CN116059256B - 长双歧杆菌、富硒微生物在制备预防和***组合物的应用 - Google Patents

长双歧杆菌、富硒微生物在制备预防和***组合物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及长双歧杆菌、富硒微生物在制备预防和***组合物中的应用。所述的长双歧杆菌在制备预防和/或***的组合物中的应用，具有较好的预防和/或***的作用。

Description

长双歧杆菌、富硒微生物在制备预防和***组合物的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及长双歧杆菌、富硒微生物在制备预防和***组合物的应用。
背景技术
现有的癌症治疗方法都或多或少会加重患者的胃肠道毒副反应，增加其病痛折磨。近年来，免疫治疗的有效手段在临床上取得突破性进展，但免疫治疗在提升抗肿瘤疗效的同时，也打破了免疫平衡，引起免疫相关不良事件，抗癌治疗所带来的临床表现主要为恶心、呕吐、食欲减退、腹痛、便秘、腹泻等。
合理制备益生菌制剂，有针对性地对患者肠道菌群实施干预成为未来诊疗的方向。不仅有助于优化相关临床治疗方案，提高疗效，减少不良反应。肠道的黏膜免疫***是人体中最大的免疫器官。肠道内益生菌具有抑制有害菌、平衡肠道菌群、改善肠道功能、抗肿瘤、增强免疫力、改善消化功能、降低抗生素副作用、修复受损的粘膜等作用。同时，益生菌作为抗癌佐剂能降低药物毒副反应，增强化疗和免疫治疗功效。合理制备益生菌制剂，已经成为当今肿瘤治疗又一个突破点。有助于优化临床治疗方案，提高疗效，减少不良反应。
“硒”元素是被誉为“生命火种”的人和动物必需的微量元素，可有效防治大骨节病、克山病等多种疾病。硒的主要功效：提高人体免疫力、抑制肿瘤、抗氧化、抗衰老、提高红细胞的携氧能力等。缺硒引起重大疾病，人体缺硒可能产生的疾病有：能量缺乏性营养不良、血溶性贫血、克山病、大骨节病、高血压、缺血性心脏病、肝硬化、胰腺炎、纤维瘤、癌症、肌瘤、***症、糖尿病、白内障等。合理制备益生菌制剂，不仅有助于优化相关临床治疗方案，提高疗效，减少不良反应。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的一个方面，涉及富硒微生物在制备预防和/或***的组合物中的应用。
优选地，所述富硒微生物主要由长双歧杆菌经过富硒发酵制得。
优选地，所述长双歧杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:61113，保藏时间为2020年7月31日。
所述的长双歧杆菌具有显著抑制肿瘤细胞生长的效果。
优选地，所述富硒发酵的培养液包括组分A、组分B和组分C。
优选地，所述组分A包括以下浓度的组分：蛋白胨20～40g/L、酵母膏10～30g/L、葡萄糖50～70g/L、磷酸盐1～3g/L、吐温80 0.5～2g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5～2g/L、乙酸盐1～4g/L和纳米硒0.5～2g/L。
在一些具体的实施方式中，所述组分A包括以下浓度的组分：所述蛋白胨例如可以为，但不限于20g/L、25g/L、30g/L、35g/L或40g/L；所述酵母膏例如可以为，但不限于10g/L、15g/L、20g/L、25g/L或30g/L；所述葡萄糖例如可以为，但不限于50g/L、55g/L、60g/L、65g/L或70g/L；所述磷酸盐例如可以为，但不限于1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L或3g/L；所述吐温80例如可以为，但不限于0.5g/L、1g/L、1.5g/L或2g/L；所述半胱氨酸盐酸盐例如可以为，但不限于0.5g/L、1g/L、1.5g/L或2g/L；所述乙酸盐例如可以为，但不限于1g/L、2g/L、3g/L或4g/L；所述纳米硒例如可以为，但不限于0.5g/L、1g/L、1.5g/L或2g/L。
优选地，所述组分B包括以下重量份数的组分：氯化钙0.1～0.5份、硫酸镁0.25～0.5份、磷酸盐1～3份、钠盐8～16份和水900～1100份。
优选地，所述钠盐包括NaHCO3和/或NaCl。
