24h，得到液体种子；
（4）液态发酵：按5％-10％（体积百分数）的接种量将步骤（3）制得的液体种子接种于步骤（1）制得的发酵培养基中，于30℃，通无菌空气培养48h，经平板细菌计数，活菌数达3×109-9×109CFU/mL，即得活菌体培养物；
（5）叶面肥和拌种肥制备：向步骤（4）制得的活菌体培养物静置，菌体沉淀，除去菌体，即得微生物叶面肥和拌种肥；
（6）地面肥的制备：将步骤（4）获得的活菌体培养物通风干燥，即获得地面肥。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基组成，其特征是：葡萄糖15000g，蛋白胨10000g，酵母膏5000g，KH2PO41300g，K2HPO41000g，MgSO4·7H2O 500g， MnSO4·H2O 100g，FeSO4·7H2O100g，CaC12·2H2O 1500g，加水至1000L，pH 7.0-7.5。
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