CN102268085A - 重组细胞球蛋白在延缓皮肤衰老中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组大鼠细胞球蛋白在延缓皮肤衰老中的应用，所述重组大鼠细胞球蛋白，通过构建基因工程菌pET22b-Cygb/E.coli.BL21(DE3)筛选高表达重组大鼠细胞球蛋白菌株，分离纯化鉴定得到高纯度重组大鼠细胞球蛋白。

Description

重组细胞球蛋白在延缓皮肤衰老中的应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及重组大鼠细胞球蛋白在延缓皮肤衰老中的应用。 

背景技术：

衰老是机体各种组织、器官功能随年龄增长所发生的退行性变化。衰老与人类寿命和死亡密切相关，它是一个复杂的生理过程，涉及诸多领域，是机体各种生化反应的综合表现，同时也是体内外许多因素共同作用的结果。衰老导致生物有机体对各种应激的抵抗能力降低，生物功能进行性衰退，同时更易受到各种疾病的影响。覆盖机体全身的皮肤是机体衰老过程中最为明显的器官之一。随着年龄的增长，皮肤会发生退行性变，表现为皮肤变薄、含水量减少、萎缩、起皱、弹性降低等。有关衰老的机理，学者们曾提出许多学说。 

皮肤衰老分为两种类型：自然衰老，即随年代增长造成的生理性衰老和光老化，即由外界环境因素主要是紫外线(ultraviolet，UV)照射引起的衰老。现已提出一系列衰老学说，主要包括自由基学说、线粒体DNA损伤学说、衰老的端区学说、免疫学说(immunological theory)、光老化学说、内分泌学说(endocrine theory)等。衰老的皮肤中，由于MMPs(基质金属蛋白酶)的表达量提高或者活性增强，造成细胞外基质重要组成成分胶原(Ⅰ型和Ⅲ型胶原为主)和弹性蛋白发生进行性退化。MMPs表达过量和对细胞外基质重建发挥重要作用的基质金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhibitor of MMP，TIMPs)表达量降低，是皮肤衰老的两个重要特征。皮肤衰老的组织学改变主要是胶原蛋白减少和弹性纤维增加；分子学改变主要包括表皮增生和分化性标志表达异常。外界环境中UV照射对人类皮肤***产生严重损伤，光老化导致细胞活力降低，细胞膜损伤和弹性组织变性(弹性蛋白/原纤维蛋白沉积)。与光老化皮肤外观上相比较，自然衰老的皮肤更薄，色素沉积更加均匀，更加松弛而且细纹相对较多。 

细胞球蛋白(Cytoglobin，Cygb)，是近几年来在脊椎动物中发现的六配位血红素球蛋白(hxHb)超家族中的新成员，在多种生物及组织中表达。已有多项研究初步表明，细胞球蛋白Cygb可能具有促进皮肤等上皮组织的生长、减缓衰老、抗氧化和抗炎症等 功能。 

发明人通过构建基因工程菌pET22b-Cygb/E.coli.BL21，筛选高表达大鼠Cygb菌株，分离纯化鉴定得到高纯度重组大鼠Cygb。利用皮肤细胞H₂O₂氧化应激损伤模型及D-galactose致小鼠局部皮肤衰老模型等，研究了Cygb的在延缓皮肤衰老中的抗氧化及相关功能，探讨了Cygb在抗炎症及促进皮肤创伤愈合方面的作用。 

发明内容：

本发明提供一种重组大鼠细胞球蛋白(Cygb)，以及所述重组大鼠细胞球蛋白在延缓皮肤衰老中的应用。 

本发明所述的重组大鼠细胞球蛋白，通过构建基因工程菌pET22b-Cygb/E.coli.BL21(DE3)，筛选高表达重组大鼠细胞球蛋白菌株，分离纯化鉴定得到高纯度重组大鼠细胞球蛋白。 

本发明所述的重组大鼠细胞球蛋白，具体经过以下步骤制备： 

(1)采用基因工程的方法构建高效表达重组大鼠细胞球蛋白的基因工程菌pET22b-Cygb/E.coli.BL21(DE3)； 

(2)基因工程菌经大量培养后，经离心得到菌体沉淀经反复冻融后，重悬得粗蛋白提取液，上清总蛋白分别经DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、Sephacryl S-100凝胶过滤层析及Sephadex G25脱盐层析纯化，得到高纯度重组Cygb蛋白，通过WesternBlotting，鉴定纯化后重组大鼠细胞球蛋白的准确性。 

