CN108220206B - 一种长双歧杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长双歧杆菌及其应用，属于为生物技术领域。本发明提供的长双歧杆菌YS108R菌株，具有产粘性胞外多糖的特征，对DSS诱导的小鼠结肠炎模型具有明显的改善作用。该菌株具有较好的耐受模拟胃肠液的能力，能够显著降低DSS诱导期间小鼠的疾病活动指数，对结肠组织具有有效的保护作用。并且本发明所述的长双歧杆菌YS108R分离自健康人的肠道菌群，对人体无毒副作用，相对传统药物治疗具有一定的优势。该菌株可用于制作益生菌菌粉、发酵乳等，具有广阔的市场前景。

Description

一种长双歧杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种长双歧杆菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

炎症性肠病(IBD)每年影响着上百万人的健康，严重影响着患者的生活质量。IBD是一类肠道慢性炎症，具有反复发作的特点，主要包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)两种表型。目前，IBD的发病机制还尚未明确，但越来越多的研究表明，IBD的发病与易感基因、环境因素、免疫应答紊乱、肠道菌群失调、肠道屏障损伤等因素具有相关性。肠道菌群是人体重要组成部分，肠道微生物和肠道粘膜免疫之间的相互作用影响着免疫反应的启动和调节。肠道菌群的紊乱可能导致免疫反应过度或失调，从而造成肠道粘膜的损伤。随着高通测序技术的普及和生物信息学分析手段的发展，越来越来多的研究结果表明，炎症性肠病患者普遍存在肠道微生态***的失调以及肠道菌群多样性的降低。

人肠道菌群是最为复杂的微生态***之一，人体肠道中定植有数量巨大的微生物，这些微生物与宿主之间相互影响、共同进化，与人体健康具有密切的联系。大量的研究结果表明，肠道微生物影响宿主肠道细胞的增值和免疫***的发育，它们与许多人类疾病相关，例如肥胖、炎症性肠病(IBD)、肠道病原菌感染、肝硬化、糖尿病等。双歧杆菌作为人类肠道菌群中的优势菌，它与宿主之间存在共生关系，对于维持正常肠道菌群和人体健康具有重要作用。因此，一些特定的双歧杆菌菌株可以作为益生菌，用于某些肠道疾病的干预治疗。微生物胞外多糖(EPS)是由某些微生物合成并分泌到胞外的一类大分子聚合物，它可以提高菌体对胃肠道环境的耐受能力，保护菌体免受宿主免疫***的影响。一些双歧杆菌产生的胞外多糖可以调节宿主的免疫反应，降低宿主的炎症水平，对结肠炎起到防治作用。目前用于治疗炎症性肠病的药物主要包括抑炎类药物、免疫抑制剂以及抗生素等，这些药物通常只能缓解疾病症状，并不能达到治疗的目的，且长期使用可能导致副作用，例如过敏和肝脏疾病。而双歧杆菌作为健康人肠道中的共生菌，通过与肠道免疫***的相互作用，对宿主具有一定的免疫调节作用，且对人体没有毒副作用。胞外多糖是双歧杆菌对宿主产生免疫调节作用的重要机制，不同微生物产生的胞外多糖由于单糖组成、分子结构的不同，其功能也存在差异。有研究表明，黏性胞外多糖一般具有较大的分子量，且具有抑制免疫反应的作用，而低分子量的胞外多糖通常可以促进免疫反应。因此，筛选一株可以合成黏性胞外多糖的双歧杆菌，对于开发用于治疗结肠炎或其他肠道炎症疾病的药物具有重要意义和广阔前景。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种长双歧杆菌，所述长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum subsp.longum)为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum subsp.longum)YS108R，于2018年1月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60310。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌YS108R在制备有缓解结肠炎的作用的食品和药物上的应用。

本发明的第二个目的是提供一种菌粉及其制备方法，主要步骤如下：将长双歧杆菌YS108R活化后，按2～5％的接种量接种到MRS培养基中，35-39℃厌氧培养24h～36h，8000-1200tmp离心20～30min，收集菌泥，用生理盐水清洗2～3次，按菌泥重量的1～3倍添加冻干保护剂，混合均匀后进行真空冷冻干燥，最后得到冻干菌粉。

