CN109833334A - 长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法及其应用，所述制备方法包括如下步骤：将长茎葡萄蕨藻样品溶于提取溶剂中，依次进行研磨搅拌、超声、过滤或离心、浓缩，得提取液，即得；所述提取溶剂为水或乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的体积浓度为0.5‑100％，所述长茎葡萄蕨藻样品与所述提取溶剂的配比为：1g：0.1‑100ml。该长茎葡萄蕨藻提取物具有保湿补水、抗炎、促进细胞增生和促进伤口愈合的作用。

Description

长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物提取领域，特别是涉及一种长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法和应用。

背景技术

长茎葡萄蕨藻(学名：Caulerpa lentillifera)是蕨藻属的一种可食用藻类，也叫“海葡萄”，在菲律宾麦克坦岛和日本冲绳县有这种藻的养殖场。目前，中国广东、山东和海南等地已经养殖成功。长茎葡萄蕨藻是一种营养丰富的食用绿藻，其含有大量的氨基酸、ω-6不饱和脂肪酸如油酸，花生四烯酸等、多糖类、矿物质，维生素、还富含磷、钙、镁、铜、硒等微量元素；蛋白质含量10.41％，总脂肪含量较低1.6％-3.7％，具有净化血液、抗氧化、抗癌、抗肿瘤的作用。

海葡萄含有重要活性物质，如蕨藻倍半萜(Caulerpenyne)，其主要功效在于，当藻体受到机械损伤后，蕨藻倍半萜可转化成Oxytoxin-2，封住细胞损伤部位。另外，蕨藻倍半萜也可用于治疗痛风，蕨藻倍半萜对黄嘌呤氧化酶(XOD)活性有抑制效应。海葡萄的提取物具有抗病毒和抗肿瘤活性。从长茎葡萄蕨藻中分离的多糖对巨噬细胞有免疫刺激活性，其中的木聚糖水解成平均5个单糖分子的寡糖，可诱导人体乳腺癌细胞MCF-7核染色质凝聚，以及Poly-ADP-ribose polymerase(二磷酸腺苷核糖多聚酶)的沉降，有诱导癌细胞凋亡的作用。

但是，关于海葡萄的提取物对皮肤保湿补水、抗炎和加快伤口愈合的功效没有报道。

发明内容

基于此，本发明提供了一种长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法和新应用。

具体技术方案如下：

一种长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法，包括如下步骤：

将长茎葡萄蕨藻样品溶于提取溶剂中，依次进行研磨搅拌、超声、过滤或离心、浓缩，得提取液，即得；

所述提取溶剂为水或乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的体积浓度为50-90％，所述长茎葡萄蕨藻样品与所述提取溶剂的配比为1g：3-7ml。

在其中一些实施例中，所述超声的条件如下：175-200W、30-50kHz、超声45-90min。

在其中一些实施例中，所述超声的条件如下：180-190W、35-45kHz、超声55-65min。

在其中一些实施例中，浓缩后的所述提取液的体积与所述提取溶剂的体积比为0.25-0.5:1。

在其中一些实施例中，浓缩后的所述提取液的体积与所述提取溶剂的体积比为0.35-0.4：1。

在其中一些实施例中，所述乙醇水溶液的体积浓度为65-75％，所述长茎葡萄蕨藻样品与所述提取溶剂的配比为1g：4.8-5.2ml。

在其中一些实施例中，所述离心的条件为：800-2300rcf/min，离心1-2次。

在其中一些实施例中，在所述浓缩步骤之后还包括冷冻干燥的步骤，得冻干粉，即得所述长茎葡萄蕨藻提取物。

在其中一些实施例中，所述冷冻干燥的条件为：温度为-75-85℃，时间为2.5-3.5天。

在其中一些实施例中，当所述浓缩步骤之后还包括冷冻干燥的步骤时，所述长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法还包括将所述冻干粉溶于水的步骤，得水溶液，即得所述长茎葡萄蕨藻提取物。

