CN109929773B - 一株可用于富硒培养的双歧杆菌及其活性蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的双歧杆菌DD98，其16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，进一步的，所述双歧杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16573。本发明所述双歧杆菌DD98可以耐受较高的硒压力，可用于富硒培养，并且具有良好的肠道定殖能力，提取得到的水溶性蛋白具有肠道保护功能。本发明所述双歧杆菌DD98能够缓解由高脂饮食及酒精共同引起的肝损伤，对肝脏具有保护作用。

Description

一株可用于富硒培养的双歧杆菌及其活性蛋白和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种双歧杆菌及其活性蛋白和应用，进一步的，该双歧杆菌可经富硒培养制备成富硒益生菌。

背景技术

益生菌是一类能够对宿主产生有益作用的微生物，与人体的健康密切相关。益生菌一般定植于人体的肠道和生殖***内，对于维持人体内微生态平衡具有重要作用。已有的研究结果表明，人体微生物群的稳定对于维持人体健康非常重要，衰老、高血压、糖尿病及肠道疾病等都与人体微生物群有关。人体内的微生物群失衡，会直接或间接导致这些疾病的产生。双歧杆菌是人体中常见的一种生理性益生菌，定植于人体的胃肠道内，对于维持和调节人体内的肠道菌群十分重要。许多研究表明，以乳酸菌、双歧杆菌等益生菌制备得到的活菌制剂，可以代替抗生素，起到保护肠道，维持肠道平衡的作用，从而防治腹泻、便秘等消化疾病，并具有许多明显的益生功效，如降糖、降胆固醇、保护肝脏、增强免疫、抗癌等。根据最新的(2004年)伯杰细菌鉴定手册，基于16SrDNA测序技术得到的双歧杆菌共分成34个不同的种，包括青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、齿双歧杆菌、婴儿双歧杆菌(即，长双歧杆菌婴儿亚种)、乳双歧杆菌(即，动物双歧乳脂亚种)、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌以及嗜热双歧杆菌和嗜酸热双歧杆菌，等等。专利CN200910136613.7报道了一株对肠道上皮细胞具有黏附能力，具有调节菌群功能的双歧杆菌BBMN68。专利CN201110388295.0报道了一株能够缓解胃肠道功能紊乱症状的婴儿双歧杆菌菌株IFA09。

硒是是人体必需的微量元素之一，可以参与合成各种硒代氨基酸以及多种硒代蛋白(酶)。硒元素本身以及由其合成的硒蛋白具有很多生物学活性，如抗氧化、抗肿瘤、增强人体免疫等，因此硒与人体的健康密切关系。世界卫生组织提出，硒是促进人类生命健康必不可少的一种微量元素，如果在日常生活中合理摄取硒元素，可以有效预防多种疾病的发生。富硒酵母是目前市场上应用较为广泛的补硒产品，酵母作为转化载体可以将外界的无机硒转化为有机硒，更有利于人体的吸收。除此之外，双歧杆菌，乳杆菌一类的益生菌也可用于硒的培养与转化。与富硒酵母相比，由于益生菌本身的益生作用，因此富硒益生菌可能会具有更优的生物活性。

虽然双歧杆菌是GRAS(公认安全)的益生菌，研究表明其被人体摄入之后能够发挥多种益生功能。然而，目前国内外可用到食品中的双歧杆菌菌株寥寥无几，这是因为双歧杆菌经口摄入人体以后，多种因素会影响其在人体肠道内定殖，例如，胃部低pH值的高酸性环境以及其内存在的消化酶，酸性环境会降低质子动力，破坏双歧杆菌细胞内外的渗透压平衡；小肠内高浓度的胆盐和内源性的抗菌肽还有肠道固有菌群对机体的防御***，甘氨胆酸盐和牛黄胆盐具有细胞膜毒性，胆盐水解酶活性高的双歧杆菌将胆盐水解成次级胆盐能够降低其细胞膜毒性；双歧杆菌粘附到肠道上皮细胞的能力大小以及能否利用不被宿主消化代谢的营养物质(某些蛋白质类物质、低聚糖等益生元等)都会影响双歧杆菌的肠道定殖。因此分离得到可以在肠道内定殖的双歧杆菌具有非常重要的应用价值和现实意义。