本发明制备重组大鼠细胞球蛋白更加详细的过程记载在实施例中。 

本发明还包括，用本发明的重组大鼠细胞球蛋白作为药物活性成分制备的药物组合物。 

本发明的药物组合物，根据需要可以含有药物可接受的载体，其中所述的重组大鼠细胞球蛋白作为药物活性成分，其在制剂中所占重量百分比可以是0.01-99.99％，其余为药物可接受的载体。本发明的药物组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒，口服液的每瓶，颗粒剂的每袋，注射剂的每支等。 

本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：滴丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。 

本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。 

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。 

可以通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。 

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或***胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。 

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。 

本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性地加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。 

本发明的药物制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，如每日1-3次，每次1-3 支。 

本发明还包括，本发明的重组大鼠细胞球蛋白在制备延缓皮肤衰老药物中的应用。

本发明的重组大鼠细胞球蛋白在制备减轻细胞氧化损伤药物中的应用。 

本发明的重组大鼠细胞球蛋白在制备提高细胞抗氧化能力药物中的应用。 

本发明的重组大鼠细胞球蛋白在制备抗炎症药物中的应用。 

本发明的重组大鼠细胞球蛋白在制备促进皮肤创伤愈合药物中的应用。 

通过以下实验进一步研究重组大鼠Cygb在延缓皮肤衰老方面的作用。 

实验一：重组Cygb抗细胞氧化损伤功能研究 

细胞氧化应激模型构建 

FB细胞氧化应激模型： 

从图1中可以看出，FB细胞经H₂O₂处理后，随H₂O₂浓度增加，细胞增殖活力逐渐降低，1300μm H₂O₂处理细胞6h后，与空白组相比细胞增殖活力下降至(48.21±1.94)％；而同等浓度H₂O₂处理24h与处理6h相比，细胞活力明显增强(p＜0.01)，说明较高浓度H₂O₂(500～900μm)长时间(24h)作用于FB细胞后，细胞RGR有一定增强。曾有文献报道，PC12细胞经10μmol/L H₂O₂预处理90min后，在100μmol/L H₂O₂作用24h后，与未经H₂O₂预处理的PC12细胞相比，其细胞凋亡率明显下降，而且差异极显著(P＜0.01)，表明H₂O₂预处理对H₂O₂诱导PC12细胞凋亡具有保护作用。 

从图2中可看出，低浓度(0.1，0.5mM)tBHP对细胞RGR没有明显影响(p＞0.05)，随tBHP浓度升高和处理时间延长，细胞RGR明显降低(p＜0.01)，如4mM tBHP作用FB细胞6h后，细胞RGR只有对照组的(50.98±2.79)％。 

HaCAT细胞氧化应激模型： 

低浓度H₂O₂(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mM)和低浓度tBHP(0.1、0.2、0.3、0.4mM)分别作用于3h、6h、9h HaCAT后(图3)，观察实验结果可发现，与空白对照组比，低浓度H₂O₂(0.1～0.4mM)作用9h对HaCAT细胞RGR没有明显影响(p＞0.05)，而0.5mMH₂O₂处理HaCAT 6h及9h后，细胞RGR分别只有对照组的(68.53±3.21)％和(53.10±1.44)％；而低浓度t-BHP作用于HaCAT后随浓度增加和处理时间延长，HaCAT细胞RGR明显降低(p＜0.01)，如0.4mM tBHP处理细胞9h后，HaCAT细胞的RGR只有对照组的(30.98±0.59)％。提示：低浓度H₂O₂在短时间内对HaCAT细胞没有造成明显损伤，而低浓度tBHP在短时间(9h)内就能够对HaCAT细胞造成很强的氧化应激损伤。 

较高浓度H₂O₂(0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mM)和较高浓度tBHP(0.5、1、1.5mM) 分别作用于HaCAT 3h，6h，12h(图4)后，与对照组相比，两者均对HaCAT造成严重氧化损伤，细胞RGR均显著下降(p＜0.01)。如1mM H₂O₂和1.5mM tBHP作用于HaCAT12h后，细胞RGR均下降至正常细胞的30％左右。 

重组Cygb细胞毒性检测： 

将无菌抽滤后的重组Cygb进行梯度稀释，按终浓度分别为4×10^-4，2×10^-3，1×10^-2，5×10^-2，25×10^-2，1，5，12.5，50μg/ml作用于FB和HaCAT，作用时间分别为24h，48h，72h，96h，待作用时间结束后显微镜下观察记录细胞形态并用MTT法测得OD492值。从图5和图6中经统计学分析可以发现，与空白对照组相比，各种浓度的Cygb作用于两种细胞后，各组细胞RGR均无显著差异(p＞0.05)。提示：重组Cygb对两种皮肤细胞均无毒性。 