在其中一些实施例中，所述水溶液的浓度为0.01-1.5mg/mL。

在其中一些实施例中，所述水溶液的浓度为0.1-1.2mg/mL。

在其中一些实施例中，所述水溶液的浓度为0.25-1.0mg/mL。

在其中一些实施例中，所述水溶液的浓度为0.7-1.0mg/mL。

在其中一些实施例中，所述长茎葡萄蕨藻样品包括：长茎葡萄蕨藻的茎、长茎葡萄蕨藻的球状叶状体或者整株长茎葡萄蕨藻。

长茎葡萄蕨藻或长茎葡萄蕨藻提取物在制备具有保湿补水或者抗炎或者促进细胞增生或者促进伤口愈合的作用的皮肤用品中的应用。

在其中一些实施例中，所述皮肤用品为护肤品、化妆品、保健品、食品或者药品。

在其中一些实施例中，所述长茎葡萄蕨藻提取物由上述制备方法制备而成。

在其中一些实施例中，所述长茎葡萄蕨藻提取物的使用浓度为0.01-1.5mg/mL。

在其中一些实施例中，所述长茎葡萄蕨藻提取物的使用浓度为0.1-1.2mg/mL。

在其中一些实施例中，所述长茎葡萄蕨藻提取物的使用浓度为0.25-1.0mg/mL。

在其中一些实施例中，所述长茎葡萄蕨藻提取物的使用浓度为0.7-1.0mg/mL。

本发明还公开了一种具有保湿补水或者抗炎或者促进细胞增生或者促进伤口愈合的作用的皮肤用品。

具体技术方案如下：

一种皮肤用品，所述皮肤用品具有保湿补水或者抗炎或者促进细胞增生或者促进伤口愈合的作用，所述皮肤用品中的活性成分包括有长茎葡萄蕨藻提取物。

在其中一些实施例中，所述皮肤用品为护肤品、化妆品、保健品、食品或者药品。

在其中一些实施例中，所述长茎葡萄蕨藻提取物由上述制备方法制备而成。

在其中一些实施例中，所述长茎葡萄蕨藻提取物的浓度为0.01-1.5mg/mL。

在其中一些实施例中，所述长茎葡萄蕨藻提取物的浓度为0.1-1.2mg/mL。

在其中一些实施例中，所述长茎葡萄蕨藻提取物的浓度为0.25-1.0mg/mL。

在其中一些实施例中，所述长茎葡萄蕨藻提取物的浓度为0.7-1.0mg/mL。

本发明的发明人用皮肤细胞HaCaT进行细胞增生和伤口愈合的实验，发现海葡萄提取物不仅有促进HaCaT细胞增生的功效，而且有促进伤口愈合的作用。用皮肤细胞HaCaT进行细胞内保湿补水因子FLG2mRNA表达量水平实验，发现海葡萄提取物对于皮肤细胞有明显的保湿补水的作用，尤其是海葡萄茎和全株的水提物的作用更好。以脂多糖(LPS)诱导皮肤细胞HaCaT炎症因子TNFα和IL-6，建立细胞炎症模型，测试海葡萄提取物的抗炎实验，发现海葡萄提取物具有较好的抗炎作用。因此，本申请对海葡萄提取物对于皮肤保湿补水、抗炎和创伤愈合、皮肤再生提供了实质的实验数据。从实验数据可知：海葡萄提取物可用于皮肤保湿补水、抗炎和创伤愈合、皮肤再生；亦可用于伤口发炎、愈合或皮肤再生、皮肤保湿补水等医护和化妆品产品的制备。

本申请的海葡萄提取物的制备方法具有产量高及较容易市场化的绝对优势，并且利用本申请的制备方法获得的海葡萄提取物其皮肤保湿补水、抗炎和促进细胞增生、加快伤口愈合的作用更为显著，保湿补水功效也比较稳定，海葡萄提取物的生产成本低，并能广泛地用于药品、保健品、食品和美容产品，具有巨大的市场潜力。

