CN114231472B - 乳酸杆菌益生菌CGMCC No.23437及在制备降脂药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳酸杆菌益生菌菌株，所述菌株的保藏号为CGMCC No.23437，保藏日期为2021年9月17日，保藏分类命名为Lactobacillus xujianguonis，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所述菌株的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：1所示，本发明还公开了所述菌株在制备降脂、食品和保健品中的应用，所述菌株对动物无害，且具有调节降低血脂的功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种益生菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术
高脂血症(Hyperlipedemia，HLP)是指血清中胆固醇过高和(或)甘油三酯过高或(和)低密度脂蛋白胆固醇过高或(和)高密度脂蛋白胆固醇过低的一种全身性脂代谢紊乱性疾病。高脂血症是脑卒中、冠心病、心肌梗死、猝死的危险因素。此外，高脂血症也可引起高血压、糖耐量异常、糖尿病、肝功能衰竭等疾病。肝脏是脂类代谢的重要场所，是血脂和脂类蛋白合成及代谢的主要器官。高脂血症得不到改善就会形成脂肪肝。高脂血症患者的脂肪肝可在较短时间内发展为严重的肝损害。目前，降低血脂的主要方法是他汀类药物治疗，但是该药物有一定的副作用。
乳酸杆菌(Lacticacid bacteria)属乳酸杆菌科，是一群生活在机体内益于宿主健康的微生物。乳酸杆菌大量存在于酸乳及其他相关发酵乳制品中，国内外大量研究表明，乳酸杆菌具有减少血清中的胆固醇含量，降低心血管疾病发病率的功效。1977年，Mann等发现，非洲Masai人大量饮用由乳酸杆菌发酵的乳制品，其血清胆固醇的水平相对较低。同时发现经常饮用酸奶和发酵乳制品的美国人群中，其体内血清胆固醇的含量普遍较低。
本发明的目的是从只摄食植物的青海野生旱獭粪便中分离筛选具有良好降胆固醇功能的乳酸杆菌，并进一步开发其在制备降脂药物中的应用。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种乳酸杆菌益生菌菌株，所述益生菌菌株保藏号为CGMCC No.23437，保藏日期为2021年9月17日，建议的菌株分类命名为Lactobacillus xujianguonis，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。现该菌株已被命名为：***氏乳杆菌06-2（Lactobacillus xujianguonis 06-2）。
在一个优选的实施方案中，所述菌株的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
其次，本发明还提供了上述菌株在制备降脂药物中的应用。
在一个优选的实施方案中，所述降脂药物是指降低人血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、和/或升高低密度脂蛋白的药物。
在上述菌株在制备降脂药物中的应用的一个优选的实施方案中，所述降脂药物同时还可以作为肝病治疗药物使用。所述肝病可选择地是因脂代谢紊乱而引起的肝功能障碍。
在一个优选的实施方案中，所述肝功能障碍是指血清谷丙转氨酶、血清谷草转氨酶和/或肝脏丙二醛升高。
在另一个优选的实施方案中，所述肝功能障碍是指血清肝脏超氧化物歧化酶和/或肝脏谷胱甘肽过氧化物酶下降。
最后，本发明还提供了上述的菌株的药物组合物。
本发明是从野生旱獭粪便中分离纯化得到具有益生菌特性的乳酸杆菌，实验证明分离得到的乳酸杆菌对动物无害，且经动物实验确证具有调节血脂的功效。CGMCCNo.23437菌株能显著降低低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯，升高高密度脂蛋白的功能。摄入乳酸杆菌的大鼠体征正常，摄入五周结束实验后取胃肠肝脾做病理未见异常。无菌组织做细菌检测未见乳酸菌异位定植。
附图说明
图1.CGMCC No.23437菌株对高脂模型大鼠的血清总胆固醇（TC）的影响；
图2. CGMCC No.23437菌株对高脂模型大鼠的血清甘油三脂（TG）的影响；
图3. CGMCC No.23437菌株对高脂模型大鼠的血清高密度脂蛋白（HDL）的影响；
图4. CGMCC No.23437菌株对高脂模型大鼠的血清低密度度脂蛋白（LDL）的影响；
图5. CGMCC No.23437菌株对高脂模型大鼠的血清谷丙转氨酶（ALT）的影响；
图6. CGMCC No.23437菌株对高脂模型大鼠的血清谷草转氨酶（AST）的影响；
图7. CGMCC No.23437菌株对高脂模型大鼠的肝脏丙二醛（MDA）的影响；
图8. CGMCC No.23437菌株对高脂模型大鼠的肝脏超氧化物歧化酶（SOD）的影响；
图9. CGMCC No.23437菌株对高脂模型大鼠的肝脏谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1 .乳酸杆菌的分离、筛选和鉴定
1. 乳酸杆菌的分离
