CN113274490A - 一种长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法及应用 - Google Patents
一种长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物化学技术领域，公开了一种长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，通过原料预处理、热水浸提、浓缩离心、乙醇沉淀、除游离蛋白、透析冻干等步骤，制得长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂。本发明的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法工艺简单，操作可行，重复再现性好，制备过程中无需大量使用有毒溶剂，安全性好，制备条件温和，产品结构稳定，且具有纯度高、分子量均一等优点，将其作用于巨噬细胞，能显著促使巨噬细胞的COX‑2和iNOS的蛋白表达，从而起到细胞免疫调节作用，适合深入研究及推广，为长茎葡萄蕨藻多糖的进一步研发和应用提供科研参考依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，更具体的，涉及一种长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法及应用。
背景技术
多糖是由十个以上的单糖由糖苷键连接而成的高分子聚合物，是构成生命的基本物质之一。近年来，天然多糖由于其来源广泛、具有多种生物活性、毒副作用低等特点，逐渐引起研究者们的重视。我国的海洋资源丰富，而藻类资源又是最丰富的海洋资源种类之一，其含有的多糖由于来源广泛、高效低毒，具有应用于人类营养和健康方面的潜力，因此逐渐成为研究者积极关注的热点。
长茎葡萄蕨藻(Caulerpa lentillifera)属于绿藻门，是蕨藻属的一种可食用藻类，营养价值高，甚至被称为绿色鱼子酱和长寿藻。一些研究发现，长茎葡萄蕨藻多糖具有α-葡萄糖苷酶抑制作用和抗氧化作用，也有文献提及其具有免疫调节作用，但其作用机制尚未明确。因而，探究长茎葡萄蕨藻多糖的制备方法及其免疫调节作用机制，并将其应用于人类营养与健康方面，具有实际意义和广阔前景。
诱导抗病性是指由生物或非生物因子激活依赖于寄主本身的物理或化学活化抗性过程，使寄主对外来病原菌产生免疫反应，获得对病原菌的抗性，从而达到预防病害的目的，又称为***获得抗性(Systemic Acquired Resistance)。引起抗病性的物质称为抗病诱导剂，也称为激发子(Elicitor)，抗病诱导剂能够诱导寄主启动防卫反应来抵抗病原体侵染，其作用原理是通过激发寄主自身防御***，使其产生抗菌物质，增强寄主对病害的抵抗能力，从而达到预防病害的目的，然而目前，抗病诱导剂大多应用于植物果蔬病害的预防，在人或动物方面较少报道。
因此，研发一种可用于人或动物方面的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂实为必要。
发明内容
本发明所提供的一种长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法及应用，主要用于解决目前一些研究虽然提及长茎葡萄蕨藻具有免疫调节功效，但并未详细记载说明其制备方法，且未见有报道提供应用于人或动物方面的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的问题。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.原料预处理：取长茎葡萄蕨藻样品，自然晾干后充分粉碎；
S2.热水浸提：取步骤S1所得的长茎葡萄蕨藻粉末，与蒸馏水按1g:15～35mL的料液比混合，搅拌均匀后在80～90℃条件下，浸提1～3小时，重复浸提两次；
S3.浓缩离心：合并步骤S2中的浸提溶液并过滤，将所得滤液在45～60℃下旋转蒸发至原体积的1/5，然后离心处理15～20min，收集上清液；
S4.乙醇沉淀：在步骤S3所得的上清液中加入无水乙醇，沉淀12～24小时后离心处理，收集沉淀物；
S5.除游离蛋白：将步骤S4中收集的沉淀物用蒸馏水复溶，所得溶液与洗脱试剂按比例进行混合，在室温下搅拌30～60min，然后在相对离心力为22000×g的条件下离心处理10～15min，收集上层清液，重复以上步骤至中间无蛋白层出现，合并收集的上层清液；
S6.透析冻干：将步骤S5中收集的上层清液转入透析袋中，采用蒸馏水透析48～72h后，取出透析截留物并置于真空冷冻干燥机中冻干，得到长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂。
进一步的，在步骤S2中，将长茎葡萄蕨藻粉末与蒸馏水按1g:20mL的料液比混合，搅拌均匀后在85℃条件下，浸提3小时，重复浸提两次。
进一步的，在步骤S3中，将浸提溶液进行过滤后，所得滤液在55℃下旋转蒸发至原体积的1/5，然后离心处理，收集上清液。
进一步的，在步骤S5中，复溶所得溶液与洗脱试剂按4:1的体积比进行混合，室温下搅拌60min，然后离心处理15min，收集上层清液，重复以上步骤至中间无蛋白层出现时，合并所收集的上层清液。