在本发明的一种实施方式中，所述MRS培养基是加了半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述MRS培养基的组分为胰蛋白胨8-10g、牛肉膏8-10g、酵母粉4-6g、葡萄糖18-22g、无水乙酸钠1.5-2.5g、七水硫酸镁0.4-0.6g、一水硫酸锰0.25-0.30g、柠檬酸氢二铵1.5-2.5g、三水磷酸氢二钾2.4-2.8g、Tween80 1-2mL、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.6g，加蒸馏水至1L，pH为7.0～7.2。

在本发明的一种实施方式中，所述胱氨酸盐酸盐的添加量为按质量分数0.02-0.08％。

在本发明的一种实施方式中，所述胱氨酸盐酸盐的添加量为按质量分数0.05％。

在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂由脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖和水组成。

在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂成分为100～120g/L脱脂乳粉、100～150g/L海藻糖、150～200g/L蔗糖，余量的水。

本发明的第三个目的是提供一种发酵乳及其制作方法，制作步骤如下：

(1)发酵乳原料的准备：将乳粉、蔗糖、酵母粉分别按100～150g/L、50～80g/L、1～2g/L的比例与水混匀，然后65～75℃杀菌处理20-40min；

(2)将发酵剂0.1～1‰添加到发酵乳原料中，37～39℃发酵4～8h，制得发酵乳制品；所述发酵剂由长双歧杆菌YS108R、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组成。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂中的长双歧杆菌YS108R、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按体积比为1-8:1:1.

本发明有益的技术效果在于：

(1)本发明所述的长双歧杆菌YS108R分离自健康人的肠道菌群，该菌株具有较好的耐受模拟胃肠液的能力，且对人体无毒副作用。相对于用于治疗结肠炎的传统药物具有一定的优势。该菌株可用于制作益生菌菌粉、发酵乳等，具有广阔的市场前景。

(2)发明所述的长双歧杆菌YS108R能够显著降低DSS诱导结肠炎期间小鼠的疾病活动指数，与模型组小鼠相比，YS108R干预组小鼠的结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)的水平显著降低，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达水平也显著降低，紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin等与肠道屏障相关的基因表达水平显著高于模型组，粘蛋白基因MUC-2的表达水平也明显较高。结肠病理切片的观察结果也表明，YS108R干预组小鼠的结肠组织结构较完整，无严重的损伤。

生物材料保藏

一种长双歧杆菌(Bifidobacterium longum subsp.longum)YS108R，于2018年1月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60310。

附图说明

图1为本发明菌株的透射电镜观察结果。

图2为各组小鼠DSS造模期间的DAI指数变化。

图3为各组小鼠结肠组织的病理切片。

图4为各组小鼠结肠组织中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表达水平。

图5为各组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1基因的表达水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限如此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域常规方法和条件。

MRS培养基的成分：胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、无水乙酸钠2g、七水硫酸镁0.5g、一水硫酸锰0.25g、柠檬酸氢二铵2g、三水磷酸氢二钾2.6g、Tween801mL、半胱氨酸盐酸盐0.5g，加蒸馏水至1L，pH为7.0～7.2。

实施例1：长双歧杆菌YS108R的分离方法

长双歧杆菌的分离方法，主要步骤如下：

(1)培养基的配制：添加了0.05％半胱氨酸盐酸盐和100mg/L莫匹罗星的MRS培养基；

(2)将采集的健康人的粪便样本梯度稀释后，选取适当的3个梯度稀释液，在上述培养基的固体平板上进行涂布，将平板倒置于37℃厌氧培养箱中培养48h；

(3)挑取具有良好拉丝效果的菌落进行划线纯化；

(4)挑取纯化后的菌落接种到液体培养基中厌氧培养24～48h，收集发酵液用于测定胞外多糖，同时保留少量发酵液，离心收集菌体后，用于提取基因组、PCR和16S rDNA测序；

(5)胞外多糖的测定：取10mL发酵液在4℃下10000g离心15min，收集上清液，经三氯乙酸沉淀法除去蛋白成分后，与三倍体积的冰乙醇混合均匀，4℃静止过夜，然后在4℃下12000g离心10min，弃去上清液，沉淀用截留分子量为8000～14 000Da的透析袋透析48h后，冻干得到粗多糖。采用苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量，从而筛选出一株高产黏性胞外多糖的菌株。