1）从保菌管中取出标本100μL，加入到预装900μL无菌PBS的EP管中，依次对样本进行梯度稀释，旱獭粪便标本浓度稀释至10-6倍；
2）取不同稀释度的样品100μL 涂布于MRS培养基上，放入培养箱中；
3）在37℃，厌氧环境中培养48h；
4）取出培养皿，用无菌接种环挑取不同形态特征的菌落，转接至新的MRS 固体培养基中进行纯化，37℃厌氧培养48h，连续转接3次，将纯化菌株在pH=3.5的液体MRS中培养，筛选耐酸生长优良的菌株可用于实验或冷冻保藏。
2. 菌种保藏
本实验室用含25%甘油的MRS培养基作为保菌液进行菌种的冷冻保藏，方法如下：
1）将容量为2mL的保菌管加入1.5ml 的无菌保菌液经121℃，15min高压灭菌处理后以备使用；
2）乳酸杆菌在MRS固体培养基上连续转接3次后，用无菌接菌环刮涂菌落；
3）将菌落转移到含无菌保菌液的保菌管中，混匀后-80℃冻存。
3. 菌落外观和菌体形态观察
保藏号为CGMCC No.23437的乳酸杆菌06-2属厌氧菌，在厌氧条件下生长良好，在MRS加5%的脱脂纤维羊血培养基上形成圆形、边缘不规则、中间***、表面粗糙的淡黄色菌落，直径约 1-1.2 mm；在有氧条件下不生长。在光学显微镜下，经革兰氏染色，菌体呈淡紫色，可出现首尾相接的排列方式。菌体在透射电镜下呈杆状，无芽胞、无鞭毛、无菌毛、无动力，直径约 0.7-1×2.5-4.28 µm。
4. 细菌总DNA 的提取
将单个菌落接种于MRS培养基上，37℃厌氧过夜培养，按照细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）说明书操作，提取DNA。
5. 菌株的生化鉴定方法
本研究采用法国梅里埃公司生产的“BioMerieux”细菌***生化鉴定卡API 50CH和 API ZYM 对菌株06- 2以及参考菌株进行碳水化合物酵解和酶促反应生化鉴定。
结果：根据生化鉴定，获得了一株生化特征为***氏乳杆菌的菌种，菌株保藏号为CGMCC No.23437，保藏日期为2021年9月17日，建议的菌株分类命名为Lactobacillus xujianguonis，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。现该菌株已被命名为：***氏乳杆菌06-2（Lactobacillus xujianguonis 06-2）。
6. 细菌通用引物16S rRNA PCR 扩增
细菌16S rRNA 鉴定：提取细菌基因组DNA，扩增乳酸杆菌通用引物16S rDNA PCR产物测序，序列在NCBI上进行BLAST比对，进行初步鉴定。
本实验所用的细菌16S rRNA PCR 扩增的引物以及PCR 反应的条件如下所述，实验全部用50μL的PCR体系。通过对待测乳酸杆菌通用引物16S rRNA PCR产物测序结果在NCBI上进行BLAST比对，鉴定。结果提示CGMCC No.23437菌株的16S rRNA序列与***氏乳杆菌（Lactobacillus xujianguonis）CGMCC 1.13855的序列一致性为99.44%。CGMCCNo.23437属于***氏乳杆菌。
通用引物16S rRNA PCR 扩增条件
引物序列：
27F， 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'
1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'
反应体系（50μl）
扩增条件
实施例2 . ***乳杆菌CGMCC No.23437对大鼠血清的血脂降低功能
将24只约200克体重的雌性SD大鼠分别随机分三组，一组给与正常维持饲料，两组给予高脂饲料（胆固醇1%，猪油10%，0.2胆酸盐，10%蛋黄粉）。两组高脂饲料组，在喂食一周后，一组隔天经口给予109CFU CGMCC No.23437乳酸杆菌菌液，一组隔天给予生理盐水，共五周终止实验，检测血清的血脂水平，来评价***氏乳杆菌CGMCC No.23437对脂代谢紊乱模型的预防干预效果。
图1显示CGMCC No.23437对高脂模型大鼠的血清总胆固醇（TC）的影响。CGMCCNo.23437干预组（即06-2干预组）的血清TC平均含量为2.11±0.09mmol/L，显著低于高脂模型组2.46±0.09mmol/L（p<0.001）；高脂模型组的血清TC平均含量为2.46±0.09mmol/L，显著高于正常对照组1.41±0.10mmol/L（p<0.001）。
图2显示CGMCC No.23437对高脂模型大鼠的血清甘油三酯（TG）的影响。CGMCCNo.23437干预组（即06-2干预组）的血清TG平均含量为2.78±0.24mmol/L，显著低于高脂模型组3.10±0.08mmol/L（p<0.01）；高脂模型组的血清TG平均含量为3.10±0.08mmol/L，显著高于正常对照组1.86±0.08mmol/L（p<0.001）。
图3显示CGMCC No.23437对高脂模型大鼠的血清高密度度脂蛋白（HDL）的影响。CGMCC No.23437干预组（即06-2干预组）的血清HDL平均含量为2.29±0.42mmol/L，显著高于高脂模型组1.53±0.13mmol/L（p<0.001）；高脂模型组的血清HDL平均含量为1.53±0.13mmol/L，显著低于正常对照组3.14±0.31mmol/L（p<0.001）。