发明内容

本发明在针对现有技术不足，提供了一种新的双歧杆菌DD98，可进一步用于富硒培养，且具有良好的肠道定殖能力以及肠道保护和肝损伤保护功能。此外，为了避免双歧杆菌因环境敏感导致失去活性的问题，本发明提取了双歧杆菌DD98的活性成分，获得其水溶性蛋白，扩大了双歧杆菌DD98的应用。

本发明具体技术方案如下：

一种双歧杆菌，命名为双歧杆菌DD98，其16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明16SrRNA测序和核苷酸序列BLAST分析结果表明，双歧杆菌DD98菌株与目前已知的其它所有长双歧杆菌的相应序列皆不完全相同，其与标准菌株长双歧杆菌JCM11342(其16S rRNA序列参见Genebank编号：LC306854.1)存在序列上的不同。因此可见，双歧杆菌DD98是一种以往未被分离的新的长双歧杆菌。

上述双歧杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏时间2018.10.11，保藏编号为CGMCCNo.16573，分类命名：长双歧杆菌Bifidobacterium longum，是否存活：存活。

进一步的，上述双歧杆菌经富硒驯化培养，制备富硒双歧杆菌。

本发明另一目的在于提供上述双歧杆菌的冻干制剂，本发明所述的双歧杆菌和冻干保护剂，所述冻干保护剂包括海藻糖、脱脂奶粉和Vc-Na，质量比为10:20:2。

本发明另一目的在于提供从上述双歧杆菌DD98菌体中提取得到活性蛋白。

采用如下方法制备得到：

将双歧杆菌DD98在RCM培养基中37℃厌氧培养，生理盐水离心洗涤，得到菌体，水重悬菌体，超声破碎，向细胞破碎液中加入核酸酶消化后离心，去除细胞碎片，上清液使用丙酮沉淀蛋白，离心后挥干丙酮，重溶沉淀，即得双歧杆菌活性蛋白。

本发明所述双歧杆菌DD98以及从中提取到的活性蛋白可以用于制备预防或治疗胃肠道疾病或肝类疾病产品。

上述产品中双歧杆菌菌株以活体细胞形式或非活体细胞形式存在。优选每克产品中含有大于10¹⁰cfu的量的双歧杆菌。

本发明所述双歧杆菌具有与长双歧杆菌相似的活性，特别在治疗胃肠道疾病和肝类疾病，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、慢性肠炎、感染后结肠炎、腹泻、高脂饮食及酒精共同引起的肝损伤中具有优越的活性。

本发明优点：

本发明所述双歧杆菌DD98可以耐受较高的硒压力，可用于富硒培养。双歧杆菌DD98具有良好的肠道定殖能力，提取得到的水溶性蛋白具有肠道保护功能。双歧杆菌DD98能够缓解由高脂饮食及酒精共同引起的肝损伤，对肝脏具有保护作用。