附图说明

图1为海葡萄各部分水提物以及醇提物对皮肤细胞HaCaT的增生作用。

图2为海葡萄球状叶状体水提取物及醇提取物对伤口愈合速率的影响，T0为起始时间，T24为24小时后的变化。

图3为海葡萄茎水提取物及醇提取物对伤口愈合速率的影响，T0为起始时间，T24为24小时后的变化。

图4为海葡萄全草水提取物及醇提取物对伤口愈合速率的影响，T0为起始时间，T24为24小时后的变化。

图5为海葡萄各部分水提物以及醇提物对受试皮肤细胞的保湿补水效果。

图6为海葡萄各部分水提物以及醇提物对TNFα炎症因子的抑制作用。

图7为海葡萄各部分水提物以及醇提物对IL-6炎症因子的抑制作用

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法和应用做进一步详细的说明。

本申请中术语“海葡萄”与“长茎葡萄蕨藻”的意义相同，“海葡萄提取物”与“长茎葡萄蕨藻提取物”的意义相同。

实施例1

长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法

本实施例示例性提供了长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法，包括以下步骤：

a)将海葡萄样品清洗后分成茎、球状叶状体以及整株。

b)将8克不同部分的海葡萄样品溶于40毫升水或70％(体积浓度)乙醇水溶液中，进行搅拌、研磨。

c)在185W、40kHz下超声60分钟，使得海葡萄充分溶解，得海葡萄乙醇提取液或者水提取液。

d)海葡萄提取液经过滤(或者离心：800-2300rcf/min，离心1-2次)后，浓缩提取液至15毫升，以获得高浓度海葡萄提取液。

e)在-80摄氏度对海葡萄提取液进行冷冻干燥3天，获得海葡萄提取物冻干物0.08g，收率1.0％。

f)溶解海葡萄提取物冻干物于水中获得由海葡萄制成的长茎葡萄蕨藻提取物，分别得到浓度为0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL等的长茎葡萄蕨藻提取物溶液。

实施例2

海葡萄提取物对HaCaT皮肤细胞增生作用的实验

本实施例对按照实施例1的方法所制备的海葡萄提取物进行HaCaT皮肤细胞增生作用实验。

具体地，所进行的HaCaT皮肤细胞增生作用实验包括以下步骤：

a)参照实施例1的制备方法制得海葡萄提取物。

b)将所制备的海葡萄提取液加入到人永生化表皮细胞(HaCaT)，与HaCaT皮肤细胞一起培养48小时，收取加入海葡萄提取物和未加入海葡萄提取物的HaCaT皮肤细胞进行研究。

c)应用MTT试验测试细胞存活率，与空白对照作比较，从而评估海葡萄不同部位制备的海葡萄提取物对皮肤细胞的增生作用。

结果如图1所示：不同部位的海葡萄所制备的海葡萄提取物对于皮肤细胞HaCaT没有毒性，而且在0.75mg/mL浓度(海葡萄提取物的冻干粉在培养液中的终浓度)或以上时，对于皮肤细胞HaCaT有明显的增生作用。

实施例3

海葡萄提取物对伤口愈合作用的实验测试

本实施例对按照实施例1的方法所制备的海葡萄提取物进行伤口愈合实验测试。

具体地，所进行的伤口愈合实验包括以下步骤：

a)参照实施例1的制备方法制得海葡萄提取物。

b)将HaCaT细胞种在6孔板板孔中直至完全密铺。

c)用移液器吸头在每个6孔板板孔底中心位置划上十字；

d)分别在6孔板中加入空白对照、海葡萄不同部位的提取物0.25mg/mL(海葡萄提取物的冻干粉在培养液中的终浓度)；共同培养24小时；

e)在50倍放大率显微镜下拍摄细胞层覆盖率作记录，观察对比加入海葡萄提取物前后的细胞层覆盖率。T0为未加入海葡萄提取物的细胞图，T24为加入海葡萄提取物24小时的细胞图。

f)使用TScratch软件分析及比较细胞层覆盖率。

结果如图2、图3和图4所示：海葡萄提取物能加快伤口的愈合速度，尤其是海葡萄茎和全草(株)的水提物促进伤口愈合的功效最好。

实施例4

海葡萄提取物的保湿补水功效测试：

本实施例对按照实施例1的方法所制备的海葡萄提取物进行HaCaT细胞内保湿补水mRNA表达量水平实验。从RNA层面切入，以测试提取物对细胞转录所起的功效，从而得出对皮肤蛋白质表达和生成的影响，以了解提取物对皮肤保湿的效用，为此测试了细胞的FLG2基因表达。FLG2基因位于皮肤表皮的颗粒层，与皮肤表面相平行，2009年发现FLG2基因于皮肤的中扮演的角色：可以控制丝聚合蛋白原的表达，丝聚合蛋白原可被转化为小肽，最后在皮肤表面分解成氨基酸，成为皮肤天然保湿因子；另外，FLG2基因帮助角质细胞的分化，角质细胞是皮肤的天然屏障，防止化学、微生物、水及紫外线的入侵。