(6)经生理生化鉴定和16S rDNA测序分析，该菌株鉴定为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum subsp.longum)，菌株号为YS108R。生理生化试验结果如表1所示，16S rDNA测序结果如SEQ ID NO.1所示。

表1菌株YS108R生理生化试验结果

注：其中+表示可以在以该碳水化合物为唯一碳源的培养基中生长并产酸，-表示不可以在以该碳水化合物为唯一碳源的培养基中生长并产酸。

实施例2：长双歧杆菌YS108R的性质测定

长双歧杆菌生物学特征的测定：

(1)菌体特征的观察方法：挑取少量菌落涂在载玻片上，进行革兰氏染色，并于光学显微镜下观察。菌体特征：革兰氏染色呈阳性，在pH 3.0～8.0环境下生长良好，不形成孢子，菌体约0.5～1.5μm×2～8μm，呈杆状、棒状或分叉的Y形，透射电镜观察结果显示菌体表面有明显的胞外多糖(附图1)。

(2)菌落特征的观察方法：将菌株在MRS固体培养基上划线，培养至长出单菌落后，观察其菌落形态。

菌落特征：在MRS固体培养基上形成圆形、凸起的菌落，乳白色，不透明，表面光滑，菌落直径为1～3mm，有拉丝效果。

(3)液体培养特征：在MRS液体培养基培养过程中，菌体均匀悬浮在培养中，很少沉积在底部。

(4)模拟胃液中的存活率的测定：

模拟肠液中的存活率的测定方法：人工模拟胃肠液需新鲜配制。将胃蛋白酶溶于pH 3.0的PBS中使其终浓度为3g/L，经0.22μm滤膜过滤后制备成模拟胃液。将胰蛋白酶溶于pH 8.0的PBS中使其终浓度为1g/L，经0.22μm滤膜过滤后制备成模拟肠液。将培养好的双歧杆菌在4℃下以6000rpm离心10min，收集菌泥，用0.85％生理盐水重悬后，在模拟胃液(pH3.0)中将其菌液密度调节为1×10⁹CFU/mL。混匀后将其放置于37℃培养2h后计活菌数。取1mL模拟胃液处理过的菌液加入至9mL模拟肠液(pH 8.0)中，混匀后于37℃培养，4h后检测活菌数。处理后的活菌数与初始活菌数比值的百分比为存活率。

在模拟胃液中的存活率为86.33％，在模拟肠液中的存活率为79.38％

(5)胞外多糖的测定方法：取10mL发酵液在4℃下10000g离心15min，收集上清液，经三氯乙酸沉淀法除去蛋白成分后，与三倍体积的冰乙醇混合均匀，4℃静止过夜，然后在4℃下12000g离心10min，弃去上清液，沉淀用截留分子量为8000～14 000Da的透析袋透析48h后，冻干得到粗多糖。采用苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量。

在MRS液体培养基中培养时，胞外多糖产量为150mg/L。

实施例3：长双歧杆菌YS108R对DSS诱导结肠炎小鼠症状的缓解作用

小鼠病理学实验，主要步骤如下：

(1)准备雄性C57小鼠40只，随机分为5组：正常对照组(Control)、模型组(Model)、长双歧杆菌YS108R干预组(YS108R+DSS)、长双歧杆菌C11A10B干预组(C11A10B+DSS)和商业菌株乳双歧杆菌BB12干预组(BB12+DSS)，每组8只，实验方案和各组小鼠的处理方式如表2所示。

(2)将上述菌株分别培养24h后，离心收集菌体，用生理盐水重悬菌体，并调整活菌数为5×10⁹CFU/mL，制成菌悬液，用于灌胃小鼠，灌胃剂量为0.2mL。第14天时，葡聚糖硫酸钠(DSS)用生理盐水配成浓度为2.5％的溶液，代替饮用水让小鼠饮用，用于造模，每两天配一次。DSS造模期间(15～21天)，每天记录小鼠的体重、粪便状态、粪便隐血，用于计算疾病活动指数(DAI)，评分标准如表3所示。