在一些具体的实施方式中，所述组分B包括以下重量份数的组分：所述氯化钙例如可以为，但不限于0.1份、0.2份、0.4份或0.5份；所述硫酸镁例如可以为，但不限于0.25份、0.3份、0.4份或0.5份；所述磷酸盐例如可以为，但不限于1份、2份或3份；所述钠盐例如可以为，但不限于8份、12份、14份或16份；水例如可以为，但不限于900份、950份、1000份、1050份或1100份。
优选地，所述组分C包括以下重量份数的组分：维生素0.05～1.5份和乙醇10～30份。
优选地，所述维生素包括维生素K1。
优选地，所述乙醇的质量含量为95％。
在一些具体的实施方式中，所述组分C包括以下重量份数的组分：所述维生素例如可以为，但不限于0.05份、0.5份、1份或1.5份；所述乙醇例如可以为，但不限于10份、15份、20份、25份或30份。
优选地，所述组分A、所述组分B和所述组分C的体积比为3800～4200：38～42：0.1～0.4(例如3800：42：0.1、3900：40：0.2、4100：39：0.3或4200：38：0.4)。
本发明的另一个方面，还涉及富硒微生物，主要由长双歧杆菌经过富硒发酵制得；
所述长双歧杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61113，保藏时间为2020年7月31日。
本发明的另一个方面，还涉及益生菌制剂，所述益生菌制剂包括所述的富硒微生物。
本发明的另一个方面，还涉及所述的益生菌制剂在制备预防和/或***的组合物中的应用。
本发明的另一个方面，还涉及预防和/或***的组合物，包括所述的富硒微生物。
优选地，所述组合物还包括药学上可接受的载体。
优选地，所述载体选自稀释剂、分散剂、赋形剂、稳定剂、润滑剂和崩解剂中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的实施将为肿瘤的临床治疗提供依据，本发明提供的富硒双歧杆菌具有更高的生物活性，除了具有Bifidobacterium的功能外，与其它硒源相比提高了富硒的转化效率，总硒含量高，并且制备方法简单易行，易于工业化生产，具有很高的推广价值和临床意义。本发明的实施将进一步提高提高肿瘤病人的生活质量，有效降低肠胃肠道炎症的病发率等。
本发明的富硒微生物对癌症病人肿瘤免疫治疗的效果具有重要的影响，富硒微生物可以用于预防和/或***的组合物，从而实现肿瘤的预防和/或治疗，有效降低肠胃肠道炎症的病发率等的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的***发育树；
图2为本发明实施例3提供的MNH-19749划线培养的平板；
图3为本发明实施例3提供的MNH-19749革兰氏染色后的光学显微形态图；
图4为发明实施例3提供的MNH-19749在光学显微镜下的形态图；
图5为发明实施例5提供的MNH-19749在模拟胃液中的存活曲线；
图6为MNH-19749API50 CHL的测试结果；
图7为MNH-19749和anti-mouse PD-1抗体联用对结直肠癌(MC-38)的抑制作用的结果；
图8为MNH-19749和Se联用对结直肠癌(MC-38)的抑制作用的结果；
图9为外周血中CD4+T的流式检测结果；
图10为外周血中CD8+T的流式检测结果；
图11为外周血中CD4+T/CD8+T的流式检测结果。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1菌株MNH-19749的分离、纯化
菌株MNH-19749是一种从健康人群肠道的微生物中分离得到的长双歧杆菌。菌株MNH-19749保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61113。保藏时间为2020年7月31日。保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
在生物安全柜中分装生理盐水于无菌的10ml离心管中；提前24h将厌氧血平板和无菌生理盐水转移入厌氧工作台(H35 Hypoxystation,Whitley)中，将5～7颗无菌的玻璃珠倒入已经凝固的厌氧血平板(江门凯林贸易有限公司，Bio-Caring)中。
健康供体与公司签订粪便收集的知情同意书后，取其鲜粪便样本1g于厌氧操作台中使用漩涡振荡器震荡1min，混匀，吸取1mL样本到9mL生理盐水中，混匀为10-1稀释液，依次梯度稀释至10-6稀释液，用于涂平板用。