进一步的，在步骤S5中，所用的洗脱试剂由三氯甲烷和正丁醇按4:1的体积比混合而成。
进一步的，在步骤S4中，乙醇沉淀处理时，无水乙醇与上清液的体积比为3:1。
进一步的，在步骤S6中，所用的透析袋的截留分子量为3000Da，采用蒸馏水透析72小时，其间每四小时更换一次透析水。
进一步的，在步骤S3中，离心处理的相对离心力为22000×g，离心处理时间为20min。
本发明的另一目的在于公开通过上述制备方法制得的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂在细胞免疫调节中的应用。
进一步的，所述长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂在细胞免疫调节中用于促进巨噬细胞的COX-2和iNOS的蛋白表达。
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：
1.本发明的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法设计合理，工艺简单，操作可行，所得产品具有纯度较高、易于保存等优点；
2.本发明的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂制备过程中无需大量使用有毒溶剂，安全性好，制备条件温和，所得产品结构稳定，能确保其生物活性，制备方法中所使用的原料、仪器、试剂易得，因此制备成本低，且本发明的制备方法具有良好的重复再现性，适合推广；
3.本发明的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂可以应用于细胞免疫调节中，能促使巨噬细胞的COX-2和iNOS的蛋白表达，因此可以作为长茎葡萄蕨藻多糖的进一步研发和应用提供科研参考依据。
附图说明
图1为长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的高效凝胶渗透色谱图；
图2为长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的离子色谱图；
图3为长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的红外光谱图；
图4为长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的蛋白质印迹法测试结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明而并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响，并且任何人在本发明权利要求范围内所做的修改仍在本发明权利要求保护范围之内，因此本发明要求保护的范围并不局限于所述。
若未特别指明，本发明实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的材料、试剂等均可从商业途径获取。
实施例1：
一种长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.原料预处理：取长茎葡萄蕨藻样品，自然晾干后充分粉碎；
S2.热水浸提：取步骤S1所得的长茎葡萄蕨藻粉末，与蒸馏水按1g:20mL的料液比混合，搅拌均匀后在85℃条件下，浸提3小时，重复浸提两次；
S3.浓缩离心：合并步骤S2中的浸提溶液并过滤，将所得滤液在55℃下旋转蒸发至原体积的1/5，然后在相对离心力为22000×g的条件下离心处理20min，收集上清液；
S4.乙醇沉淀：在步骤S3所得的上清液中按1:3的体积比加入无水乙醇，沉淀24小时后离心处理，收集沉淀物；
S5.除游离蛋白：将步骤S4中收集的沉淀物用蒸馏水复溶，所得溶液与洗脱试剂按按4:1的体积比进行混合，室温下搅拌60min，然后在相对离心力为22000×g的条件下离心处理15min，收集上层清液，重复以上步骤至中间无蛋白层出现，合并收集的上层清液；
其中，所用的洗脱试剂由三氯甲烷和正丁醇按4:1的体积比混合而成；
S6.透析冻干：将步骤S5中收集的上层清液转入截留分子量为3000Da的透析袋中，采用蒸馏水透析72h，取出透析截留物并置于真空冷冻干燥机中冻干，得到长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂，简称为CLP。
实施例2：
一种长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.原料预处理：取长茎葡萄蕨藻样品，自然晾干后充分粉碎；
S2.热水浸提：取步骤S1所得的长茎葡萄蕨藻粉末，与蒸馏水按1g:15mL的料液比混合，搅拌均匀后在90℃条件下，浸提2小时，重复浸提两次；
S3.浓缩离心：合并步骤S2中的浸提溶液并过滤，将所得滤液在45℃下旋转蒸发至原体积的1/5，然后在相对离心力为22000×g的条件下离心处理18min，收集上清液；
S4.乙醇沉淀：在步骤S3所得的上清液中按1:3的体积比加入无水乙醇，沉淀18小时后离心处理，收集沉淀物；