表2小鼠处理方案

表3DAI评分标准

DSS造模过程中各组小鼠的疾病活动指数如附图2所示。从造模第二天开始，除正常组小鼠外，其余组小鼠的DAI指数开始上升，模型组DAI指数上升最快。造模结束时，YS108R干预组的DAI指数显著低于模型组，而C11A10B干预组和BB12干预组的DAI指数介于YS108R干预组和模型组之间，但与模型组无显著差异，说明本发明的菌株YS108R对DSS诱导的结肠炎小鼠模型有一定的改善效果。

实施例4：长双歧杆菌YS108R对结肠炎小鼠结肠组织的保护作用

DSS诱导后，小鼠的结肠组织会出现明显的损伤，包括炎症细胞浸润、隐窝和腺体结构的破坏等。将实施例2中进过处理各组小鼠结肠组织的病理切片如图3所示，可以看出YS108R干预组的结肠组织结构与正常组(Control)相似，腺体和隐窝较完整，杯状细胞没有明显减少。而模型组结肠的粘膜层结构几乎完全破坏，炎症浸润严重，隐窝和腺体结构消失，杯状细胞几乎完全消失。C11A10B干预组的结肠组织破还严重，与模型组接近。而BB12干预组的结肠组织相对模型组有一定改善，但仍然存在明显的炎症浸润，隐窝结构也破坏严重。说明YS108R对小鼠结肠组织有很好的保护作用。

实施例5：长双歧杆菌YS108R对结肠炎小鼠结肠组织中炎症因子表达水平的影响

各组小鼠结肠组织中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表达水平如附图4所示。YS108R干预组和的TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表达水平都明显低于模型组，而C11A10B干预组的TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表达水平与模型无显著差异，说明YS108R菌株可以有效缓解DSS诱导结肠炎模型的炎症水平。

实施例6：长双歧杆菌YS108R对结肠炎小鼠结肠组织中紧密连接蛋白表达水平的影响

紧密连接蛋白是组成肠道屏障的重要部分，对于维持肠上皮屏障功能的完整性具有重要作用。各组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1基因的表达水平如附图5所示。YS108R干预组的ZO-1和Claudin-1基因的表达水平都明显高于模型组，而BB12干预组的ZO-1和Claudin-1基因的表达水平甚至低于模型组，说明长双歧杆菌YS108R对于维持结肠屏障结构具有较好的效果。

结合实施例2～6中的结果，可以表明，长双歧杆菌YS108R可以通过抑制炎症因子表达和维持结肠屏障结构从而改善DSS诱导的结肠炎。

实施例7：长双歧杆菌YS108R冻干菌粉的制作

长双歧杆菌YS108R冻干菌粉的制备方法，具体步骤如下：

(1)培养基的配制：添加了0.05％半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基；

(2)保护剂的配制：120g/L脱脂乳粉、100g/L海藻糖、150g/L蔗糖和余量的水；

(3)将所述菌株连续活化3代后，按2％的接种量接种到上述培养基中，37℃厌氧培养24h，8000g离心30min，收集菌泥，用生理盐水清洗2次，按菌泥重量的3倍添加冻干保护剂，混合均匀后进行真空冷冻干燥，最后将冻干得到的菌粉真空包装。制得的菌粉的活菌浓度可达1×1010CFU/g，可作为发酵剂用于发酵乳的制作。

实施例8：长双歧杆菌YS108R和市售酸奶发酵剂复合发酵乳的制作

(1)发酵乳原料的准备：将乳粉、蔗糖、酵母粉分别按120g/L、50g/L、1g/L的比例与水混匀，然后70℃杀菌处理30min。

将实施例5中所述菌粉以0.5‰添加到上述发酵乳原料中，同时添加市售酸奶发酵剂(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)，37℃发酵6～8h，制得发酵乳制品。所得发酵乳具有良好的感官和理化性质(如表4所示)，口感细腻、粘滑，无不良味道，风味与传统发酵无明显差异。

表4混合发酵乳的理化指标和感官评价结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 一种长双歧杆菌及其用途