吸取100μL的10-6稀释液于厌氧血平板中，并用玻璃珠涂布均匀，待平板表面干燥后，倒弃玻璃珠，在该厌氧工作台37℃厌氧培养3～5天。观察分离到的菌株生长状况并用灭菌牙签挑取单菌落进行平板划线纯化、培养。
实施例2 16S rDNA鉴定
对菌株MNH-19749进行16S rRNA分析，初步确定其分类地位。
对菌株进行基因组DNA提取，利用提取的基因组DNA模板进行16S rRNA的扩增，扩增引物是1492R(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)和27F(5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，将扩增的PCR产物进行纯化，然后进行ABI3730XL测序，从而获得1371bp的16S rRNA序列，将此序列和NCBI 16S ribosomal RNA sequences数据库进行比对，最接近的物种为Bifidobacterium longum，相似度为99.5％，初步确定此菌株的物种分类信息，即初步判定MNH-19749属于Bifidobacterium longum种。
将此序列和相关属的16S rRNA序列进行多序列比对，利用MEGA 5构建***发育树，如图1所示。
分离获得的MNH-19749原始菌株进行基因组的制备、测序，组装和分析。
MNH-19749原始菌株的基因组通过超声波法进行序列片段化，片段化长度范围～350bp，然后利用标准DNA建库试剂盒(NEB UltraTM)构建Illumina测序文库。将构建好的测序文库利用NovaSeq(Illumina)进行双端150bp测序。测序得到3.00Gbp数据，其中Q20占比为：97.77％。
基因组原始测序数据使用fastp(版本：0.20.0)进行数据过滤，过滤参数：“--poly_g_min_len 10--poly_x_min_len 10-q 15-u 40-n 5-l 50”。过滤后的原始数据使用SPAdes(版本：v3.14.0)进行基因组组装，组装参数“--isolate--cov-cutoff 10”。基因组组装得到基因总长度2.43Mbp，N50长度为346.8kbp，GC含量为60.34％。
基因组基因使用原核分析软件基因组注释流程prokka(版本：1.14.5)进行基因组基因预测分析，参数“--gcode 11--evalue 1e-09”。总共预测得到2027条CDS序列，其中平均CDS序列长度为1051bp。基因组相似度最高的模式菌株为：Bifidobacterium longum，其中平均核苷酸相似度(ANI)为98.71％，基因覆盖度为82.64％，因此，可以认定为Bifidobacterium longum种下的一个菌株。
基因组中潜在的抗生素耐药基因使用RGI流程分析(版本：4.2.2)，其中抗生素耐药基因数据库为CARD(版本：3.0.0，https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi)。详细对比信息参照表1所示。
表1耐药基因信息列表
菌株基因 抗性基因 基因名称 比对一致性(％)
MNH-19749_01710 ARO:3000596 ErmX 95.89
对基因组中潜在的毒力因子及相关基因的分析采用的是NCBI blastp(版本为：2.7.1+)比对毒力因子数据库VFDB(virulence factor database，http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgi，更新日期为2019年9月19日)。详细比对结果见表2。
表2 MNH-19749潜在毒性基因列表
实施例3菌株MNH-19749的菌落特征
观察分离到的菌株生长状况，并用灭菌牙签挑取单菌落进行平板划线纯化、培养，分离到的菌株在培养基上划线培养后的平板如图2所示，图2为MNH-19749在培养基上以36℃，培养24h后的图片。菌落呈白色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐。
菌株MNH-19749经过革兰氏染色后在光学显微镜下的形态如图3所示，显微镜下，在培养基中36℃培养24h后，菌体呈杆状，单个或成对排列，革兰氏阳性。
MNH-19749在光学显微镜下的形态如图4所示，显微镜下，在培养基中36℃培养24h后，菌体呈杆状，单个或成对排列。
