KR101252149B1

KR101252149B1 - 항노화 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101252149B1
Application number: KR1020130004747A
Authority: KR
Inventors: 황수현; 이대우; 하정욱
Original assignee: 주식회사 더마랩
Priority date: 2013-01-16
Filing date: 2013-01-16
Publication date: 2013-04-08

Abstract

본 발명은 바다포도 및 청각 혼합추출물을 포함하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 항산화, 콜라겐 생성 촉진, 콜라게나아제 발현 저해, 엘라스타제 발현 저해, NO 생성 억제, 프로스타글란딘 생성 억제, 최종당화산물 생성억제 및 TNF-α 생성 억제를 통해 주름 개선, 탄력 증진 및 보습 효과를 가짐으로써 우수한 항노화 효과를 보인다.

Description

항노화 화장료 조성물 {Cosmetic composition for anti-aging}

본 발명은 바다포도 및 청각 혼합추출물을 포함하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.

주름이 형성되는 원인은 자연적 노화에 의한 주름의 생성과 자외선 노출(광노화)에 의한 주름의 생성으로 크게 나눌 수 있는데, 두 가지 원인에 의한 주름 형성 메커니즘은 아직까지 정확하게 밝혀져 있지 않은 상태이다. 자연적 노화와 광노화에 의한 피부변화와 관련되어 발견되는 공통적인 현상은 진피 내의 주 구성단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형, 진피의 기질인 히아루론산의 감소에 의한 피부 탄력 감소이다. 특히 지금까지의 연구결과에 의하면 진피 내 주 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형이 주름의 생성 및 피부의 탄력저하에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다.

콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포외 간질에 존재하고, 중요한 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포분할과 분화(유기체의 성장 혹인 상처 치유시)의 유도 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. 또한 근래에 들어 피부 노화에 대한 광범위한 연구 결과가 보고되면서 피부에서의 콜라겐의 중요한 기능이 밝혀지고 있다. 콜라겐 합성을 촉진하여 주름개선효과를 나타내는 유효성분들이 알려져 있다. 예를 들어, 레티노산(retinoic acid), TGF(Transforming growth factor), 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산(betulinic acid), 클로렐라 추출물 등이 콜라겐 합성 촉진 물질로서 알려져 있다.

당화 반응, 혹은 비효소적 당화 반응 (non-enzymatic glycation reaction)이란 단백질의 유리 아미노기인 리신이나 아르기닌과 환원당의 카르보닐기가 반응하여 초기 당화 생성물인 shiff base를 형성하고 이때 형성된 화합물들이 계속적으로 축합, 재전위, 산화, 분열, 고리화 등의 일련의 복잡한 반응을 통하여 멜라노이딘(melanoidin)을 만들어 비가역적 최종 당화산물(advanced glycation end products, AGEs)을 형성하는 반응이다. 당화 반응은 고혈당을 가지는 당뇨환자에서 정상인보다 급격히 일어나지만 정상 혈당의 경우에도 노화가 진행됨에 따라 체내에서 일어난다. 비교적 반감기가 긴 콜라겐은 쉽게 당화 및 가교결합(cross-linking)이 일어나고, 여러 단계의 반응을 거쳐 최종적으로 생성된 당화산물이 피부에 축적되어 피부의 탄력감소 및 주름을 일으킨다고 알려져 있다. 많은 선행 연구자들은 아미노구아닌딘(aminoguanidine(AG))과 같이 당화를 억제하는 물질은 콜라겐의 안전성을 유지하는 효능이 있다고 보고하고 있다.

바다포도(Caulerpa lentillifera)는 일본 오키나와, 필리핀, 베트남 등에 서식하는 해조류로 Sea Grape, Green Caviar 등으로 불린다. 오키나와 사람들이 먹는 다섯 가지 해조 진미 중 하나로 오키나와 섬 주민들의 장수 음식으로 유명하다. 바다포도는 알칼리성 식품으로 각종 미네랄과 비타민, 식이섬유인 알길산의 보고이며 피를 맑게 하고 활성산소와 과산화지질의 생성을 억제하며 노폐물의 원활한 배설과 배변을 돕는다. 단백질이 약 10% 정도 포함되어 있으며 당질은 약 30~40% 정도 포함되어 있다고 알려져 있다.

