CN110577919B - 一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种。所述的动物双歧杆菌乳亚种命名为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)HCS04‑001，该菌株已于2019年07月24日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.18292。本发明所述的动物双歧杆菌乳亚种是一株耐酸能力强、耐胆盐能力强，耐受胃、肠液能力强、耐热性好的动物双歧杆菌乳亚种。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一株耐酸能力强、耐胆盐能力强，耐受胃、肠液能力强、耐热性好的动物双歧杆菌乳亚种。
背景技术
国家***于2010年将乳双歧杆菌列入《可用于食品的菌种名单》，2011年将乳双歧杆菌列入《可用于婴幼儿食品的菌种名单》。双歧杆菌属是定植于人体肠道内的有益菌，是健康人群肠道内的优势菌群。乳双歧杆菌是放线菌科双歧杆菌属动物双歧杆菌乳亚种，革兰氏阳性，无鞭毛，不运动，不形成芽孢，专性厌氧。双歧杆菌菌体形态各异，较典型的有V形、Y形、勺状、曲状。双歧杆菌属主要存在于人类和哺乳动物的肠道内，此外，有研究发现口腔中亦有双歧杆菌存在。
动物双歧杆菌乳亚种具有调节肠道菌群，防治肠道相关疾病、降胆固醇、增强机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射等生理功能，其主要机理有：1、动物双歧杆菌乳亚种细胞壁上的磷壁酸与肠道黏膜上皮细胞经特异性结合，使其粘附于肠道黏膜表面，进而形成具有保护作用的生物菌膜，抑制致病菌粘附在肠道粘膜上；2、有研究证实在胆盐水解酶存在的情况下，通过与非共轭胆酸共沉淀可去除胆固醇；3、双歧杆菌可激活机体免疫，影响肠道内微生物的生理代谢活动并减少肠道内致癌物质（脱氧胆酸和石胆酸）的活性和诱导抗癌物质（醋酸和乳酸）的形成及表达。
动物双歧杆菌乳亚种已渐渐成为微生态制剂研究的一大热点，可应用于食品、畜禽养殖、医疗保健和基因工程等领域。在食品应用中，大多数以益生菌粉剂的产品剂型进行冲调食用，且常温贮存。然而在冲调食用过程或日常贮存中，较高的冲调水温或夏季高温环境情况下部分活菌会失活，只有耐热性较好的益生菌在较高温的环境下会更多的以活菌的状态进入人体，高温条件时保持较高的存活性。另外，菌体通过人体胃肠液并发挥益生功能的关键因素是其耐酸耐胆盐能力及耐受胃肠液的能力。因此，对获得耐热性好的菌体、增强菌体对胃酸、胆盐及胃肠液的耐性的研究具有重要意义。
发明内容
针对现有技术所述的动物双歧杆菌乳亚种耐热性差、耐酸和胆盐及胃肠液能力较差的问题，本发明的目的是提供一株耐热性好、耐酸和胆盐能力强、耐胃肠液能力强的动物双歧杆菌乳亚种菌株。进一步，本发明涉及提供包含该动物双歧杆菌乳亚种菌株或其培养液的组合物。
一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种，所述的动物双歧杆菌乳亚种命名为动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001，该菌株已于2019年07月24日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.18292。
一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种的培养方法，包括如下步骤：
1）一级培养：将保藏于-80℃的菌株冻存管取出，经解冻后，将1mL的菌悬液接种于10mL的改良乳酸菌培养基中，39℃静置培养；用接种环蘸取微量冻存管残存液体，于平板划线，37℃培养后，观察菌落；挑取少量菌落涂片，染色，观察显微镜下菌体；
2）二级培养：将一级培养得到的菌悬液按5%的接种量转接于改良乳酸菌培养基中，39℃静置培养17小时；
3）三级培养：将二级培养得到的菌悬液按5%的接种量转接于改良乳酸菌培养基中，39℃静置培养17小时；
4）将三级培养液进行离心，弃上清液，擦干离心管壁残留的上清液，收集菌泥。
上述的一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种的培养方法，步骤1）、步骤2）和步骤3）中所述的改良乳酸菌培养基的配方为：L-苹果酸 2~4g/L，低聚果糖 2~4g/L，酵母粉 10~20g/L，葡萄糖 10~20g/L，酵母蛋白胨 10~20g/L。
上述的一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种的培养方法，步骤1）、步骤2）和步骤3）中所述的改良乳酸菌培养基的配方为：L-苹果酸3g/L，低聚果糖2g/L，酵母粉15g/L，葡萄糖15g/L，酵母蛋白胨18g/L。
上述的一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种的培养方法，步骤1）中，所述的39℃静置培养的时间为17h。
上述的一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种的培养方法，步骤1）中，所述的37℃静置培养的时间为24-48h。
本发明所述的动物双歧杆菌乳亚种，所述菌株命名为动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001，该菌株已于2019年07月24日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.18292。
本发明所述的动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001分离自顺产的健康18天月龄的男婴粪便中，是一株耐消化道逆环境能力强的动物双歧杆菌乳亚种，具有双歧杆菌的典型特征，革兰氏阳性，厌氧，无芽孢，菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，中间有凸起，边缘整齐，直径约2mm；细胞呈杆状，呈“V”字型。其理化特征是：接触酶阴性，氧化酶阴性，上述动物双歧杆菌乳亚种CGMCC No.18292的细胞形态和理化实验结果详见表1。