按图5、6实验设计HaCAT细胞做相同处理后，采用结晶紫染色法测得各组细胞OD578值。从图7和图8中经统计学分析可以看出，各种浓度的Cygb对两种细胞的RGR没有明显影响(p＞0.05)，与空白对照组相比，均无显著差异(p＞0.05)。结晶紫染色法实验结果同样表明，重组Cygb对两种皮肤细胞均无明显毒性。 

重组Cygb抗细胞氧化应激损伤功能检测 

重组Cygb抗H₂O₂细胞氧化应激损伤功能研究 

FB细胞模型： 

将FB接种于96孔板中，待细胞贴壁后，开始实验处理。实验分为空白对照组，模型组(H₂O₂处理组)，实验组(Cygb预处理组，终浓度分别为2，10，50μg/ml)，阳性对照组(Ve终浓度为25μm)，每组设立6个平行孔，实验组和阳性对照组分别加Cygb和25μm Ve进行预处理，然后用H₂O₂处理(700μm，3h)，模型组只用H₂O₂处理。对于FB，H₂O₂浓度为700μm，处理时间为3h；对于HaCAT，H₂O₂浓度为500μm，处理时间为6h。 

模型组FB细胞经700μm H₂O₂处理3h后产生明显细胞毒性，RGR下降至(62.28±3.27)％；而重组Cygb对细胞进行预处理能显著降低H₂O₂对细胞的毒性，其中50μg/ml Cygb预处理能显著降低H₂O₂对细胞的毒性(RGR＝(88.15±9.27)％)，25μm VE也能发挥抗氧化作用(68.00±2.60)％(P＜0.01)，但保护作用不及50μg/ml Cygb(P＜0.01)，其中低浓度2μg/ml Cygb预处理细胞对于提高细胞RGR没有明显效果，中等浓度10μg/ml Cygb预处理细胞对于减轻H₂O₂的氧化应激作用也有显著作用(P＜0.05)。证明重组Cygb预 处理细胞能够明显减轻H₂O₂对细胞的氧化应激损伤。 

模型组中700μm H₂O₂作用于FB细胞3h后，相差显微镜下观察可发现FB细胞形态发生明显变化，与对照组的长梭形细胞相比，多数细胞变的较皱缩，有的甚至变为球形，同时贴壁细胞数量减少，而Cygb预处理组和阳性对照组中大部分细胞形态仍为长梭形，而且与模型组相比细胞数量较多；其中高浓度Cygb预处理组FB细胞形态和数量均优于低浓度Cygb预处理组。 

HaCAT细胞模型： 

对于HaCAT，重组Cygb梯度稀释后进行预处理(终浓度分别为5×10^-2，25×10^-2，1，5，12.5，25，50μg/ml)，然后用500μm H₂O₂作用6h，模型组只用H₂O₂处理，相差显微镜下观察并记录各组细胞形态及贴壁情况。 

从MTT结果(图9)可以分析看出，与模型组(model group)相比，50μg/ml Cygb预处理组能够显著提高细胞的RGR(p＜0.01)，且随着Cygb浓度增加，细胞的RGR越高，说明Cygb预处理能够降低H₂O₂导致的细胞损伤，并且具有剂量依赖性，但是25μmVe预处理的保护作用不及50μg/ml Cygb。模型组(model group)贴壁细胞数量明显减少，同时细胞变得皱缩，而Cygb预处理后细胞形态和数量相比模型组都有很大改善，50μg/ml Cygb预处理组中细胞形态和数量与对照组相比无明显差别，但是阳性对照组的细胞状态不及50μg/ml Cygb预处理组。由此判断，50μg/ml Cygb的抗氧化应激作用优于25μm VE。 

500μm H₂O₂处理细胞后，与空白对照组相比，模型组中细胞数量和形态发生均发生明显改变，细胞数量明显减少而且变得皱缩；Cygb预处理组与模型组相比细胞数量有所增加，而且细胞形态也比较正常，以50μg/ml Cygb效果最好；另外25μm VE预处理的阳性对照组细胞与模型组相比在细胞数量和细胞形态方面均有明显改观。 

细胞内超氧化物阴离子水平检测： 

通常用含有10μm Dihydroethidium(DHE)的D-Hank’s溶液与细胞一起37℃孵育30分钟左右进行荧光探针装载，随后用D-Hank’s洗涤。DHE被活细胞摄入后，可以在细胞内的超氧化物阴离子作用下脱氢，产生ethidium。Ethidium可以和RNA或DNA结合产生红色荧光。当细胞内的超氧化物阴离子水平较高时，产生的ethidium较多，红色荧光就较强，反之则较弱。DHE本身为蓝色荧光，最大激发波长为370nm，最大发射波长为420nm，脱氢后和RNA或DNA结合产生红色荧光，最大激发波长为300nm，最大发 射波长为610nm。 