附图说明

图1为双歧杆菌DD98电子扫描显微镜显结果。菌体呈长杆状或端部分叉杆状，菌体一般长约10μm，为长双歧杆菌典型的细菌形态。

图2为双歧杆菌DD98菌落的形态特征。菌落边缘整齐、质地柔软、表面光滑，呈乳白色凸起。

图3为双歧杆菌DD98革兰氏染色光学显微镜显结果。染色结果为紫色，说明为革兰氏阳性杆菌。

图4为小鼠给予双歧杆菌DD98后肠道内双歧杆菌数量的变化。

图5为小鼠给予双歧杆菌DD98后肠道内肠杆菌数量的变化。

图6为双歧杆菌DD98水溶性蛋白增强IEC6细胞活力情况。

图7为双歧杆菌DD98水溶性蛋白抑制LPS诱导的IEC6细胞凋亡情况。

图8为双歧杆菌DD98水溶性蛋白抑制LPS诱导的IEC6细胞线粒体膜电位倒塌。

图9为双歧杆菌DD98水溶蛋白能够抑制LPS所致的ZO-1和Occludin的mRNA水平降低，使ZO-1和Occludin的mRNA水平升高。

图10为双歧杆菌DD98能够抑制高脂饲料和酒精共同处理引起的小鼠血清ALT和AST的升高。

图11为双歧杆菌DD98能够降低高脂饲料和酒精共同处理后的小鼠血清TG和TC水平。

图12为双歧杆菌DD98能够降低高脂饲料和酒精共同处理后的小鼠血清游离脂肪酸的水平。

图13为双歧杆菌DD98能够降低高脂饲料和酒精共同处理后的小鼠血清MDA水平。

图14为双歧杆菌DD98能够升高高脂饲料和酒精共同处理后的小鼠血清SOD水平。

图15为双歧杆菌DD98能够降低高脂饲料和酒精共同处理后的小鼠血清LDH水平。

图16为双歧杆菌DD98能够降低高脂饲料和酒精共同处理后的小鼠血清TNF-α水平。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1双歧杆菌DD98的获得和菌株分离、筛选

1.样品采集和扩增培养

取采样对象新鲜中段粪便1g，加入10ml生理盐水充分混匀，室温静置5min，收集上层悬液。取上层悬液1ml,接种于50ml的RCM培养基中，37℃厌氧培养24h,得到培养液。

2.菌株分离

取培养液，用生理盐水梯度稀释10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5倍，得到菌悬液，吸取0.1ml菌悬液涂布于BBL培养基上，37℃厌氧培养24h，得到单菌落。

3.菌株纯化

挑取单菌落，将菌落培养物划线接种于BBL培养基上，37℃厌氧培养24h；再将长出的单菌落继续划线接种于BBL培养基上，37℃厌氧培养24h，连续分离纯化三次。将最后挑取的单菌落进行革兰氏染色，镜检为革兰氏阳性菌，长杆或顶部分叉状的纯化菌株，即为分离获得的纯培养物。

4.生长优势菌株筛选

生长优势菌株筛选：将纯培养菌株的菌液接种至96深孔板中，测定各孔中细菌培养液的OD600，选择OD600最高的12株单菌落进行复筛。复筛：将这12株菌株重新接种到含有新鲜培养基的深孔板中，37℃厌氧培养14-16h，选择OD600最高的菌株作为双歧杆菌的生长优势菌株。将生长优势菌株接种于茄子瓶中进行扩增培养，并用20％甘油进行菌种保藏。

RCM培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉3g,葡萄糖5g,乙酸钠3g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，L-半胱氨酸0.5g，琼脂15g,蒸馏水1000mL,pH6.8。

BBL培养基配方：蛋白胨15g，酵母粉2g,葡萄糖20g,可溶性淀粉25g，氯化钠5g，L-半胱氨酸0.5g，番茄浸粉5g，肝浸粉2g，琼脂20g，吐温-80 1ml,蒸馏水1000mL,pH7.0。

实施例2双歧杆菌DD98的富硒驯化考察

配制***钠溶液，0.22um过滤后添加到培养基中，再将培养基分装至96深孔板及平皿中。富硒驯化梯度初步设计：5，10，15，20，25，50，100，200，400，600，800μg/ml。