具体的所进行的HaCaT皮肤细胞保湿补水实验包括以下步骤：

a)参照实施例1的制备方法制得海葡萄提取物。

b)将所制备的海葡萄提取物加入HaCaT皮肤细胞一起培养，海葡萄提取物的终浓度为0.25mg/mL，收取加入海葡萄提取物和未加入海葡萄提取物的HaCaT皮肤细胞。

c)提取HaCaT细胞的总RNA，将其进行逆转录获得cDNA。

d)运用实时聚合酶链锁反应(RT-PCR)，量化HaCaT细胞mRNA表达量，与空白对照作比较，从而评估海葡萄提取物对皮肤保湿补水的作用。利用荧光标记物标记，从而可量化样本中目标基因(FLG2基因)数量，此技术可以同一时间检测多个反应。在每个反应中，加入cDNA样本、上游引物、下游引物及SybrGreen荧光染剂，再利用480 RT-PCR仪器检测HaCaT皮肤细胞在不同药物下，细胞FLG2基因表达的变化。

结果如图5所示：海葡萄提取物对于皮肤细胞有明显保湿补水的作用，尤其是海葡萄茎和全株的水提物。

实施例5

海葡萄提取物的抗炎功效测试

本实施例以脂多糖(LPS)诱导皮肤细胞HaCaT炎症，建立细胞炎症模型，利用酶联免疫法(ELISA)测定分泌到培养基中的TNFα和IL-6炎症因子含量。炎症因子TNFα和IL-6含量越高，炎症越严重。当加入海葡萄提取物到HaCaT细胞培养基中，如果炎症因子含量越低，则代表海葡萄提取物的抗炎效果越好。

(a)HaCaT细胞以5x10⁴/ml的浓度种于96孔板中，于给药前换成低血清培养基。

(b)用低血清培养基稀释提取物，于给药3小时后加入脂多糖LPS0.5μg/mL，培养12小时后收取培养基，用于ELISA测定。以没有加入任何的对照的测试结果作为实验对照组，同时以只加了脂多糖LPS组作为对照组。每个样品重复3个孔，取平均值进行计算。

(c)按照ELISA试剂盒的步骤，测定分泌到培养基中的TNFα和IL-6炎症因子的含量。

(d)数据以mean±SD(n＝3)表示，采用Student’st-test进行统计。与对照组进行比较，*p<0.05，**p<0.01。

结果如图6和图7所示(本实施例中海葡萄提取物的终浓度为0.25mg/mL)：海葡萄球状叶状体的醇提物和水提物提取物抑制炎症因子TNFα的作用最强；海葡萄同一部位，醇提物比水提物的效果略好。海葡萄茎的醇提物抑制IL-6炎症因子的功效最好，其它部位的提取物均有抑制IL-6炎症因子的功效。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将长茎葡萄蕨藻样品溶于提取溶剂中，依次进行研磨搅拌、超声、过滤或离心、浓缩，得提取液，即得；

所述提取溶剂为水或乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的体积浓度为50-90％，所述长茎葡萄蕨藻样品与所述提取溶剂的配比为1g：3-7ml。

2.根据权利要求1所述的长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法，其特征在于，所述超声的条件如下：175-200W、30-50kHz、超声45-90min；及/或，

浓缩后的所述提取液的体积与所述提取溶剂的体积比为0.25-0.5：1；及/或，

所述乙醇水溶液的体积浓度为65-75％，所述长茎葡萄蕨藻样品与所述提取溶剂的配比为1g：4.8-5.2ml。

3.根据权利要求1所述的长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法，其特征在于，在所述浓缩步骤之后还包括冷冻干燥的步骤，得冻干粉，即得所述长茎葡萄蕨藻提取物。

4.根据权利要求3所述的长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的条件为：温度为-75-85℃，时间为2.5-3.5天。

5.根据权利要求1-4任一项所述的长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法，其特征在于，所述长茎葡萄蕨藻样品包括：长茎葡萄蕨藻的茎、长茎葡萄蕨藻的球状叶状体或者整株长茎葡萄蕨藻。

6.长茎葡萄蕨藻或长茎葡萄蕨藻提取物在制备具有保湿补水或者抗炎或者促进细胞增生或者促进伤口愈合的作用的皮肤用品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述长茎葡萄蕨藻提取物由权利要求1-5任一项所述的制备方法制备而成。

8.一种皮肤用品，所述皮肤用品具有保湿补水或者抗炎或者促进细胞增生或者促进伤口愈合的作用，其特征在于，所述皮肤用品中的活性成分包括有长茎葡萄蕨藻提取物。

9.根据权利要求8所述的皮肤用品，其特征在于，所述长茎葡萄蕨藻提取物的浓度为0.01-1.5mg/mL。

10.根据权利要求9所述的皮肤用品，其特征在于，所述长茎葡萄蕨藻提取物的浓度为0.25-1.0mg/mL。