表1 动物双歧杆菌乳亚种CGMCC No.18292的细胞形态和理化实验结果
通过在美国生物工程信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI）查阅国际相关的基因库，将本发明的动物双歧杆菌乳亚种CGMCCNo.18292的16S rDNA序列与GenBank提交菌株序列相似性比较，鉴定菌株HCS04-001为动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis），比较结果见表2。
表2 动物双歧杆菌乳亚种CGMCC No.18292的16S rDNA序列与GenBank提交菌株
序列相似性比较
上述动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001具有以下优点：
1.本发明的动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001分离筛选自顺产的健康18天月龄的男婴粪便中，确保其来源的安全性，而且更利于定植在婴幼儿的肠道中。
2.本发明的动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001具有较好的耐热性。当用于益生菌粉剂产品冲调食用时，能够耐受较高的冲调水温而保持较好的存活率进入人体。另外，在贮存、运输过程中能够耐受较高的环境温度。本发明的动物双歧杆菌乳亚种菌株于改良乳酸菌培养基中45℃静置培养17小时后，存活率仍能保持在93.04%。
3.本发明的动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001具有优秀的耐酸性。当摄入作为益生菌的乳酸菌如动物双歧杆菌乳亚种，能发挥乳酸菌特有的效果，需要更高肠道抵达率，即在胃酸分泌而pH值低的胃环境中生存率要高。已知胃处于空腹时pH值约为1.2~2，进食后pH值约为2~3。本发明的动物双歧杆菌乳亚种菌株可在pH值2~3时具有优秀的存活率。当摄入食物后，已知食物的平均停留时间约1~3小时。本发明的动物双歧杆菌乳亚种可在模拟胃液中停留3h存活率达90%以上。
4.本发明的动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001具有优秀的耐胆盐能力。经过胃的食物会被送至小肠内，此时，所分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合形成的胆盐会帮助食物消化。本发明的动物双歧杆菌乳亚种在0.3%~1.5%的胆盐浓度下具有较高的存活率，在模拟肠液中停留4h存活率高达约100%，具有良好的肠道固定能力。
5.本发明的动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001应用到食品中被摄取时，具有较高的肠道抵达率及肠道固定能力。
本发明提供动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001菌株、其提取物或其培养液的组合物。
本发明提供动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001菌株、其提取物或其培养液的食品组合物。
所述的食品组合物可以为保健食品组合物，儿童食品组合物，发酵食品组合物。
所述食品组合物的剂型不受限制，例如，可以被制成粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等。
本发明所述的耐酸能力强、耐胆盐能力强、耐受胃、肠液能力强、耐热性好的的动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001，其已于2019年07月24日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.18292。
具体实施方式
实施例1动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001 CGMCC No.18292菌株的筛选分离
男婴粪便5g加到5mL缓冲蛋白胨液中，以10倍稀释法稀释至10-3，每个稀释度分别划线到BBL培养基平板上。培养条件为厌氧条件39℃培养48h；挑取具有目的菌株典型特征（观察形态、大小、色泽、及其透明度等）、菌落较大、活性较强的单菌落，于BBL培养基进行划线纯化培养，如此反复2~3次，直到划线平皿中菌落特征一致；每个纯化后的平皿挑取2个以上单菌落进行涂片、革兰氏染色，并且在显微镜下观察其颜色、菌体形状是否一致，从而确定该平皿中菌落是否为纯培养物。如镜下观察结果一致，则将得到的纯培养物（平皿菌落）作为疑似菌株，将对应平皿编号，待鉴定；如镜下观察结果不一致，则继续进行上述操作。
所述的BBL培养基：采用BBL琼脂培养基（青岛海博HB0396）。
实施例2动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001 CGMCC No.18292菌株的鉴定
将实施例1中所得到的纯培养物进行接触酶试验，16S rDNA全序列测序鉴定。最终鉴定分离得到的菌株为一株动物双歧杆菌乳亚种，命名为动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001，已于2019年07月24日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.18292。其序列如SEQID NO:1所示。
上述动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001菌株为革兰氏阳性菌，厌氧，无芽孢，菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，中间有凸起，边缘整齐，直径约2mm；细胞呈杆状，呈“V”字型。其生理生化特征是：接触酶阴性，氧化酶阴性，可利用D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、苦杏仁甙、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖。