将双歧杆菌优势菌株甘油管分装至含有5μg/ml***钠培养基的96深孔板中，厌氧培养24小时，96深孔板每孔取200μl到96酶标板中进行OD600检测，OD值最高的3个孔稀释至10⁵～10⁶倍涂布到5μg/ml***钠平皿上。平皿涂布后放进厌氧培养箱培养18小时，待单菌落长出后，挑取点大且颜色浅的单菌落(说明该菌落在对应浓度的***钠培养基上生长良好，且不易将***钠转化为红色的单质硒)于装有5μg/ml***钠培养基的96深孔板中培养。厌氧培养18小时后，每孔取培养液到96酶标板中进行OD600检测，OD值最大的3个孔稀释10⁵～10⁶倍涂布到10μg/ml***钠平皿上。平皿涂布后放进厌氧培养箱培养18小时，待单菌落长出后，用牙签挑取点大且颜色浅的单菌落于装有10μg/ml***钠培养基的96深孔板中，厌氧培养18小时后，每孔取200μl到96酶标板中进行OD600检测，OD值最大的3个孔稀释10⁵～10⁶倍涂布到15μg/ml***钠平皿上，如此反复循环，直到800μg/ml***钠压力为止。最后获得硒压力耐受能力强，生长情况好的单菌落，划线获得纯培养，并进行菌种鉴定。试验结果表明本发明所述双歧杆菌DD98具有很好的硒压力耐受能力。

实施例3双歧杆菌DD98的细菌学特征

1.菌落形态特征

采用电子扫描显微镜观察所分离纯化的DD98，菌体呈长杆状或端部分叉杆状，菌体一般长约10um，如图1所示。

菌落的形态特征：边缘整齐、质地柔软、表面光滑，呈乳白色凸起，如图2所示。

革兰氏染色光学显微镜观察：染色结果为紫色，如图3所示，说明为革兰氏阳性杆菌。

2.生化特征

以伯杰氏手册为参考，考察DD98的糖发酵产酸特性，结果如下：

结果显示：双歧杆菌DD98可以利用L-***糖，D-半乳糖，D-果糖，D-葡萄糖，D-乳糖，蔗糖，麦芽糖，蜜二糖，棉子糖，D-甘露醇，D-木糖，不能利用***胶，海藻糖，D-甘露醇，D-山梨醇，支链淀粉，淀粉，木聚糖，菊糖，水杨苷，纤维二糖。

3.基因学特征

提取细菌基因组DNA，采用细菌的16S通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQID No：2)与1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQ ID No：3)，扩增获得该细菌的16SrRNA基因序列，该细菌16SrDNA序列如SEQ ID No：1所示，CGGAGTCTACTTAGACGGCTCATCCCACAAGGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGCTGCCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGACGTTGCTGATTCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGGGATCCGCTCCGCGTCGCCGCGTCGCATCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTAACCCCGGCGGTCCCCCGTGAGTTCCCGGCATAATCCGCTGGCAACACGGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCCGCCCCGAAGGGAAGCCGTATCTCTACGACCGTCGGGAACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTAGCTCCGACACGGAACCCGTGGAACGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCAAGCCCGCCCGTACCCGGCGCGGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCCGGATAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCAACGGGTAAACTCACTCTCGCTTGCTCCCGATAAAAGAGGTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGAGTCTGGACGTATTCCTCAGTCCATGTGACATCGCCCCTCTTCAGTCGGCTACGTTCGAAGCCTACGGGTGGGCCGTAGCCGGCGTTCAAGCCTGGTATATAG)。

通过使用16SrRNA测序和核苷酸序列BLAST分析，所述菌株与目前已知的其它所有长双歧杆菌的相应序列皆不完全相同，但具有一定的同源性。经糖发酵特性分析，与《伯杰氏细菌鉴定手册》比较，进一步证实所述菌株属于长双歧杆菌，但其与标准菌株长双歧杆菌JCM 11342(其16S rRNA序列参见Genebank编号：LC306854.1)比较16SrRNA序列的结果显示，本发明的菌株与所述标准菌株存在序列上的不同。因此可见，本发明的菌株是一种以往未被分离的新的长双歧杆菌。