图4显示CGMCC No.23437对高脂模型大鼠的血清低密度度脂蛋白（LDL）的影响。CGMCC No.23437干预组（即06-2干预组）的血清LDL平均含量为2.68±0.22mmol/L，显著低于高脂模型组3.00±0.25mmol/L（p<0.05）；高脂模型组的血清LDL平均含量为3.00±0.25mmol/L，显著高于正常对照组1.72±0.19mmol/L（p<0.001）。
上述结果表明，CGMCC No.23437乳杆菌菌株具有显著降低血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和升高高密度脂蛋白的作用，有降低血脂功效。
摄入CGMCC No.23437乳杆菌的大鼠表现正常，摄入五周结束实验后取胃肠肝脾做病理未见异常。无菌组织做细菌检测未见乳酸菌异位定植。
实施例3 . ***氏乳杆菌CGMCC No.23437对大鼠肝脏功能的保护作用
将24只约200克体重的雌性SD大鼠分别随机分三组，一组给与正常维持饲料，两组给予高脂饲料（胆固醇1%，猪油10%，0.2胆酸盐，10%蛋黄粉）。两组高脂饲料组，在喂食一周后，一组隔天经口给予109CFU CGMCC No.23437乳酸杆菌菌液，一组隔天给予生理盐水，共五周终止实验，检测血清的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和抗氧化酶水平，来评价***氏乳杆菌CGMCC No.23437对脂代谢紊乱模型造成的肝脏功能损伤的预防干预效果。
图5显示CGMCC No.23437对高脂模型大鼠的血清谷丙转氨酶（ALT）的影响。CGMCCNo.23437干预组（即06-2干预组）的血清ALT平均含量为1.41±0.09ng/mL，显著低于高脂模型组1.66±0.10ng/mL（p<0.001）；高脂模型组的血清ALT平均含量为1.66±0.10ng/mL，显著高于正常对照组0.94±0.09ng/mL（p<0.001）。
图6显示CGMCC No.23437对高脂模型大鼠的血清谷草转氨酶（AST）的影响。CGMCCNo.23437干预组（即06-2干预组）的血清AST平均含量为2.11±0.32ng/mL，显著低于高脂模型组2.70±0.15ng/mL（p<0.001）；高脂模型组的血清AST平均含量为2.70±0.15ng/mL，显著高于正常对照组1.53±0.11ng/mL（p<0.001）。
图7显示CGMCC No.23437对高脂模型大鼠的肝脏丙二醛（MDA）的影响。CGMCCNo.23437干预组（即06-2干预组）的肝脏MDA平均含量为3.62±0.37nmol/mL，显著低于高脂模型组4.45±0.25nmol/mL（p<0.001）；高脂模型组的肝脏MDA平均含量为4.45±0.25nmol/mL，显著高于正常对照组2.54±0.48nmol/mL（p<0.001）。
图8显示CGMCC No.23437对高脂模型大鼠的肝脏超氧化物歧化酶（SOD）的影响。CGMCC No.23437干预组（即06-2干预组）的肝脏SOD平均含量为1.04±0.16ng/mL，显著高于高脂模型组0.86±0.05ng/mL（p<0.01）；高脂模型组的肝脏SOD平均含量为0.86±0.05ng/mL，显著低于正常对照组1.32±0.07ng/mL（p<0.001）。
图9显示CGMCC No.23437对高脂模型大鼠的肝脏谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的影响。CGMCC No.23437干预组（即06-2干预组）的肝脏GSH-Px平均含量为6.06±0.81ng/mL，显著高于高脂模型组4.32±0.48ng/mL（p<0.001）；高脂模型组的肝脏GSH-Px平均含量为4.32±0.48ng/mL，显著低于正常对照组9.00±0.46ng/mL（p<0.001）。
上述结果表明，CGMCC No.23437乳杆菌菌株具有显著降低血清谷丙转氨酶、血清谷草转氨酶和肝脏丙二醛的作用，同时升高了肝脏超氧化物歧化酶和肝脏谷胱甘肽过氧化物酶的作用，具有保护肝脏功能的功效。
摄入CGMCC No.23437乳杆菌的大鼠表现正常，摄入五周结束实验后取胃肠肝脾做病理未见异常。无菌组织做细菌检测未见乳酸菌异位定植。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> 乳酸杆菌益生菌CGMCC No.23437及在制备降脂药物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1529
<212> DNA
<213> Lactobacillus xujianguonis
<400> 1
agagtttcat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
gagcagaact aacagattta cttcggtaat gacgtttcgg acgcgagcgg cggatgggtg 120
agtaacacgt gggtaacctg cccttaagtc tgggatacca cttggaaaca ggtgctaata 180
ccggataaca actagtgctg catggcacta gcttaaaagg cggcgtaagc tgtcgctaaa 240