实施例4菌株MNH-19749的制备
从-80℃冰箱中取出2mL MNH-19749菌液化冻，接种于80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养8h，为一级种子；取2mL一级种子接种于另一瓶80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养16h，为二级种子；取2mL二级种子接种于另一瓶80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养8h，为三级种子。
配置发酵培养基：组分1按照浓度(g/L)的组成为：Rice peptone 15g/L，Soypeptone 15g/L，Yeast extract 20g/L，Glucose·H2O 60g/L，K2HPO4 2g/L，Tween 80 1g/L，Cysteine-HCl·H2O 1g/L，Sodium acetate 2g/L,Nano-Se 1g/L。
组分2按照质量(g)的组分为：CaCl2·2H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.50g，K2HPO41.00g，KH2PO4 1.00g，NaHCO3 10.00g，NaCl 2.00g，ddH2O 1000.00g。
组分3按照体积(mL)的组分为Vitamin K1 0.1mL，95％ethanol 20mL。
组分1取4L，组分2取40mL,组分3取0.2mL，混合均匀，用5M HCl和5M NaOH调节pH至7.2，121℃灭菌20min。
富硒发酵
培养液转接至发酵培养基，于5L生化反应器上进行培养16h，转速为100rpm，温度为37℃，用5M NaOH控制pH，使其不低于6.5；调节转速至300rpm，调节温度至42℃，控制pH，使其不低于6.0，继续反应8h。
冻干保存
按浓度(g/L)配置冻干保护剂：Sucrose 6g/L，Maltose dextrin 15g/L，CornStarch 15g/L，Glycerol 2g/L，ddH2O 25g/L。
将培养液离心浓缩，收集菌体，与冻干保护剂按照15:1的质量比混合均匀，-20℃下冷冻4h,放置冻干机中进行冷冻至菌体水分3％以下时结束冻干步骤。取出冻干后的菌体，机械粉碎，过80目筛后分装，-20℃保存。
富硒效果检测
检测菌粉中活菌数达到1.40×1011cfu/g，通过HPLC-ICP-MS联用对菌粉中的硒含量进行检测，总硒含量为800ug/g，其中Cys-Se占总硒31.60wt％。
实施例5菌株MNH-19749的抗逆性
以活细菌为基础的活体生态药(Live Biotherapeutic Product)的开发在近年来获得了越来越多的关注。细菌在进入消化道后会面临相当恶劣的生存环境，一方面，低pH的胃酸以及肠道中一定浓度的胆盐对许多细菌有着很大的伤害，另一方面，不同的菌株对这些有害环境的抗性差异也很大。一个细菌对消化道环境的耐受性对其是否有机会被开发成活体生态药关系重大,这些指标对以该细菌菌株为基础进行活体生态药开发中的剂型选择又至为重要。因此，测试菌株的耐酸性以及胆盐耐受性是十分有必要的。
体外抗逆性测试所采取的方式是观察细菌在与体内环境相似的模拟液，即模拟胃液(SGF)，接入菌株，根据菌株在胃部及小肠的停留时间设定时间点取样，测定菌株的存活曲线。为排除菌株在自然情况下的生长/死亡带来的影响，以pH＝6.8的缓冲溶液作为对照。空腹模拟胃液(SGF)及以浓盐酸稀释法获得pH在1.0(中国药典)或1.2(美国药典)的溶液加入胃蛋白酶制成。考虑到餐前餐后胃液的变化，参考Margareth R.C.Marques等人所发表的文章，以pH＝3作为餐后的胃液pH，这个酸度也与小鼠的正常胃液pH相似。而模拟肠液(SIF)则根据USP26用磷酸二氢钾及氢氧化钠按一定比例配置，pH为6.8。
测试的时长参考人体胃肠道的排空时间，对于耐酸性试验，选取2小时作为测试时长，对于胆盐耐受性试验，选取6小时为测试时长。本实施例中，主要考虑了酶、无机盐，以及胆盐。其中，由于不同的来源以及工艺，市面上胃蛋白酶、胰蛋白酶的活度参差不齐，参考M.Minekus等人，和Leyuan Li等人发表的文献，确定最终实验所用介质的配置及方案。