实施例4双歧杆菌DD98冻干制剂

将双歧杆菌DD98菌体与保护剂水溶液按质量比1：1混合后置于真空冷冻干燥机中(LGJ-22D型冷冻干燥机北京四环科学仪器厂有限公司)，冻干工艺为：第一阶段：-40℃，4h(预动结束后抽真空)；第二阶段：5℃，10h；第三阶段：15℃，10h，真空度为10Pa，厚度约为0.5cm。冻干结束后，取出西林瓶，对西林瓶内菌粉通过平板计数法进行准确计数，计算冻干存活率。

冻干保护剂的筛选如下：

(1)脱脂奶粉添加量筛选

取5个灭菌过的西林瓶，向各瓶中加入保护剂水溶液和菌泥，按质量比1：1均匀混合，编号1～5的保护剂水溶液分别是0、5、10、15、20％的脱脂奶粉，将西林瓶置于冷冻干燥箱中冻干。脱脂奶粉筛选结果如表1所示：

表1：

编号	脱脂奶粉(％)	冻干存活量(％)
			1	0	3.3
2	5	28.5
			3	10	35.7
4	15	35.3
			5	20	33.5

由上述结果知，当脱脂奶粉超过10％以上时，冻干存活率不再增加，10％脱脂奶粉冻干存活率为35.7％，相比不加保护剂直接冻干的菌泥冻干存活率提高了10.7倍。

(2)糖类保护剂的筛选

取8个灭菌过的西林瓶，向各瓶中加入保护剂水溶液和菌泥，按质量比1：1均匀混合，编号1～8的保护剂水溶液是10％的脱脂奶粉再分别加入10％葡萄糖、水苏糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇、乳果糖、纯化水，将西林瓶置于冷冻干燥箱中冻干。

糖类保护剂筛选结果如表2所示：

表2：

由上述结果知，海藻糖对富硒双歧杆菌的冻干保护效果最好，相比单纯的10％脱脂奶粉，冻干存活率提高了12.4％。因此对海藻糖的添加比例进行了筛选，分别是10％、15％、20％、25％，具体步骤同上，筛选结果如表3所示：

表3：

编号	海藻糖比例	冻干存活量(％)
			1	10％	48.1
2	15％	56.3
			3	20％	67.5
4	25％	70.2

由上述结果知，海藻糖的添加量为25％时，保护效果最好，但是25％的海藻糖相对难分散，浓度过高，流动性差，考虑进冻干箱的可操作性，选择20％作为海藻糖的最优添加比例。

(3)抗氧化剂的筛选

取4个灭菌过的西林瓶，向各瓶中加入保护剂水溶液和菌泥，按质量比1：1均匀混合，编号1～4的保护剂水溶液是10％的脱脂奶粉、20％的海藻糖再分别加入1％的Vc-Na、谷氨酸钠、L-半胱氨酸盐酸盐和纯化水，将西林瓶置于冷冻干燥箱中冻干。

抗氧化剂筛选结果如表4所示：

表4：

编号	种类	冻干存活量(％)
			1	Vc-Na	82.4
2	谷氨酸钠	72.3
			3	L-半胱氨酸盐酸盐	47.5
4	空白对照	67.5

由上述结果知，额外添加Vc-Na可以增加富硒双歧杆菌的冻干存活率，因此对Vc-Na的添加比例进行了筛选，结果如表5所示：

表5：

编号	Vc-Na比例	冻干存活量(％)
			1	1％	82.4
2	2％	85.5
			3	3％	85.2
4	4％	85.5

由结果知，Vc-Na的添加比例在2～4％之间时对富硒双歧杆菌的保护效果几乎不存在差异，因此考虑成本选择2％的Vc-Na作为最优的添加量。

总结：

通过对冻干保护剂的筛选，得出最优冻干保护剂水溶液配方为：10％脱脂奶粉、20％海藻糖、2％维生素C钠，68％纯化水。保护剂与菌泥的重量添加比为1：1.冻干工艺为：第一阶段：-40℃，4h(预冻结束后抽真空)，第二阶段：5℃，10h；第三阶段：15℃，10h，真空度为10Pa，厚度约为0.5cm。冻干存活率在85％以上，活菌数在5×10¹⁰cfu/g以上。