청각(Codium fragile)은 우리나라 북부, 중부, 남부의 바다밑 물결이 잔잔한 곳에 있는 바위 등에 붙어 자란다. "자산어보"에는 감촉이 매끄러우며 빛깔은 검푸르고 맛은 담담하여 김치의 맛을 돋운다고 기록되어 있어, 예로부터 김치의 맛을 내는 재료로 사용되었음을 알 수 있다. 일본에서는 바다 속에 사는 소나라라는 뜻으로 미루(ミル)라고 부른다. 높이 10∼30cm, 굵기는 1.5∼3mm 이고, 아래쪽이 좀 더 굵은 편이다. 가지는 사슴 뿔 모양으로 갈라져 곧게 자라며, 모두 같은 높이에 달하여 부채꼴 모양을 이룬다. 표면은 융처럼 부드럽고, 현미경으로 보면 가지 내부에 무색 투명한 실 같은 조직이 불규칙하게 엉켜 있다. 어린 것은 앞쪽, 특히 위쪽에 털이 있으나 후에 떨어지고 털이 없어진 자국이 남는다. 몸 전체는 세포 사이의 막이 없이 모두 연결되어 세포핵 여러 개가 하나의 세포에 들어 있는 구조이다. 포자가 들어 있는 주머니는 곤봉 모양이며 길이는 굵기의 5∼7배이고, 꼭대기는 뾰족하다. 수심 1∼20m의 깊은 곳 중에서도 파도의 영향을 적게 받는 곳에서 자란다. 특히, 육지로부터 흘러 들어온 물의 영향을 받지 않고, 먼 바다에서 흘러 들어온 바닷물의 영향을 받는 곳에 많으며, 암석, 조개껍질 또는 다른 해조류 등에 붙어산다. 온난대 및 아열대 해역에 흔하다. 배추 등과 함께 물김치를 담그거나, 나물처럼 무쳐서 먹는다. 김치를 담글 때 넣으면 젓갈이나 생선의 비린내, 마늘 냄새를 중화시켜 뒷맛을 개운하게 한다. 구충 성분이 있어 예전에는 회충약으로 쓰이기도 하였으며, 수용성 추출물은 세균에 대한 강한 항생 작용을 가지고 있다고 알려져 있다.

한국특허공개공보 제2012-0056594호, 2012. 06. 04

본 발명의 목적은 항산화, 항염, 보습, 항당화, 주름개선 및 탄력증진 효과에 의해 항노화 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명자들은 주름 개선 및 탄력 증진 등의 항노화 활성을 갖는 화장료 조성물을 개발하고자 예의 연구한 결과, 바다포도 및 청각 혼합 추출물이 항산화, 콜라겐 생성 촉진 등에 우수한 활성을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바다포도 및 청각 혼합 추출물을 포함하는 항노화 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 바다포도 및 청각 혼합 추출물은 항산화, 콜라겐 생성 촉진, 콜라게나아제 발현 저해, 엘라스타제 발현 저해, NO 생성 억제, 프로스타글란딘 생성 억제 및 TNF-α 생성 억제를 통해 주름 개선, 최종 당화생성물 생성 억제, 탄력 증진 및 보습 효과를 가짐으로써 피부 노화를 방지한다.

바다포도 및 청각을 혼합하여 사용하는 것이 바다포도 추출물 또는 청각 추출물 각각을 사용하는 것보다 항산화, 콜라겐 생성 촉진, 콜라게나아제 발현 저해 등에 있어 더욱 우수한 효과를 가진다. 즉, 바다포도 및 청각 혼합추출물이, 각각의 추출물보다 우수한 항노화 효과가 있다.

본 발명에서 바다포도(Caulerpa lentillifera)는 일본 또는 필리핀 등으로부터 구입하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 청각(Codium fragile)은 국내 시장, 온라인 마켓 및 일본 등으로부터 구입하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 바다포도 및 청각은 정제수로 깨끗이 세척하여 사용하며, 추출 방법에 따라 원물 그대로 사용하거나 파쇄하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 바다포도 및 청각 혼합추출물은 바다포도 및 청각의 건조 물질을 먼저 혼합한 후 추출한 추출물이거나, 바다포도 및 청각을 각각 추출한 후 이를 혼합한 혼합 추출물일 수 있다. 본 발명에서 바다포도 및 청각 혼합추출물은 농축된 액상일 수도 있고, 동결 건조된 분말형태일 수도 있다.