由于测试的取点时间相当密集，涂板的方法操作时间长，受影响因素大，难以保证结果的准确性。因而在本实施例中采用MTT(噻唑蓝)染色的方法进行活菌的鉴别。MTT作为一种染料常被当作底物通过检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性来检测细胞的死活。琥珀酸脱氢酶是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子。
琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内，形成的甲瓒结晶的量与活细胞数成正比,二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中沉淀的甲瓒，在570nm波长处测定其光吸收值，可间接测量活细胞的数量。该方法可以免去繁琐的浓度稀释和涂板操作，非常适用于快速进行细菌活率的测定。
模拟胃液：称取2.0g NaCl和2.67g胃蛋白酶(源叶生物胃蛋白酶，USP级，1:3000)，加入7.0mL浓HCl(37wt％)，纯水定容至1000mL，混匀。调pH分别至1.2(模拟人空腹肠液pH)和pH 3.0(模拟人饭后肠液pH及小鼠空腹肠液pH)，过滤除菌。将6.8g磷酸二氢钾及0.9g氢氧化钠溶于1000mL纯水中，调节pH至6.8±0.1，作为实验中使用的缓冲液，缓冲能力为18.6mmol/L/pH。
MTT(噻唑蓝)染色剂配置：称量0.5g MTT(噻唑蓝Shanghai Acmec BiochemicalCo.ltd,98％)至100mL无菌PBS(磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.2)中，完全溶解后过滤除菌，储存于棕色试剂瓶，冷藏于4℃冰箱中。
耐酸性测试：1、将待测菌粉0.7796g至10mL的缓冲液中；2、分别准备9mL缓冲液(对照组)；9mL pH为1.2的模拟胃液(实验组1)；9mL pH为3.0的模拟胃液(实验组2)至离心管中；3、取步骤1中的样品1mL加入步骤2配置的模拟胃液及缓冲液中，摇匀获得样品A(缓冲液组)、样品B(pH1.2模拟胃液组)和样品C(pH3.0模拟胃液组)；4、在取样时间点取样：在0时时间点对样品A取样(以此为0时数据)；在0.5h，1h和2h时对样品A、样品B和样品C取样；5、取1mL样品A、样品B和样品C加至4mL缓冲液中，混匀后取3mL混悬液加入1mL MTT(5mg/mL)染色液，黑暗环境下反应过夜；6、取3mL缓冲液加入1mL MTT作为空白对照。过夜后，震荡摇匀，取1mL各反应的样品加入2mL二甲基亚砜(DMSO)用于溶解显色物质甲瓒；7、在570nm波长下测量样品的吸光值,并据此推算出活细菌的比例。耐酸性测试结果见图5。
以对照组的数值为基准，实验组相对于对照组的活菌存活率见表3，结果表明，2小时pH为1.2的模拟胃液以及pH为3.0的模拟胃液处理对MNH-19749的存活几乎一致，均下降25％左右。
表3MNH-19749在模拟胃液中的存活率(％)
时间/h 缓冲液组 pH1.2模拟胃液组 pH3.0模拟胃液组
0 100 100.00％ 100.00％
0.5 100 86.33％ 86.00％
1 100 77.85％ 74.50％
2 100 73.44％ 77.50％
实施例6API 50测试
将待测MNH-19749菌株以4区画线培养，以最适条件培养至第4区有明显单一菌落。将单一菌落培养接种在10mL培养基，放置培养箱。培养条件为37±1℃约16～18小时。测量菌液的吸光值，调整菌液浓渡，使3倍稀释的菌液浓度OD600值最终为1.5。取1mL已调整的菌液加入10mL API50CH Medium，稍作混匀。此时浓度应为(OD600值)0.451，等同于2.0McFarland。取kit中的塑胶底板，使每一个孔洞注满已灭菌纯化水。将试剂条斜放至塑胶底板，利用无菌Drop吸取2.4中的混合液，注入试剂条的孔洞。每个孔以超过第2标示线为原则。重复本步骤直到所有试剂条的孔洞都被填满。盖上塑胶上版，放在25℃环境中观察。观察期分为24h与48h两个时间。观察期间，若出现黄色为阳性反应，只要出现过黄色级判断阳性，不因48h观察结束不为黄色而判断阴性。将结果登入Apiweb进行比对。检测结果如图6和表4。
表4 MNH-19749API50 CHL的测试结果
注："+"：阳性反应；"-"：阴性反应。