实施例3动物双歧杆菌乳亚种HCS04-001菌种培养实验
包括如下步骤：
1、一级培养：将保藏于-80℃的菌株冻存管取出，经解冻后，将1mL（一支冻存管）的菌悬液接种于10mL的改良乳酸菌培养基中，39℃静置培养17小时；
2、用接种环蘸取微量冻存管残存液体，于平板划线，37℃培养24~48h后，观察菌落；挑取少量菌落涂片，染色，观察显微镜下菌体；
3、二级培养：将一级培养得到的菌悬液按5%的接种量转接于100mL改良乳酸菌培养基中，39℃静置培养17小时；
4、三级培养：将二级培养得到的菌悬液按5%的接种量转接于300mL改良乳酸菌培养基中，39℃静置培养17小时；
5、检测各级培养液的pH值、OD值，用10mL离心管取约5mL三级培养液进行活菌数计数，将三级培养液进行离心（12000r/min，10min），弃上清，擦干离心管壁残留的上清液，收集菌泥，并计算菌泥收率；
6、三级培养液收集菌泥后，使用接种环蘸取微量菌泥涂于载玻片上，染色观察显微镜下菌体。
所述的改良乳酸菌培养基配方：L-苹果酸 2~4g/L，低聚果糖 2~4g/L，酵母粉 10~20g/L，葡萄糖 10~20g/L，酵母蛋白胨 10~20g/L，pH调至6.5~7.0，分装，115℃灭菌30min。
表3 HCS04-001菌种培养实验数据表
观察菌落形态一致，单菌落约2mm，圆形，乳白色，表面光滑。革兰氏染色阳性，杆状，呈“V”字型，两端凸出，中间凸出或梭型等多种形态，偶有分叉，无芽孢。
实施例4动物双歧杆菌乳亚种HCS04-001耐消化道逆环境实验
益生菌耐消化道的逆环境是其能够在肠道存活、生长并发挥功效的先决条件之一。
1、耐酸试验
将传代三次的菌液按照10%的接种量分别接种于空白对照培养基、pH2.0和pH3.0的改良的乳酸菌培养基中。39℃静置培养，于17h取样，用灭菌的生理盐水进行10倍系列稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000μL进行混菌计数操作，每个稀释度2次重复，37℃静置培养36-48h后计数。
耐酸试验数据指标：
测得空白对照的活菌数用N0表示，其他pH条件下测得的活菌数用N´表示，其耐酸性活菌数对数比率计算公式如下：
受试菌株耐酸性试验存活率（%）=lgcfuN´/lgcfu N0×100%；
表4 HCS04-001耐酸试验数据表
由表4可知，HCS04-001菌株在pH 3.0的条件下经过17h后，存活率为40.37%；pH2.0条件下处理17h后，存活率为37.50%，表明该菌通过胃酸的抑制作用后仍可保持较高活性，从而发挥其益生作用。
2、耐胆盐试验
将传代三次的菌液按照10%的接种量分别接种于未含有牛胆盐（空白对照）、含有0.3%、0.5%、1.0%和1.5%牛胆盐浓度的改良乳酸菌培养基中，39℃静置培养，于17h取样，测定活菌数。
耐胆盐试验数据指标：
测得空白对照的活菌数用N0表示，其他胆盐浓度条件下测得的活菌数用N´表示，其耐胆盐活菌数对数比率计算公式如下：
受试菌株耐胆盐试验存活率（%）=lgcfuN´/lgcfu N0×100%；
表5 HCS04-001耐胆盐试验数据表
由表5可知，虽然HCS04-001菌株随胆盐浓度的升高，活菌数逐渐下降，但是在1.5%胆盐浓度处理条件下，存活率仍然可达68.23%。
3、模拟胃液试验
将传代三次的菌液震荡摇匀，取菌悬液10mL离心（5000×g，10min，4℃）获得菌泥，用PBS缓冲液冲洗2次，获得的菌泥重悬于10 mL模拟胃液中，39℃条件下消化3h，分别于0h、3h取样测活菌数。
活化三代后的受试菌株在第三代培养液中的活菌数用N表示，经在模拟胃液培养基中消化3h后计数测得的活菌数用N″表示，受试菌株模拟胃液试验存活率计算公式如下：
受试菌株模拟胃液试验存活率（%）=lgcfu N″/lgcfuN×100%；
表6 HCS04-001模拟胃液试验数据表
由表6可知，HCS04-001菌株在模拟胃液中的存活能力较强，经3h处理后，存活率仍可达到94.61%，其在胃内停留较长时间仍保持高活性。
4、模拟肠液试验
将传代三次的菌液震荡摇匀，取菌悬液10mL离心（5000×g，10min，4℃）获得菌泥，用PBS缓冲液冲洗2次，获得的菌泥重悬于10 mL的人工肠液中，39℃条件下培养，于0h、2h、4h分别取样测活菌数。
活化三代后的受试菌株在第三代培养液中的活菌数用N表示，经在模拟肠液培养液中培养2h、4h后计数测得的活菌数用N″表示，受试菌株模拟肠液试验存活率计算公式如下：
受试菌株模拟肠液试验存活率（%）=lgcfuN″/lgcfuN×100%；
表7 HCS04-001模拟肠液试验数据表
由表7可知，HCS04-001菌株在模拟肠液中的存活能力强，随处理时间延长，活菌数基本没有下降，存活率高达100%。
综上，说明该菌株具有较强的耐酸耐胆盐能力，且能够有效抵抗胃肠液的影响，从而能够在通过消化道后依然维持较高活性。
实施例5动物双歧杆菌乳亚种HCS04-001耐热性试验
1、样品制备
将传代两次的菌液按照5%的接种量接种于改良的乳酸菌培养基中，于39℃条件下静置培养，培养17小时后取样，备用计数，活菌数用N1表示；
将传代两次的菌液按照5%的接种量接种于改良的乳酸菌培养基中，于45℃条件下静置培养，培养17小时后取样，备用计数，活菌数用N2表示；
2、活菌计数
将备用的样品用灭菌的生理盐水进行10倍系列稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000μL进行混菌计数操作，每个稀释度2次重复，37℃静置培养36-48h后计数；
3、试验指标：菌液活菌数（单位：cfu/mL）；
受试菌株耐热性试验存活率计算公式如下：
受试菌株耐热性试验存活率（%）=lgcfuN2/lgcfuN1×100%；
表8 HCS04-001耐热性试验数据表
菌株HCS04-001的最适培养温度为39℃，但由表8耐热性试验数据显示，菌株HCS04-001在较高温度45℃条件下培养17h后活菌数检测结果为1.45×108 cfu/mL，存活率可达93.04%，具有较好的耐热性。