S5.除游离蛋白：将步骤S4中收集的沉淀物用蒸馏水复溶，所得溶液与洗脱试剂按按4:1的体积比进行混合，室温下搅拌30min，然后在相对离心力为22000×g的条件下离心处理10min，收集上层清液，重复以上步骤至中间无蛋白层出现，合并收集的上层清液；
其中，所用的洗脱试剂由三氯甲烷和正丁醇按4:1的体积比混合而成；
S6.透析冻干：将步骤S5中收集的上层清液转入截留分子量为3000Da的透析袋中，采用蒸馏水透析60h，取出透析截留物并置于真空冷冻干燥机中冻干，得到长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂，简称为CLP。
实施例3：
一种长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.原料预处理：取长茎葡萄蕨藻样品，自然晾干后充分粉碎；
S2.热水浸提：取步骤S1所得的长茎葡萄蕨藻粉末，与蒸馏水按1g:35mL的料液比混合，搅拌均匀后在80℃条件下，浸提1小时，重复浸提两次；
S3.浓缩离心：合并步骤S2中的浸提溶液并过滤，将所得滤液在60℃下旋转蒸发至原体积的1/5，然后在相对离心力为22000×g的条件下离心处理15min，收集上清液；
S4.乙醇沉淀：在步骤S3所得的上清液中按1:3的体积比加入无水乙醇，沉淀12小时后离心处理，收集沉淀物；
S5.除游离蛋白：将步骤S4中收集的沉淀物用蒸馏水复溶，所得溶液与洗脱试剂按按4:1的体积比进行混合，室温下搅拌45min，然后在相对离心力为22000×g的条件下离心处理12min，收集上层清液，重复以上步骤至中间无蛋白层出现，合并收集的上层清液；
其中，所用的洗脱试剂由三氯甲烷和正丁醇按4:1的体积比混合而成；
S6.透析冻干：将步骤S5中收集的上层清液转入截留分子量为3000Da的透析袋中，采用蒸馏水透析48h，取出透析截留物并置于真空冷冻干燥机中冻干，得到长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂，简称为CLP。
为鉴定本发明的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)的成分，特以本发明实施例1制备的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)为例，对其进行相对分子质量、基本成分测定以及红外光谱和单糖组成分析，各自对应的测定或分析方法如下：
1.相对分子质量的测定：采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对CLP的均一性和分子量进行测定，将CLP用流动相溶解，使其终浓度为5mg/mL，0.22μm的微孔滤膜过滤后进样，进样量为20μL。色谱条件为：流动相为0.05MNaCl溶液，凝胶柱为BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)，流速为0.6mL/min，柱温40℃。以葡聚糖标准品相对分子质量的对数对洗脱体积建立回归方程，得到标准曲线，根据标准曲线计算CLP的相对分子量，CLP的高效凝胶渗透色谱如图1所示。
结合图1分析可见，长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)由三个分子量的多糖共同组成，其平均分子量分别为1.04×104kDa、8.75×102kDa和2.18×102kDa。
2.基本成分测定：以甘露糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定CLP的总糖含量。配置终浓度为0.2mg/mL的葡萄糖标准品，并配置葡萄糖标准品浓度梯度。取200μL各浓度葡萄糖标准品溶液，混合100μL 6％苯酚和500μL浓硫酸，反应后使用酶标仪在490nm测其吸光值并绘制标准曲线，建立回归方程。配置终浓度为1mg/mL的多糖样品，取200μL多糖样品混合100μL 6％苯酚和500μL浓硫酸，反应后使用酶标仪在490nm测其吸光值，根据数值和方程计算样品总糖含量。通过苯酚-硫酸法测定，长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)中的总糖含量为60％±1.0％。
以牛血清蛋白为标准品，采用考马斯亮蓝法测定CLP的蛋白含量。称量50mg考马斯亮蓝G-250，依次加90％乙醇25mL，85％磷酸溶液50mL，加蒸馏水定容至500mL。配置终浓度为0.1mg/mL的牛血清白蛋白标准品溶液，并配置牛血清白蛋白标准品浓度梯度。加考马斯亮蓝溶液振荡混匀后静置3min，酶标仪595nm测其吸光值并绘制标准曲线，建立回归方程。配置终浓度为1mg/ml的多糖样品溶液，混合考马斯亮蓝溶液振荡混匀并静置3min，酶标仪595nm测其吸光值，根据数值和方程计算样品蛋白含量。通过考马斯亮蓝法测定，长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)中未检测出蛋白。
3.采用离子色谱仪测定CLP的单糖组成：精确称取5mg的CLP，加入浓度为2mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液10mL，120℃下加热水解3h；准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入5mL水涡旋混匀，吸取100μL加入900μL去离子水，于12000rpm的转速下离心5min，取上清进行离子色谱分析，CLP的离子色谱图如图2所示。