实施例7口服MNH-19749用于肿瘤治疗结直肠癌
为验证菌株MNH-19749是否可以用于肿瘤的预防和治疗，利用小鼠同源肿瘤模型进行了抑制结直肠癌的生长的实验。本实验通过了广东导科医药生物动物伦理委员会伦理审查。
C57B/6小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，小鼠结直肠癌细胞MC-38细胞株购自ATCC，InVivoMAb anti-mouse PD-1(BioXcell,BE0146)。
小鼠被通过口服(p.o.)方式被喂食MNH-19749细菌，MNH-19749解冻后放置于室温至其温度达到室温，后按照每只小鼠2×109CFU(colony formation unit)的剂量喂食，以菌粉的形式喂食，连续18天。
接种MC-38细胞量为1×106/只。接种当天收集细胞，细胞经无菌生理盐水洗涤细胞一次后，用预冷的无菌生理盐水重悬，并对细胞悬液进行计数。调整细胞浓度至1×107/mL，与预冷的Matrigel进行1：1混合均匀后注射0.1mL/只至小鼠皮下。接种肿瘤日设为D0天。
种瘤后小鼠持续进行喂食MNH-19749治疗直至实验结束，喂食方法同上。
在种瘤后第5，9，11，15天腹腔注射抗鼠PD-1抗体，注射剂量为每次每只小鼠100g。每两天量取种瘤大小。
肿瘤体积＝1/2×肿瘤长径2×肿瘤宽径。
计算肿瘤体积。
除实验组(MNH-19749+anti-mouse PD-1)外，实验同时设置两组对照，分别为仅使用PD-1治疗组(PD-1)和只进行溶媒治疗的对照组(Control)。
结果见表5和图7，结果显示，溶媒对照组肿瘤在D18达到约3083.59±457.9mm3，anti-mouse PD-1处理组在第18天肿瘤体积为约2135.45±328.3mm3，其肿瘤生长的速率低于溶媒对照组，MNH-19749处理组在第18天肿瘤体积为约2067.06±309.3mm3，其肿瘤生长的速率低于溶媒对照组。MNH-19749与anti-mouse PD-1联合处理组在第18天肿瘤体积为约1462.60±218.5mm3，其肿瘤生长的速率低于anti-mouse PD-1处理组，同时其肿瘤生长的速率也低于MNH-19749处理组。该实验结果表明MNH-19749可以明显减缓结直肠癌的生长速率并且MNH-19749可以在PD-1存在的情况下明显降低结直肠癌的生长速率。
表5 MNH-19749和anti-mouse PD-1抗体联用对结直肠癌(MC-38)的抑制作用
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为验证MNH-19749是否可以用于肿瘤的预防和治疗，利用小鼠同源肿瘤模型进行了抑制结直肠癌的生长的实验。本实验通过了创模生物科技(北京)有限公司动物伦理委员会伦理审查。
Bal/c小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，小鼠结直肠癌细胞CT-26细胞株购自ATCC，InVivoMAb anti-mouse PD-1(BioXcell,BE0146)。
小鼠被通过口服(p.o.)方式被喂食MNH-19749活菌、灭活的富硒-MNH-19749、有机硒、富硒-MNH-19749，MNH-19749解冻后放置于室温至其温度达到室温，后按照每只小鼠2×109CFU的剂量喂食，连续28天。
接种CT-26细胞量为1×106/只。接种当天收集细胞，细胞经PBS洗涤细胞一次后，用PBS重悬，并对细胞悬液进行计数。调整细胞浓度至1×107/mL，与预冷的Matrigel进行1：1混合均匀后注射0.1mL/只至小鼠皮下。接种肿瘤日设为D0天。
种瘤后小鼠持续进行喂食MNH-19749活菌、灭活的富硒-MNH-19749、有机硒、富硒-MNH-19749，直至实验结束，喂食方法同上。每两天量取种瘤大小。
肿瘤体积＝1/2×肿瘤长径2×肿瘤宽径。
计算种瘤体积。
结果见表6和图8，结果显示，溶媒处理组组肿瘤在D23达到约1766.57±254.4mm3，灭活的富硒-MNH-19749处理组的肿瘤在D23天肿瘤体积为约1383.74±196.8mm3，其生长速度低于溶媒处理组，MNH-19749处理组在D23肿瘤体积为约1232.04±188.2mm3，Se处理组在D23肿瘤体积为约1224.22±169.3mm3，Se-rich MNH-19749处理组在D23肿瘤体积为约837.50±112.2mm3，生长速率明显慢于溶媒处理组、Inactivated Se-rich MNH-19749处理组、MNH-19749处理组和se处理组。该实验证明MNH-19749可以明显降低结直肠癌的生长速度并且MNH-19749可以在有机硒存在的情况下明显降低结直肠癌的生长速度。