<120> 江南大学

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1514

<212> DNA

<213> 双歧杆菌（Bifidobacterium）

<400> 1

aaggaggtga tccagccgca ccttccggta cggctacctt gttacgactt agtcccaatc 60

acgagcctca ccttagacgg ctccatccca caaggggtta ggccaccggc ttcgggtgct 120

gcccactttc atgacttgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgcat tcaccgcgac 180

gttgctgatt cgcgattact agcgactccg ccttcacgca gtcgagttgc agactgcgat 240

ccgaactgag accggttttc agggatccgc tccgcgtcgc cgcgtcgcat cccgttgtac 300

cggccattgt agcatgcgtg aagccctgga cgtaaggggc atgatgatct gacgtcatcc 360

ccaccttcct ccgagttaac cccggcggtc ccccgtgagt tcccggcata atccgctggc 420

aacacggggc gagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct 480

gacgacgacc atgcaccacc tgtgaacccg ccccgaaggg aagccgtatc tctacgaccg 540

tcgggaacat gtcaagccca ggtaaggttc ttcgcgttgc atcgaattaa tccgcatgct 600

ccgccgcttg tgcgggcccc cgtcaatttc tttgagtttt agccttgcgg ccgtactccc 660

caggcgggat gcttaacgcg ttagctccga cacggaaccc gtggaacggg ccccacatcc 720

agcatccacc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct 780

ttcgctcctc agcgtcagta acggcccaga gacctgcctt cgccattggt gttcttcccg 840

atatctacac attccaccgt tacaccggga attccagtct cccctaccgc actcaagccc 900

gcccgtaccc ggcgcggatc caccgttaag cgatggactt tcacaccgga cgcgacgaac 960

cgcctacgag ccctttacgc ccaataattc cggataacgc ttgcacccta cgtattaccg 1020

cggctgctgg cacgtagtta gccggtgctt attcaacggg taaactcact ctcgcttgct 1080

ccccgataaa agaggtttac aacccgaagg cctccatccc tcacgcggcg tcgctgcatc 1140

aggcttgcgc ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgta 1200

tctcagtccc aatgtggccg gtcgccctct caggccggct acccgtcgaa gccacggtgg 1260

gccgttaccc cgccgtcaag ctgataggac gcgaccccat cccataccgc gaaagctttc 1320

ccagaagacc atgcgatcaa ctggagcatc cggcattacc acccgtttcc aggagctatt 1380

ccggtgtatg gggcaggtcg gtcacgcatt actcacccgt tcgccactct caccaccaag 1440

caaagcctga tggatcccgt tcgacttgca tgtgttaagc acgccgccag cgttcatcct 1500

gagccagaat cgaa 1514

Claims (10)

1.一种长双歧杆菌，其特征在于，所述长双歧杆菌为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum subsp.longum)YS108R，于2018年1月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No.60310。

2.一种菌粉的制备方法，其特征在于，所述方法的主要步骤如下：将权利要求1所述长双歧杆菌YS108R活化后，按2～5％的接种量接种到MRS培养基中，35-39℃厌氧培养24h～36h，8000g离心20～30min，收集菌泥，用生理盐水清洗2～3次，按菌泥重量的1～3倍添加冻干保护剂，混合均匀后进行真空冷冻干燥，最后得到冻干菌粉。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述MRS培养基是加了半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸盐酸盐的添加量为按质量分数0.02-0.08％。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冻干保护剂由脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖和水组成。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述冻干保护剂成分为100～120g/L脱脂乳粉、100～150g/L海藻糖、150～200g/L蔗糖，余量的水。

7.应用权利要求2-6任一所述方法制备得到的菌粉。

8.权利要求7所述的菌粉在制备有缓解结肠炎的作用的食品和药物方面的应用。

9.一种发酵乳，其特征在于，所述制作步骤如下：

(1)发酵乳原料的准备：将乳粉、蔗糖、酵母粉分别按100～150g/L、50～80g/L、1～2g/L的比例与水混匀，然后65～75℃杀菌处理20-40min；

(2)将发酵剂按0.1～1‰的接种量添加到发酵乳原料中，37～39℃发酵4～8h，制得发酵乳制品；所述发酵剂由长双歧杆菌YS108R、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组成；

所述长双歧杆菌YS108R的保藏编号为GDMCC No.60310。

10.根据权利要求9所述的发酵乳，其特征在于，所述发酵剂中的长双歧杆菌YS108R、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按体积比为1-8:1:1。

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