700μm H₂O₂处理FB 3h后，荧光显微镜下观察可以发现，与空白对照组相比，模型组细胞内红色荧光量明显增多，提示H₂O₂处理FB后，细胞内超氧化物阴离子含量明显增加；另外重组Cygb预处理细胞后，发现预处理组细胞内红色荧光含量相比模型组明显降低，提示重组Cygb预处理细胞明显降低了细胞内超氧化物阴离子的含量，比较各预处理组可发现，其中50μg/ml Cygb预处理具有最佳抵抗H₂O₂细胞氧化应激效果，效果优于阳性对照组(25μm VE)；另外25μm VE阳性对照组预处理细胞后，与模型组相比，细胞内超氧化物的含量也有较明显降低。此结果与之前细胞氧化应激模型中实验结果相一致。 

荧光显微镜下观察可以发现，500μm H₂O₂处理HaCAT 6h，模型组细胞与空白对照组相比，细胞内超氧化物阴离子含量明显增加，表明H₂O₂处理细胞导致细胞产生明显氧化应激损伤；另外重组Cygb预处理(2μg/ml，10μg/ml，50μg/ml Cygb)后，均明显降低了细胞内超氧化物阴离子的含量，其中50μg/ml Cygb预处理具有最好的抗氧化应激效果，其效果优于25μm VE预处理组；另外，与模型组相比，阳性对照组(25μm VE)预处理后，细胞内超氧化物的含量也有所降低。提示较高浓度重组Cygb预处理细胞，对于降低细胞内超氧化物阴离子含量、减轻细胞氧化应激损伤具有良好作用。 

相关抗氧化因子水平测定： 

FB细胞模型中相关因子水平测定 

表1处理后的FB细胞培养液中SOD、MDA、LDH含量测定 

*代表与模型组相比p＜0.05；**代表与模型组相比p＜0.01； 

由表1和图10可以看出，H₂O₂(500μm，3h)致FB氧化应激损伤后，模型组(Modelgroup)中细胞培养液中SOD的含量显著低于空白对照组(p＜0.01)，其含量约只有对照组的81.3％；Cygb预处理组和阳性对照组(25μm VE)细胞培养液中，SOD含量相比模 型损伤组均有所增加，但50μg/ml Cygb预处理后细胞培养液中，SOD含量相比模型损伤组显著增加(p＜0.01)；2μg/ml，10μg/ml Cygb预处理组和阳性对照组(25μm VE)细胞培养液中，SOD含量与模型组相比有所增加，但经统计分析表明均没有明显差异(p＞0.05)；统计分析结果表明，25μm VE预处理组与50μg/ml Cygb预处理组相比，后者细胞培养液中SOD活力显著高于前者(p＜0.01)，因此从提高细胞培养液中SOD活力角度考虑，50μg/ml Cygb对H₂O₂导致的FB氧化应激损伤有更好的保护作用。 

由表1和图11可以看出，H₂O₂致FB氧化应激损伤后，模型损伤组细胞脂质过氧化程度明显增强，其细胞培养液中，MDA的含量相比空白对照组显著增加(p＜0.01)，其中2μg/ml Cygb预处理组和阳性对照组(25μm VE)细胞培养液中MDA的含量相比模型组有所下降，但无显著差异(p＞0.05)，而10μg/ml，50μg/ml Cygb预处理组细胞培养液中，MDA的含量与模型组相比均明显下降(p＜0.05，p＜0.01)，由此可以说明，10μg/ml，50μg/ml Cygb预处理对于降低H₂O₂导致的细胞脂质过氧化程度、减轻细胞氧化应激损伤具有明显效果。 

分析表1和图12可以看出，500μm H₂O₂处理3h导致FB产生明显氧化应激损伤，模型损伤组细胞培养液中，LDH的含量相比空白对照组显著增加(p＜0.01)，表明模型损伤组细胞的细胞膜受到明显损伤；而2μg/ml，10μg/ml，50μg/ml Cygb预处理组及阳性对照组(25μm VE)细胞培养液中，LDH的含量与模型组相比均明显下降(p＜0.01)，可见Cygb预处理及25μm VE预处理细胞后，对500μm H₂O₂氧化损伤细胞导致的细胞膜损伤具有明显保护作用，而且各个预处理组之间无显著差异(p＞0.05)。 