同时，取16种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、***糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配制成浓度为10mg/ml的标准溶液。取各单糖标准溶液精确配制0.1、0.5、1、5、10、20、50mg/L梯度浓度标准品作为Standard 1-7，根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算摩尔比。
离子色谱仪的测定条件如下：
①色谱柱：DionexCarbopacTMPA20(3*150)；
②流动相：A:H2O；B:250mM NaOH；C:50mM NaOH&500mM NaOAC；
③流速：0.3mL/min；
④进样量：5μL；
⑤柱温：30℃。
经测定分析，长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)主要由半乳糖(37.5％)、葡萄糖(24.9％)、甘露糖(21.6％)、木糖(7.6％)、半乳糖醛酸(4.6％)、葡萄糖醛酸(2.1％)和鼠李糖(0.8％)组成。
4.官能团分析：采用傅氏转换红外线光谱分析仪(FT-IR)对CLP的官能团、糖环构型进行分析，首先称取1～2mg充分干燥的CLP样品，在加热灯下与100mg干燥的溴化钾混合研磨均匀，置于压片机中压至透明片状，再将压片置于红外光谱仪上，于4000～400cm-1区间内进行红外数据收集，CLP的红外光谱图如图3所示。
结合图3分析可见，红外光谱中3402cm-1处的强吸收峰是由于O-H的伸缩振动，2937cm-1和1415cm-1附近的吸收峰分别为C-H的伸缩振动和弯曲振动产生，由此可见长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)具有典型的多糖特征吸收峰。1641cm-1处的吸收峰归属为C＝O伸缩振动，表明长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)含有糖醛酸。1258cm-1处的吸收峰是硫酸基中的O＝S＝O伸缩振动产生，824cm-1处的吸收峰归属为C-O-S，表明长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)的糖残基存在硫酸基修饰；1135cm-1、1053cm-1和1026cm-1处相邻的吸收峰归属为C-O-C与C-O-H的伸缩振动，说明长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)有吡喃环结构。
实验例：
为进一步研究和验证本发明的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)对细胞免疫调节的作用机制，特以本发明实施例1制得的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)为例，以其干预巨噬细胞，通过检测iNOS、COX-2的蛋白表达情况来验证CLP的细胞免疫调节作用效果。
1.实验对象：小鼠来源单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)
2.实验所用主要试剂如表1所示：
表1实验试剂
3.RAW264.7细胞的培养和传代：
在DMEM培养基中加入10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)双抗，作为RAW264.7细胞的完全培养液。用完全培养液重悬混匀后置于无菌的培养瓶中，放在37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁几乎长满培养瓶底部时进行传代。
传代时，先将旧培养基吸弃，用PBS缓冲液清洗2次后，加入5mL新鲜的完全培养基，将细胞从瓶壁吹打下来，将细胞悬液按照一定比例传代至新细胞培养瓶中，放在细胞培养箱中继续培养。
4.CLP细胞免疫调节效果的验证：
采用蛋白质印迹法(Western blot)检测RAW264.7细胞中的一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)和环氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)的蛋白表达情况，操作方法如下：
①分别设立实验组、空白组以及对照组，各组的实验条件如下：
实验组：各组分别采用浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂(CLP)干预RAW264.7细胞；
空白组：RAW264.7细胞不做任何干预；
对照组：各组分别采用浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)干预RAW264.7细胞；