본 발명에서 바다포도 및 청각 혼합 추출물은 통상의 기술자에게 알려진 공지의 추출법에 의해 제조된다. 예를 들어, 바다포도 및 청각 건조물을 혼합하여 세절하고, 그 건조 중량의 1~50배 부피량의 물, 탄소수 1~4의 알코올 또는 이들의 함수 알코올 중에서 선택된 추출용매를 부가하여 4∼30℃에서 3∼20일간 침적시켜 유효성분을 추출한 후, 추출용매를 감압농축기로 농축하여 수득될 수 있다.

또한, 본 발명의 바다포도 및 청각 혼합추출물은 건조물을 분쇄하여 혼합하고, 이들의 혼합 건조 중량의 1~30배 부피량의 증류수, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 이들의 혼합용매(예를 들어, 함수알코올, 함수글리세린, 함수에틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 함수 부틸렌글리콜) 중에서 선택된 용매로 추출될 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올 또는 함수알코올에서 선택된 용매로 추출할 수 있다. 여기서, 탄소수 1 내지 4의 알코올은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, iso-프로판올, n-부탄올, iso-부탄올, tert-부탄올일 수 있으며, 보다 바람직하게는 에탄올일 수 있으며, 함수 알코올은 물을 0.3 내지 90(wt/wt)%로 함유할 수 있다. 바다포도 및 청각 혼합추출물은 30∼100℃에서 1∼48시간 동안 가열 추출하거나 5∼30℃에서 1~5일간 침적시켜 유효성분을 추출할 수 있으며, 바람직하게 용매가 증발되는 것을 방지하기 위하여 냉각 콘덴서를 구비한 추출기로 추출할 수 있다. 마지막으로 추출 용매를 감압농축기로 농축하여 수득될 수 있다.

또한, 본 발명의 바다포도 및 청각 혼합추출물은 바다포도 및 청각 각각을 위 방법으로 각각 제조한 후, 이를 혼합하여 수득할 수도 있다.

또한, 위에서 열거한 추출용매에 공지된 초음파 추출법 등을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명에서 바다포도 및 청각 혼합추출물의 혼합 중량비는 다양하게 변할 수 있으나, 건조 중량비로 1:2 내지 2:1으로 혼합된 것이 바람직하며, 바다포도 추출물 및 청각 추출물의 혼합 건조 중량비는 1:1로 혼합된 것이 보다 더 바람직하다.

본 발명에서 바다포도 및 청각 혼합 추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상 형태로 0.001% ~ 10중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.01∼5중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있다.

본 발명에서 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 바다포도 및 청각 혼합추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 색소 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 팩, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 글리세롤, 글리세린, 지방족 에스테르, 페녹시에탄올, 트리에탄올아민, 폴리에틸렌 글리콜, 밀납, 폴리솔베이트 60, 솔비탄세스퀴오레이드, 파라핀, 소르비탄 스테아레이트, 친유형 모노스테아린산 글리세린, 스테아린산, 글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트, 카르복시폴리머, 시토스테롤, 폴리글리세릴 2-올레이트, 세라마이드, 콜레스테롤, 스테아레스-4, 디세틸포스페이트, 마카다미아 오일, 카르복시비닐폴리머, 산탄검 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 부틸렌글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오즈, 소디움히아루로네이트, 페녹시에탄올, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 바다포도 및 청각 혼합추출물을 포함하는 항노화 화장료 조성물은 항산화, 콜라겐 생성 촉진, 콜라게나아제 발현 저해, 엘라스타제 발현 저해, NO 생성 억제, 최종 당화생성물 생성 억제, 프로스타글란딘 생성 억제 및 TNF-α 생성 억제를 통해 주름 개선, 탄력 증진 및 보습 효과를 가짐으로써 우수한 항노화 효과를 가진다.

이하, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

실시예 1. 바다포도 및 청각 혼합추출물의 제조

동남아(필리핀)에서 수입, 구매한 바다포도를 정제수로 세척한 후, 건조시킨 바다포도 100g을 증류수 2㎏에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(제품명 : Cosmos-660, 제조사 : 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

온라인 마켓에서 구입한 청각(원산지:완도)를 정제수로 세척한 후, 건조시킨 청각 100g을 증류수 2㎏에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(제품명 : Cosmos-660, 제조사 : 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 바다포도와 청각을 각각 추출한 후, 바다포도 추출액 50g과 청각 추출액 50g을 동일비율로 혼합하여 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기기(제품명: Coolace CCA-1100, 제조사: EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후, 스프레이드라이어(모델명:B-290, BUCHI사 제품)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 : 180 ℃, 흡입기(Aspirator) 효율 : 100% (35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 : 25% (7.5㎖/분), 노즐 클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter) : 30㎜ (357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출 분말 10g을 얻었다.