实施例5双歧杆菌DD98调节机体肠道菌群功能的研究

SPF级ICR小鼠，6到8周龄，雄性,体重18－22g。饲养环境:室温22±2℃，12h灯照/黑暗循环，自由饮水和摄食。小鼠随机分组，每组6只，适应性饲养5d后，双歧杆菌组每天灌服0.2ml浓度为6×10^8cfu/ml的双歧杆菌,正常对照组每天灌服0.2ml0.9％氯化钠溶液。30d后，以小鼠粪便中的双歧杆菌、肠杆菌数量为检测指标考察双歧杆菌DD98的肠道定植和调节肠道菌群的能力，完成30天给药后，无菌采取小鼠粪便0.1g，10倍稀释，进行平板计数。以菌落形态、革兰氏染色镜检、生化反应等鉴定计数菌落，计算出每g湿便中的菌数。运用SPSS 16.0分析软件进行统计学分析；GraphPad.Prism.v5.0软件对菌群变化数据制作图表。实验动物连续灌胃双歧杆菌30天后，动物粪便双歧杆菌数量的变化如图4所示(n＝6,X±SD，与对照组相比*P<0.05，**P<0.01)，结果表明，双歧杆菌组小鼠粪便中双歧杆菌数量显著高于对照组(p<0.05)，表明口服双歧杆菌DD98可以提高小鼠肠道内双歧杆菌数量。实验动物连续灌胃双歧杆菌30天后，动物粪便肠杆菌数量的变化如图5所示(n＝6,X±SD，与对照组相比*P<0.05，**P<0.01)，结果表明，双歧杆菌组小鼠粪便中肠杆菌数量低于对照组，提示口服双歧杆菌DD98可以降低肠道内有害菌属肠杆菌的存活。以上实验表明DD98双歧杆菌可以改善肠道菌群，增加益生菌数量，降低致病菌数量。

实施例6双歧杆菌DD98的水溶性蛋白保护小鼠肠上皮细胞的功能

双歧杆菌DD98在RCM培养基中37℃厌氧培养24h，生理盐水离心洗涤3次，得到DD98菌体。用超纯水重悬菌体，置于细胞破碎仪中进行超声破碎，向细胞破碎液中加入核酸酶对核酸进行消化。随后将细胞破碎液高速离心，去除细胞碎片。上清使用4倍体积丙酮沉淀蛋白。离心后挥干丙酮，用超纯水重溶沉淀，即得双歧杆菌DD98水溶性蛋白。

用50μg/ml LPS处理将大鼠肠上皮细胞IEC6细胞，同时加入10,30,100mg/L的DD98水溶性蛋白，孵育24小时后，分别用MTT法检测细胞活力，用流式细胞仪检测细胞凋亡及线粒体膜电位。LPS处理IEC6细胞24h后能够抑制IEC6细胞活力，诱导IEC6细胞凋亡，倒塌线粒体膜电位。而双歧杆菌DD98水溶性蛋白能够抑制LPS引起的IEC6细胞活力下降(图6)，并且能够抑制LPS引起的IEC6细胞凋亡(图7)及线粒体体倒塌(图8)。

用50μg/ml LPS处理将大鼠肠上皮细胞IEC6细胞，同时加入10,30,100mg/L的双歧杆菌DD98水溶性蛋白，孵育24小时后，收集细胞。提取细胞总RNA，测定ZO-1和Occludin的mRNA水平。LPS刺激IEC6细胞后导致ZO-1和Occludin的mRNA水平降低，而水溶蛋白能够抑制LPS的这种作用，升高ZO-1和Occludin的mRNA水平(图9)。

以上研究表明双歧杆菌DD98水溶性蛋白能够抑制脂多糖(LPS)引起的IEC6细胞活力下降，并且能够抑制LPS引起的IEC6细胞凋亡及线粒体体倒塌，能够抑制LPS引起的IEC6细胞紧密连接减少，说明双歧杆菌DD98水溶性蛋白能抑制LPS诱导的肠上皮细胞损伤，减少紧密连接蛋白表达下降，对肠上皮细胞损伤具有保护作用。