<110> 汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司
<120> 一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种
<160> 1
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<211> 1388
<212> DNA
<213>动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001
<400> 1
AGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTAC 60
AAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCT 120
TCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCC 180
ACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGT 240
AAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCA 300
CATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGAC 360
TTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCC 420
CGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTC 480
GCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTT 540
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CTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATT 780
CCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGA 840
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ATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATT 960
CGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACA 1020
ACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAA 1080
TATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGG 1140
TCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGC 1200
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GTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCG 1380
TTCGACTG 1388
Claims (6)
1.一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种，其特征在于，所述的动物双歧杆菌乳亚种命名为动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-001，该菌株已于2019年07月24日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.18292。
2.权利要求1所述的一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）一级培养：将保藏于-80℃的菌株冻存管取出，经解冻后，将1mL的菌悬液接种于10mL的改良乳酸菌培养基中，39℃静置培养；用接种环蘸取微量冻存管残存液体，于平板划线，37℃培养后，观察菌落；挑取少量菌落涂片，染色，观察显微镜下菌体；
2）二级培养：将一级培养得到的菌悬液按5%的接种量转接于改良乳酸菌培养基中，39℃静置培养17小时；
3）三级培养：将二级培养得到的菌悬液按5%的接种量转接于改良乳酸菌培养基中，39℃静置培养17小时；
4）将三级培养液进行离心，弃上清液，擦干离心管壁残留的上清液，收集菌泥。
3.根据权利要求2所述的一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种的培养方法，其特征在于，步骤1）、步骤2）和步骤3）中所述的改良乳酸菌培养基的配方为：L-苹果酸2~4g/L，低聚果糖 2~4g/L，酵母粉 10~20g/L，葡萄糖 10~20g/L，酵母蛋白胨 10~20g/L。
4.根据权利要求3所述的一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种的培养方法，其特征在于，步骤1）、步骤2）和步骤3）中所述的改良乳酸菌培养基的配方为：L-苹果酸3g/L，低聚果糖2g/L，酵母粉15g/L，葡萄糖15g/L，酵母蛋白胨18g/L。
5.根据权利要求2所述的一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种的培养方法，其特征在于，步骤1）中，所述的39℃静置培养的时间为17h。
6.根据权利要求2所述的一种分离自婴儿粪便的耐热型动物双歧杆菌乳亚种的培养方法，其特征在于，步骤1）中，所述的37℃培养的时间为24-48h。
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