②收集实验组、空白组以及对照组的RAW264.7细胞，裂解细胞，收集蛋白并检测浓度：通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，转PVDF膜，室温封闭2h，加入稀释的一抗(COX-2，iNOS)，4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次；然后加入稀释的偶联有辣根过氧化物酶的二抗，室温孵育1h，显影。各个组的蛋白质印迹法检测结果如图4所示。
结合图4分析可见，在实验组中，随着CLP浓度的增加，RAW264.7细胞的iNOS和COX-2的蛋白表达量明显增加，且当CLP浓度为100μg/ml时，两种蛋白的表达量最高。根据一些文献报道，CLP可显著促进RAW264.7细胞释放一氧化氮，并促进RAW264.7细胞分泌IL-1β、IL-6以及TNF-α等细胞因子，并促进相关细胞因子基因表达，这与iNOS蛋白表达量的增加相符合。由于iNOS和COX-2是NF-κB信号转导通路中两种重要的信号蛋白分子，可以推断CLP是通过激活NF-κB途径，增加iNOS和COX-2的表达。静息细胞胞液中的NF-κB二聚体与IκB蛋白相互作用后被抑制，暴露于促炎症刺激后，IκB激酶磷酸化、泛素化继而降解IκB抑制蛋白。而释放的NF-κB二聚体被转移至细胞核，并诱导细胞因子相关基因的表达，促进细胞因子的分泌，从而发挥细胞免疫调节作用。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施例的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施例予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.原料预处理：取长茎葡萄蕨藻样品，自然晾干后充分粉碎；
S2.热水浸提：取步骤S1所得的长茎葡萄蕨藻粉末，与蒸馏水按1g:15～35mL的料液比混合，搅拌均匀后在80～90℃条件下，浸提1～3小时；
S3.浓缩离心：将步骤S2中的浸提溶液进行过滤，所得滤液在45～60℃下旋转蒸发至原体积的1/5～1/4，然后离心处理15～20min，并收集上清液；
S4.乙醇沉淀：在步骤S3所得的上清液中加入无水乙醇，沉淀12～24小时后离心处理，收集沉淀物；
S5.除游离蛋白：将步骤S4中收集的沉淀物用蒸馏水复溶，所得溶液与洗脱试剂按比例混合后，在室温下搅拌30～60min，然后离心处理10～15min，收集上层清液；
S6.透析冻干：将步骤S5中收集的上层清液转入透析袋中，采用蒸馏水透析48～72h，取出透析截留物并真空冻干，得到长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂。
2.根据权利要求1所述的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，将长茎葡萄蕨藻粉末与蒸馏水按1g:20mL的料液比混合，搅拌均匀后在85℃条件下，浸提3小时，重复浸提两次。
3.根据权利要求1所述的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，将浸提溶液进行过滤后，所得滤液在55℃下旋转蒸发至原体积的1/5，然后离心处理，收集上清液。
4.根据权利要求1所述的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，其特征在于，在步骤S5中，复溶所得溶液与洗脱试剂按4:1的体积比进行混合，室温下搅拌60min，然后离心处理15min，收集上层清液，重复洗脱后，合并所收集的上层清液。
5.根据权利要求3所述的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，其特征在于，在步骤S5中，所用洗脱试剂由三氯甲烷和正丁醇按4:1的体积比混合而成。
6.根据权利要求1所述的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，乙醇沉淀处理时，无水乙醇与上清液的体积比为3:1。
7.根据权利要求1所述的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，其特征在于，在步骤S6中，所用的透析袋的截留分子量为3000Da，采用蒸馏水透析72小时。
8.根据权利要求1所述的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，离心处理的相对离心力为22000×g，离心处理时间为20min。
9.如权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂在细胞免疫调节中的应用。
10.根据权利要求9所述的长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂在细胞免疫调节中的应用，其特征在于，所述长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂用于促进巨噬细胞的COX-2和iNOS的蛋白表达。
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