비교예 1. 바다포도 추출물의 제조

동남아(필리핀)에서 수입, 구매한 바다포도를 정제수로 세척한 후, 건조시킨 바다포도 100g을 증류수 2㎏을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(제품명 : Cosmos-660, 제조사 : 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다. 바다포도 추출액 50g을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기기(제품명: Coolace CCA-1100, 제조사: EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후, 스프레이드라이어(모델명:B-290, BUCHI사 제품)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 : 180 ℃, 흡입기(Aspirator) 효율 : 100% (35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 : 25% (7.5㎖/분), 노즐 클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter) : 30㎜ (357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출 분말 5g을 얻었다.

비교예 2. 청각 추출물의 제조

온라인 마켓에서 구입한 청각(원산지:완도)을 정제수로 세척한 후, 건조시킨 청각 100g을 증류수 2㎏을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(제품명 : Cosmos-660, 제조사 : 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

청각 추출액 50g을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기기(제품명: Coolace CCA-1100, 제조사: EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후, 스프레이드라이어(모델명:B-290, BUCHI사 제품)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 : 180 ℃, 흡입기(Aspirator) 효율 : 100% (35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 : 25% (7.5㎖/분), 노즐 클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter) : 30㎜ (357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출 분말 5g을 얻었다.

실험예 1. 항산화 효과 확인

크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase)에 의해 생성된 초과산화물 라디칼(superoxide radical)의 소거 활성을 NBT(Nitro-Blue Tetrazolium) 환원법으로 측정하였다.

0.4mM 크산틴과 0.24mM NBT를 포함하는 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액(potassium phosphate buffer) (pH 7.5) 1㎖과 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액 (pH 7.5) 0.6㎖에 시료 0.1㎖을 혼합한 후 크산틴 옥시다제(0.05U/㎖) 1㎖을 가하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 1M HCl 1㎖을 첨가하여 반응을 종결시킨 후, 520㎚에서 흡광도를 측정하였다. 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1의 시료용액은 DMSO(Dimethyl Sulfoxide)용매에 녹여 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0(wt/v)%농도로 제조하였다. NBT 환원 저해능은 하기 [식 1]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 1]에 나타내었다.

[식 1]

[식 1]에서, B (Blank)는 0.4mM 크산틴을 포함한 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액(pH7.5)과 1M HCl만 첨가한 반응액의 흡광도, C (Control)는 시료 대신 0.24mM NBT를 첨가한 반응액의 흡광도, S (Sample)는 시료를 첨가한 반응액의 흡광도를 나타낸다.

[표 1] 바다포도 및 청각 혼합추출물의 항산화 효과 확인

상기 [표 1]에서 나타낸 바와 같이, 동일 농도 처리 시, 비교예 1, 비교예 2의 바다포도 추출물, 청각 추출물 각각보다 바다포도 및 청각 혼합 추출물이 우수한 항산화 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 즉, 바다포도 및 청각 혼합추출물이, 각각의 추출물보다 상승된 항산화 효과를 가짐을 알 수 있다.

실험예 2. 세포 독성 여부 확인

MTT assay를 이용하여 바다포도 및 청각 혼합추출물의 세포 독성 여부를 확인하였다. T-75 Culture flask에 melanocyte를 배양한 후, 배양액을 버리고 Trypsin-EDTA 5㎖를 처리하여 melanocyte를 모두 수거하였다. 수거한 세포의 수를 현미경을 사용하여 측정하고 이에 배양액을 넣어 희석하여 세포 현탁액으로 만들었다. 다음으로 12 well plate에 30,000 cells/well의 수가 되도록 1㎖의 세포 현탁액을 분주하고 24시간 후, 천연물 sample을 투여하였다. 투여 농도는 최종 농도로 하여서 시험 sample에 맞게 제조하였으며, 48시간 배양 후 MTT시약을 처리하였다. 시약 처리 4시간 후 배양액을 제거하고 잘 말린 후 DMSO용액을 넣어 세포를 녹이고, 이 때 나타나는 포르마잔염의 농도를 560nm 에서 흡광도법을 이용하여 측정하였다.

세포 생존율은 하기 [식 2]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 2]에 나타내었다.