实施例7双歧杆菌DD98对高脂饮食和酒精引起的肝损伤的保护作用

1.样品制备

双歧杆菌DD98在RCM培养基中37℃厌氧培养24h，生理盐水离心洗涤3次，得到DD98菌体。

2.动物分组

取SPF级C57/BL6雌性小鼠32只，正常喂养3d后，将其按体重平均分为5组，分别为对照组、模型组及长双歧杆菌高、中、低剂量组，每组6只。长双歧杆菌高、中、低剂量组分别每日灌胃25、50、100mg/kg。除对照组外的小鼠以15％乙醇和高脂饲料处理28天。

15％乙醇由红星二锅头酒加入纯净水配制而成，使用酒精密度计调配。高脂饮食配方如下：10％猪油、2％胆固醇、0.2％胆盐、5％全脂奶粉、5％蛋黄粉、77.8％基础饲料。

3.样本采集

处理前禁食12h，小鼠摘眼球取血，常温静置后待其凝固，3 000r/min离心15min，取血清，-80℃保存待测。

4.生化指标检测

每组取同等样本量的小鼠血清及肝匀浆，按照试剂盒操作方法进行小鼠血清ALT、AST、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、SOD、MDA、LDH含量测定。

5.ELISA法检测小鼠血清中TNF-α的含量

收集小鼠血清，按照试剂盒说明书操作测定血清TNF-α水平。从冰箱取出TNF-α的ELISA测定试剂盒，室温平衡30分钟。从密封袋中取出所需酶标条，除空白孔外，分别将标本或不同浓度的标准品加入相应孔中，标准曲线用以下浓度2000，1000，500，250，62.5，31.25，0pg/ml。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育90分钟，用双蒸水稀释的浓缩洗涤液洗板4次。除空白孔外，加生物素化抗体工作液(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60分钟，洗板4次。除空白外，加酶结合工作液(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育30分钟，洗板4次。加入显色剂(100μl/孔)后，37℃避光反应10～20分钟，加入终止液(100μl/孔)，混匀后(5分钟内)测量450nm处的OD值。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点，通过标本的OD值可以在标准曲线上计算出其浓度。若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

6.数据处理

实验结果以mean±SEM表示。先用单因素方差进行统计分析，再以Student-Newman-Keuls检验各组间的差异，p<0.05表示组间有显著性差异。

本发明所提供双歧杆菌DD98能够改善乙醇和高脂(HFD)饮食共同处理导致的小鼠肝损伤，保护肝细胞，调节血脂紊乱，并具有一定的降低氧化应激及抗炎的作用。表现为显著降低乙醇和高脂饮食引起的血清转氨酶ALT和AST水平升高(图10)；显著降低血清TG和TC水平(图11)。高剂量的DD98能够显著降低血清FFAs的水平(图12)。DD98对血清MDA水平有降低作用(图13)，但是各浓度的DD98对血清SOD水平降低无显著作用(图14)。DD98也不显著影响血清LDH水平(图15)。但是DD98能够降低血清中TNF-α的水平(图16)。

实施例8含双歧杆菌DD98菌株的发酵乳的制备

以牛奶和玉米浆干粉作为基底发酵双歧杆菌DD98，制备双歧杆菌DD98发酵乳。双歧杆菌DD98按3-5％的接种量接入发酵罐，控制发酵温度为36-38℃，搅拌速度为250-350rpm，控制pH为6.4-6.6，培养16-20h。放罐所得发酵液即为双歧杆菌DD98发酵乳。发酵培养基：脱脂奶粉80g/L，玉米浆干粉5g/L，用氢氧化钠溶液和稀盐酸调节pH 6.50±0.1。