ggatggaccc gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcgacgatgc 300
atagccgagt tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac 360
gggaggcagc agtagggaat cttccacaat gggcgaaagc ctgatggagc aacgccgcgt 420
gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttgg tgaagaagga tagaggtagt 480
aactggcctt tatttgacgg taatcaacca gaaagtcacg gctaactacg tgccagcagc 540
cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg 600
cggagaaata agtctgatgt gaaagccctc ggcttaaccg aggaagtgca tcagaaactg 660
tttttcttga gtgcagaaga ggagagtgga actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat 720
atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tctctggtct gtaactgacg ctgaggctcg 780
aaagcatggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg 840
ctaagtgttg ggaggtttcc gcctctcagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct 900
ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg 960
gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catctggtgc 1020
aaacctaaga gattaggcgt tcccttcggg gacaccaaga caggtggtgc atggctgtcg 1080
tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgttattag 1140
ttgccagcat taagttgggc actctaatga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1200
ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatgggca 1260
gtacaacgag gagcgaacct gtgaaggcaa gcgaatctct gaaagctgtt ctcagttcgg 1320
actgtaggct gcaactcgcc tacacgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcacg 1380
ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg gaagtctgca 1440
atgcccaaag ccggtggcct aaccttcggg aaggagccgt ctaaggcagg gcagatgact 1500
ggggtgaagt cgtaacaagg taaccgtaa 1529
Claims (7)
1.一种乳酸杆菌益生菌菌株，所述益生菌的保藏号为CGMCC No.23437，保藏日期为2021年9月17日，保藏分类命名为Lactobacillus xujianguonis，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的乳酸杆菌益生菌株，其特征在于，所述菌株的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1或2所述的菌株在制备降脂药物中的应用，其特征在于，所述降脂药物是指降低人血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、和/或升高高密度脂蛋白的药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述降脂药物同时还是肝病治疗药物，所述肝病是因脂代谢紊乱而引起的肝功能障碍。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肝功能障碍是指血清谷丙转氨酶、血清谷草转氨酶和/或肝脏丙二醛升高。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肝功能障碍是指血清肝脏超氧化物歧化酶和/或肝脏谷胱甘肽过氧化物酶下降。
7.一种含有权利要求1或2所述的菌株的药物组合物。
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