[식 2]

[표 2] 바다포도 및 청각 혼합추출물의 세포 독성 확인

상기 [표 2]에서 나타낸 바와 같이, 세포 성장 최적 조건에서의 세포 생존율을 100%로 하였을 때, 바다포도 추출물, 청각 추출물, 및 바다포도 및 청각 혼합추출물 모두 세포 독성을 나타내지 않았으며 세포 증식 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 세포 내 콜라겐 생성 효과 확인

인간 신생아 표피 섬유아세포(Human neonatal foreskin fibroblasts)에서 유래한 HDF-N(Normal Human Primary Dermal Fibroblasts-Neonatal)를 이용하여 프로콜라겐(procollagen) 합성 정도를 측정하였다.

HDF-N 세포주(ATCC PCS-201-010)를 배양접시 바닥에 접종한 후 0.1% 인슐린, 0.1% rhFGF, 0.1% 겐타마이신(gentamicin), 2% FBS를 함유하는 Fibroblast Basal Medium (FBM, Lonza, CC-3131) 배지를 넣고, 37℃ 5% CO₂를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다.

프로콜라겐(Procollagen) 합성능을 측정하기 위하여, HDF-N 세포를 48 well plate에 1.4 X 10⁴세포/웰로 분주하고 37℃를 유지하여 5% CO₂를 포함하는 배양기 내에서 24시간 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 24시간 세포의 기아상태를 유지하며 이후 시험 물질을 세포 배양 배지인 FBM(media supplement 제외)에 희석하여 농도별로 세포에 처리한 후 37℃를 유지하여 24시간 배양하였다. 24시간 후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 procollagen type c-peptide(PIP) EIA kit (TAKARA, MK101)를 사용하여 프로콜라겐 양을 측정하였다. 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척한 후, 1N NaOH로 라이시스(lysis)시켜 총 단백질 양을 측정하여 일정 단백질 당 프로콜라겐 합성 양을 측정하였다. 각각의 프로콜라겐 양과 단백질 양은 검량선에 따라 계산하였다. 단백질 양의 측정은 로우리법(Lowry method)을 기본으로 한 Bio-rad DC protein kit(Bio-rad,500-0001)를 사용하여 측정하였다.

그 결과를 [표 3]에 나타내었다.

[표 3] 바다포도 및 청각 혼합추출물의 콜라겐 생성 효과 확인

상기 [표 3]에서 나타낸 바와 같이, 동일 농도 처리 시 비교예 1, 비교예 2의 바다포도 추출물, 청각 추출물 각각보다 바다포도 및 청각 혼합추출물이 우수한 프로콜라겐 합성능 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 바다포도 및 청각 혼합추출물이, 각각의 추출물보다 상승된 콜라겐 합성 효과를 가짐을 알 수 있다.

실험예 4. 콜라게나아제 ( MMP -1) 발현 저해효과 확인

인간 신생아 표피 섬유아세포(Human neonatal foreskin fibroblasts)에서 유래한 HDF-N(Normal Human Primary Dermal Fibroblasts-Neonatal)를 이용하여 콜라게나아제(MMP-1)의 발현 저해효과를 측정함으로써 주름개선 효과를 확인하였다.

HDF-N 세포주(ATCC PCS-201-010)를 24-well plate 바닥에 접종한 후 0.1% 인슐린, 0.1% rhFGF, 0.1% 겐타마이신(gentamicin), 2% FBS를 함유하는 Fibroblast Basal Medium (FBM, Lonza, CC-3131) 배지를 넣고, 37℃를 유지하여 5% CO₂를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 자외선 챔버를 이용하여 배양한 섬유아세포에 영향을 주지 않는 범위에서 UV-A를 조사(15J/㎠)한 후, 시료가 첨가된 배지로 교환하여 48시간 배양한 다음 배지를 회수하여 96-well plate에 코팅하였다. 블로킹용액을 1시간 동안 처리하여 콜라게나아제가 결합되지 않은 부위를 블로킹하였다. 이차 항체를 다시 90분 정도 반응시킨 후, 일차 항체를 처리하여 37℃에서 90분 반응시킨 다음, 기질용액을 100㎕ 첨가하여 발색시켰다. 시료를 농도별로 첨가한 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. ELISA reader를 사용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게나아제 발현 저해율은 하기 [식 3]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 4]에 나타내었다.

[식 3]

[표 4] 바다포도 및 청각 혼합추출물의 MMP-1 발현 억제 효과 확인

상기 [표 4]에서 나타낸 바와 같이, 동일 농도 처리 시 비교예 1, 비교예 2의 바다포도 추출물, 청각 추출물 각각보다 바다포도 및 청각 혼합추출물이 우수한 콜라게나아제 발현 저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 즉, 바다포도 및 청각 혼합추출물이, 각각의 추출물보다 상승된 콜라게나아제 발현 저해 효과를 가짐을 알 수 있다.