实施例9含双歧杆菌DD98菌株的活菌制剂的制备

将双歧杆菌DD98湿菌体与冻干保护剂(海藻糖、脱脂奶粉、维生素C钠)按1:1混合后进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为：压强10-50Pa，加热板温度为-40-35℃，样品厚度为8-12mm；干燥时间在40-72小时，制备活菌微生态制剂，活菌数达到5×10¹⁰CFU/g。

序列表

<110> 江苏德禧生物科技有限公司

上海医药工业研究院

<120> 一株可用于富硒培养的双歧杆菌及其活性蛋白和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1227

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggagtctac ttagacggct catcccacaa ggggttaggc caccggcttc gggtgctgcc 60

cactttcatg acttgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgcattca ccgcgacgtt 120

gctgattcgc gattactagc gactccgcct tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg 180

aactgagacc ggttttcagg gatccgctcc gcgtcgccgc gtcgcatccc gttgtaccgg 240

ccattgtagc atgcgtgaag ccctggacgt aaggggcatg atgatctgac gtcatcccca 300

ccttcctccg agttaacccc ggcggtcccc cgtgagttcc cggcataatc cgctggcaac 360

acggggcgag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 420

gacgaccatg caccacctgt gaacccgccc cgaagggaag ccgtatctct acgaccgtcg 480

ggaacatgtc aagcccaggt aaggttcttc gcgttgcatc gaattaatcc gcatgctccg 540

ccgcttgtgc gggcccccgt caatttcttt gagttttagc cttgcggccg tactccccag 600

gcgggatgct taacgcgtta gctccgacac ggaacccgtg gaacgggccc cacatccagc 660

atccaccgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc 720

gctcctcagc gtcagtaacg gcccagagac ctgccttcgc cattggtgtt cttcccgata 780

tctacacatt ccaccgttac accgggaatt ccagtctccc ctaccgcact caagcccgcc 840

cgtacccggc gcggatccac cgttaagcga tggactttca caccggacgc gacgaaaccg 900

cctacgagcc ctttacgccc aataattccc ggataacgct tgcaccctac gtattaccgc 960

ggctgctggc acgtagttag ccggtgctta ttcaacgggt aaactcactc tcgcttgctc 1020

ccgataaaag aggttacaac ccgaaggcct ccatccctca cgcggcgtcg ctgcatcagg 1080

cttgcgccca ttgtgcaata ttcccccact gctgcctccc gtagagtctg gacgtattcc 1140

tcagtccatg tgacatcgcc cctcttcagt cggctacgtt cgaagcctac gggtgggccg 1200

tagccggcgt tcaagcctgg tatatag 1227

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (7)

1.一种双歧杆菌，其特征在于所述双歧杆菌的16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；所述双歧杆菌BifidobacteriumIongum保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16573。

2.如权利要求1所述的双歧杆菌，其特征在于所述双歧杆菌可进一步经富硒驯化培养，制备富硒双歧杆菌。

3.一种双歧杆菌的冻干制剂，其特征在于包括如权利要求1或2所述的双歧杆菌和冻干保护剂，所述冻干保护剂包括海藻糖、脱脂奶粉和Vc-Na，质量比为10:20:2。

4.一种双歧杆菌活性蛋白，其特征在于采用如下方法制备得到：将权利要求1或2所述的双歧杆菌在RCM培养基中37℃厌氧培养，生理盐水离心洗涤，得到菌体，水重悬菌体，超声破碎，向细胞破碎液中加入核酸酶消化后离心，去除细胞碎片，上清液使用丙酮沉淀蛋白，离心后挥干丙酮，重溶沉淀，即得双歧杆菌活性蛋白。

5.如权利要求1或2所述的双歧杆菌或权利要求3所述的双歧杆菌的冻干制剂或权利要求4所述的双歧杆菌活性蛋白在制备预防或治疗胃肠道疾病或肝类疾病产品中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的双歧杆菌菌株以活体细胞形式或非活体细胞形式存在。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的胃肠道疾病和肝类疾病包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、酒精性肝病、脂肪肝。

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