表6 MNH-19749和Se联用对结直肠癌(MC-38)的抑制作用
外周血中免疫分析。小鼠摘眼球取血后，滴加至含300ul EDTA2Na的2ml离心管内，将血液样本置于冰上，转移至动物房外。将采集的外周血细胞加入PBS重悬至4ml后，铺在2ml的Ficoll上，15ml离心管进行升5降0，600g,30min，18℃进行密度离心。离心后取白膜层，加入PBS定容至2ml洗去多余的Ficoll，500g 5min,离心去上清,重复进行一次。用1％的FBS-PBS配置染色液，Apc-Cy7 anti-mouse CD3，FITC anti-mouse CD4；PerCP-Cy5.5anti-mouse CD8a，每个样本加入抗体0.3ul，染色体积30ul，每10个样本多增加一个体积的抗体量，4℃，30min，避光染色后，加入1ml PBS重悬后，500g 5min离心去上清；用PBS重悬样本至150ul，上机检测。图9中显示Inactivated Se-richMNH-19749、MNH-19749、Se、Se-richMNH-19749均有助于提高外周血CD4+T细胞比例。图10中显示Inactivated Se-richMNH-19749、MNH-19749、Se、Se-rich MNH-19749均有助于有助于降低外周血CD8+T细胞比例。图11中显示Inactivated Se-richMNH-19749、MNH-19749、Se、Se-rich MNH-19749均有助于提高外周血CD4+T/CD8+T细胞比例。
以上实施例可说明，本发明将为肿瘤的临床治疗提供依据，本发明提供的富硒双歧杆菌具有更高的生物活性，除了具有Bifidobacterium的功能外，与其它硒源相比提高了富硒的转化效率，总硒含量高，并且制备方法简单易行，易于工业化生产，具有很高的推广价值和临床意义。本发明的实施将进一步提高提高肿瘤病人的生活质量，效降低肠炎复发率等。本发明的富硒微生物对癌症病人肿瘤免疫治疗的效果具有重要的影响，富硒微生物可以用于制备预防和/或***的组合物，从而实现肿瘤预防或治疗。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。

Claims (4)

1.一种药物组合物在制备用于抗肿瘤或者抑制肿瘤生长的药物中的应用，所述药物组合物包括富硒长双歧杆菌，所述长双歧杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No: 61113，保藏时间为2020年7月31日；所述富硒长双歧杆菌经过富硒发酵制得，所述硒为纳米硒，所述肿瘤为结直肠癌。
2.如权利要求1所述的药物组合物在制备用于抗肿瘤或者抑制肿瘤生长的药物中的应用，所述富硒长双歧杆菌为活菌或灭活菌。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物在制备用于抗肿瘤或者抑制肿瘤生长的药物中的应用，所述药物组合物还包括PD-1抗体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述富硒发酵的培养液包括组分A、组分B和组分C；
所述组分A包括以下浓度的组分：蛋白胨20~40g/L、酵母膏10~30g/L、葡萄糖50~70g/L、磷酸盐1~3g/L、吐温80 0.5~2g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5~2g/L、乙酸盐1~4g/L和纳米硒0.5~2g/L；
所述组分B包括以下重量份数的组分：氯化钙0.1~0.5份、硫酸镁0.25~0.5份、磷酸盐1~3份、钠盐8~16份和水900~1100份；
所述组分C包括以下重量份数的组分：维生素0.05~1.5份和乙醇10~30份；
所述组分A、所述组分B和所述组分C的体积比为3800~4200：38~42：0.1~0.4。
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