실험예 5. 엘라스타아제( Elastase ) 발현 저해효과 확인

인간 신생아 표피 섬유아세포(Human neonatal foreskin fibroblasts)에서 유래한 HDF-N(Normal Human Primary Dermal Fibroblasts-Neonatal)을 이용하여 엘라스타아제(Elasstase)의 발현 저해효과를 측정함으로써 주름개선 효과를 확인하였다.

2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지가 들어있는 96 well plate에 섬유아세포를 넣고, 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 배지로 24시간 배양하고, 시료를 농도별로 첨가한 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 엘라스타아제 항체가 균일하게 도포된 96 well plate에 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 엘라스틴 항체를 96 well plate에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타낸다. ELISA reader를 사용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 엘라스타아제 발현 저해율은 하기 [식 4]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 5]에 나타내었다.

[식 4]

[표 5] 바다포도 및 청각 혼합추출물의 엘라스타아제 발현억제 효과 확인

상기 [표 5]에서 나타낸 바와 같이, 동일 농도 처리 시 비교예 1, 비교예 2의 바다포도 추출물, 청각 추출물 각각보다 바다포도 및 청각 혼합추출물이 우수한 엘라스타아제 발현 저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

즉, 바다포도 및 청각 혼합추출물이, 각각의 추출물보다 상승된 엘라스타아제 발현 저해 효과를 가짐을 알 수 있다.

실험예 6. NO ( Nitric Oxide ) 생성 억제 효과 확인

RAW264.7 세포에서 본발명 추출물 처리에 따른 NO 생성 억제효과를 측정함으로써 주름개선 효과를 확인하였다.

RAW264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5×105 cell/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 시료를 농도별로 처리하고 30분 배양 후 LPS(lopopolysaccharide, 1㎍/㎖)를 첨가하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 NO detection kit (iNtRON)를 이용하여 측정한 값을 측정하였다. NO 생성 억제율은 하기 [식 5]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 6]에 나타내었다.

[식 5]

[표 6] 바다포도 및 청각 혼합추출물의 NO 생성 억제 효과 확인

상기 [표 6]에서 나타낸 바와 같이, 동일 농도 처리 시 비교예 1, 비교예 2의 바다포도 추출물, 청각 추출물 각각보다 바다포도 및 청각 혼합추출물이 우수한 NO 생성 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

즉, 바다포도 및 청각 혼합추출물이, 각각의 추출물보다 상승된 NO 생성 억제 효과를 가짐을 알 수 있다.

실험예 7. 프로스타글란딘( PGE ₂ ) 생성 억제 효과 확인

RAW264.7 세포에서 본발명 추출물 처리에 따른 프로스타글란딘 생성 억제효과를 측정함으로써 주름개선 효과를 확인하였다.

RAW264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5×105 cell/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 시료를 농도별로 처리하고 30분 배양 후 LPS(lopopolysaccharide, 1㎍/㎖)를 첨가하여 24시간 배양하였다. 생성된 PGE₂의 양은 PGE₂ ELISA kit (R&D System, Inc, USA)를 이용하여 측정한 값을 측정하였다. PGE₂ 생성 억제율은 하기 [식 6]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 7]에 나타내었다.

[식 6]

[표 7] 바다포도 및 청각 혼합추출물의 PGE₂ 생성 억제 효과 확인

상기 [표 7]에서 나타낸 바와 같이, 동일 농도 처리 시 비교예 1, 비교예 2의 바다포도 추출물, 청각 추출물 각각보다 바다포도 및 청각 혼합추출물이 우수한 PGE₂ 생성 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

즉, 바다포도 및 청각 혼합추출물이, 각각의 추출물보다 상승된 PGE₂ 생성 억제 효과를 가짐을 알 수 있다.

실험예 8. TNF -α 생성 억제 효과 확인

RAW264.7 세포에서 본발명 추출물 처리에 따른 TNF-α 생성 억제효과를 측정함으로써 주름개선 효과를 확인하였다.

RAW264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5× 105 cell/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 시료를 농도별로 처리하고 30분 배양 후 LPS(lopopolysaccharide, 1㎍/㎖)를 첨가하여 24시간 배양하였다. 생성된 TNF-α의 양은 TNF-α ELISA kit (eBioscience INC, USA)를 이용하여 측정한 값을 측정하였다. TNF-α 생성 억제율은 하기 [식 7]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 8]에 나타내었다.

[식 7]

[표 8] 바다포도 및 청각 혼합추출물의 TNF-α생성 억제 효과 확인

상기 [표 8]에서 나타낸 바와 같이, 동일 농도 처리 시 비교예 1, 비교예 2의 바다포도 추출물, 청각 추출물 각각보다 바다포도 및 청각 혼합추출물이 우수한 TNF-α 생성 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

즉, 바다포도 및 청각 혼합추출물이, 각각의 추출물보다 상승된 TNF-α 생성 억제 효과를 가짐을 알 수 있다.

실험예 9. 보습 효과 확인

피부 보습에 대한 임상시험으로 피부수분 측정기(Corneometer, Courage+Khazaka, GmbH, Germany)를 이용하여 피부전도도를 측정함으로써 피부 보습력을 평가하였다. 피부수분 측정은 실내온도 20~25℃, 상대습도 40~55%로 유지시킨 항온항습 조건에서 피부수분 측정기를 이용하여 5명의 피검자에 대하여 팔 안쪽을 측정하였다. 보습력은 하기 [식 8]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 9]에 나타내었다.

[식 8]

[표 9] 바다포도 및 청각 혼합추출물의 보습력 확인

상기 [표 9]에서 나타낸 바와 같이, 동일 농도 처리 시 비교예 1, 비교예 2의 바다포도 추출물, 청각 추출물 각각보다 바다포도 및 청각 혼합추출물이 우수한 보습 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

즉, 바다포도 및 청각 혼합추출물이, 각각의 추출물보다 상승된 보습 효과를 가짐을 알 수 있다.

실험예 10. 항당화 효과 확인

당화 반응이 진행되면 산화, 축합 등의 일련의 복합적인 과정을 거쳐 여러 화합물이 혼재되어 있는 최종당화산물(AGEs)이 만들어진다. 최종당화산물 중 일부는 형광을 띄게 되어 당화 반응의 정도를 가늠할 수 있는 척도로 이용되고 있다. 그 중 excitation 370nm/emission 440nm에서 나타내는 형광도는 일반적으로 당화 반응의 정도를 나타내는 수치로 알려져 있다.

상기 원리를 이용하여 실험을 진행하였다. 반응물의 조제는 Mcpherson 등(Role of fructose in glycation and cross-linking of proteins. Biochemistry. 1998. 27. 1901~1907)의 방법을 일부 변형하여 진행하였다. 0.1M 포스페이트 버퍼 (pH 7.0)에 소혈청알부민(BSA, 5㎎/㎖), 25mM 리보오스, 1mM 다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(DTPA)과 0.02% 소듐 아자이드를 각각 최종 농도가 되도록 혼합한 후 96웰 플레이트(Nunc, Denmark)에 180㎕씩 분주한 다음 각각의 시료(10㎎/㎖)를 20㎕ 넣어 실험하였다. 이 때 리보오스를 혼합하지 않아 당화반응이 일어나지 않은 대조군(A), 제조물에서 당화반응이 일어난 당화대조군(B), 각각의 시료 처리군을 제조하였다. 각 시료에 의한 형광도의 간섭을 배제하기 위하여 리보오스를 처리 않은 시료 처리군도 함께 제조하였다. 반응 중 건조를 방지하기 위하여 완전히 밀봉한 다음 37℃ 항온항습배양기에서 7일간 반응을 진행하였다. 반응이 종료된 다음 분광형광계(VICTOR3, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 ex=370nm/em=440nm에서 형광도를 측정하였으며, 각 시료는 3회 반복 실험하였다. 최종당화산물 생성억제 활성은 당화반응이 일어나지 않은 대조군(A)을 100%로, 당화반응이 일어난 당화대조군(B)을 0%로 하여 각 시료의 최종당화산물 생성억제 활성을 나타내었으며, 시료의 경우 당화반응이 일어나지 않은 각 시료의 형광도를 배제한 값(C-D)을 사용하였다. 최종당화산물 생성 억제율(%)은 하기 [식 9]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 10]에 나타내었다.

[식 9]

[표 10] 바다포도 및 청각 혼합추출물의 항당화 효과 확인

상기 [표 10]에서 나타낸 바와 같이, 동일 농도 처리 시 비교예 1, 비교예 2의 바다포도 추출물, 청각 추출물 각각보다 바다포도 및 청각 혼합추출물이 현저히 우수한 최종당화산물 생성 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

즉, 바다포도 및 청각 혼합추출물이, 각각의 추출물보다 상승된 최종당화산물 생성 억제 효과를 가짐을 알 수 있다.

제형예 1. 바다포도 및 청각 혼합추출물을 함유한 화장수 제조

바다포도 및 청각 혼합추출물(실시예 1)을 함유한 화장수(스킨로션)를 하기의 [표 11]의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.

[표 11] 바다포도 및 청각 혼합추출물을 함유한 화장수 조성

상기 [표 11]에서 11번 물질에 2, 3, 4, 8번 물질을 순서대로 반응용기에 투입하고 교반하여 용해시킨 후, 5번 물질을 60℃ 정도로 가열하여 용해시켰다. 이 후, 10번 물질을 투입하여 용해한 후 11번 물질에 투입하였다. 마지막으로 1, 6, 7, 9번 물질을 투입하여 충분히 교반시킨 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 화장수를 제조하였다.

제형예 2. 바다포도 및 청각 혼합추출물을 함유한 영양로션 제조

바다포도 및 청각 혼합추출물 (실시예 1)을 함유한 하이드로좀 영양로션을 하기의 [표 12]의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.

[표 12] 바다포도 및 청각 혼합추출물을 함유한 영양로션 조성

상기 [표 12]에서 10, 11, 13, 16번 물질을 혼합 교반 하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12번 물질을 80 ~ 85℃사이로 가열 용해한 후 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반 하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번 물질을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번 물질을 투입하고 35℃에서 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.

제형예 3. 바다포도 및 청각 혼합추출물을 함유한 영양 세럼 제조

바다포도 및 청각 혼합추출물 (실시예 1)을 함유한 하이드로좀 영양세럼을 하기의 [표 13]의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.

[표 13]바다포도 및 청각 혼합추출물을 함유한 영양 세럼 조성

상기 [표 13]에서 2, 3, 5번 물질을 혼합 교반 하면서 40 ~ 45℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 4, 6, 7번 물질을 제조부에 투입하고 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반 하면서 35℃까지 냉각하고 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양 세럼을 제조하였다.

제형예 4. 바다포도 및 청각 혼합추출물을 함유한 에센스 제조

바다포도 및 청각 혼합추출물 (실시예 1)을 함유한 하이드로좀 에센스를 하기의 [표 14]의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.

[표 14] 바다포도 및 청각 혼합추출물을 함유한 에센스 조성

상기 [표 14]에서 2, 3, 4, 5 및 6번 물질을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질을 제조하였다. 이 비이온계 양친매성 지질과 1, 7, 8 및 14번 물질을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루이다이져를 통과시키고 이어 9번 물질을 50 ~ 60℃로 가온하여 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시켰다. 그 후, 10, 11, 12, 13번 물질을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켜 표제의 에센스를 제조하였다.

실험예 10. 제형 안정도 확인

제형예 1 내지 4에서 제조한 제형에 대하여 실내(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하며, 안정성을 확인 하였다. 그 결과를 표14에 나타내었다.

[표 15] 제형 안정도 확인

<제형 안정 등급>

0 : 변화 없음, 1 : 미세한 변화, 2 : 변화, 3: 극심한 변화

상기 [표 15]에서 나타낸 바와 같이, 제형예 1 내지 4 제형 모두, 25℃, 4℃ 및 50℃ 온도 조건하에서 변색, 변취 및 분리 현상이 나타나지 않고 안정함이 확인되었다.

Claims

바다포도 및 청각 혼합추출물을 포함하는 항노화 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 바다포도 및 청각 혼합추출물은 바다포도 추출물과 청각 추출물의 혼합 추출물인 항노화 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 바다포도 및 청각 혼합추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것인 항노화 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 바다포도 및 청각 혼합추출물의 혼합 건조 중량비는 1:2 내지 2:1인 항노화 화장료 조성물.
제4항에 있어서, 상기 바다포도 및 청각 혼합추출물의 혼합 건조 중량비는 1:1인 항노화 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 바다포도 및 청각 혼합추출물을 총 건조중량에 대하여 0.01 내지 5중량% 포함하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항노화는 항산화, 콜라겐 생성 촉진, 콜라게나아제 발현 저해, 엘라스타제 발현 저해, NO 생성 억제, 프로스타글란딘 생성 억제, TNF-α 생성 억제, 보습 또는 최종당화산물 생성억제 중 선택되는 어느 하나 이상에 의한 것인 항노화 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 팩, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 가지는 화장료 조성물.