HaCAT细胞H₂O₂氧化应激损伤模型中相关抗氧化因子水平测定： 

SOD含量测定： 

注(Note)：从表2中可以看出，模型组中H₂O₂处理后细胞培养液和细胞裂解液中T-SOD活性显著低于空白对照组，T-SOD活性分别只有空白对照组的40％和52％左右(p＜0.01)；而三种浓度(12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml)Cygb预处理组中细胞培养液和细胞裂解液中，T-SOD活性均显著高于H₂O₂氧化应激模型组(p＜0.01)，各Cygb预处理组与阳性对照组(25μm Vitamin E)相比，T-SOD活性有极显著差异(p＜0.01)而且明显高于正常细胞组，说明重组Cygb和Vitamin E对于增强细胞中SOD活力均有显著作用，同时表明，重组Cygb预处理对于抵抗H₂O₂造成的HaCAT中SOD活力下降比25μmVitamin E有更显著作用(p＜0.01)。 

表2处理后的HaCAT中细胞培养液和细胞裂解液的SOD含量检测 

**代表与模型组相比P＜0.01； 

MDA含量测定： 

从表3中可以看出，模型组中H₂O₂处理后细胞培养液和细胞裂解液中MDA含量显著高于空白对照组(p＜0.01)；而各种浓度Cygb预处理组(0.6，1.2，2.4μM)分别等同于0.6，1.2，2.4μM)及阳性对照组(25μm Vitamin E)中，细胞培养液和细胞裂解液中MDA含量均显著高于H₂O₂氧化应激模型组(p＜0.05；p＜0.01)；同时各Cygb预处理组与阳性对照组(25μm Vitamin E)相比，MDA含量有极显著差异(p＜0.01)，说明适当浓度重组Cygb(12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml)在减轻H₂O₂导致的细胞脂质过氧化程度方面比25μm Vitamin E具有更佳效果。 

表3处理后的HaCAT细胞中培养液和细胞裂解液的MDA含量检测 

*代表与模型组相比p＜0.05；**代表与模型组相比p＜0.01； 

LDH含量测定： 

从表4中可以看出，H₂O₂处理模型组中细胞经H₂O₂处理后，细胞培养液和细胞裂解液中LDH活性显著高于空白对照组(p＜0.01)，表明细胞膜受到明显损伤；而三种浓度(0.6，1.2，2.4μM)Cygb预处理组中，细胞培养液和细胞裂解液中LDH活性均显著 低于H₂O₂氧化应激模型组(p＜0.01)；各Cygb预处理组与阳性对照组(25μm Vitamin E)相比，LDH活性有极显著差异(p＜0.01)；阳性对照组(25μm Vitamin E)与模型组相比，细胞培养液中LDH含量显著降低(p＜0.01)，而细胞裂解液中无显著差异(p＞0.05)；由以上实验结果及分析可以判断，与25μm VitaminE相比，重组Cygb在减轻H₂O₂氧化应激造成的细胞膜损伤方面具有更佳效果。 

表4处理后的HaCAT细胞中培养液和细胞裂解液的LDH含量检测 

*代表与模型组相比p＜0.05；**代表与模型组相比p＜0.01； 

PCNA细胞免疫荧光染色： 

HaCAT细胞核PCNA染色 

细胞核PCNA染色，荧光显微镜下观察记录PCNA染色情况。各浓度重组Cygb(50，10，2μg/ml)与FB细胞孵育24h后，荧光显微镜下观察可发现，PCNA的含量与对照组相比无明显差异，可以初步推断，重组Cygb对成纤维细胞的增殖无明显影响，与前期MTT实验结果比较一致。 

HaCAT细胞经各浓度大鼠重组Cygb分别孵育24h后，分别观察光镜及荧光显微镜下细胞数量和形态对比发现，细胞核内PCNA的含量与对照组无明显区别，说明重组Cygb对于HaCAT细胞的增殖速率无明显影响，推测可能是由于细胞表面无特异性受体，因此蛋白无法进入细胞内部发挥作用。 

重组Cygb抗tBHP致细胞衰老功能研究： 

几种浓度重组Cygb(终浓度为2，10，50μg/ml)预处理FB细胞后，用0.2mM tBHP分别作用于细胞3h，6h(图13)，作用结束后显微镜下观察比较细胞形态，并测定细胞的相对增值率RGR。从图13中数据统计分析可发现，重组Cygb预处理组细胞活力与模型损伤组相比均无显著差异(P＞0.05)，推测重组Cygb对于tBHP造成的细胞氧化衰老损伤无明显保护功能。 

观察实验处理后各组细胞形态可发现，空白对照组中FB细胞贴壁伸展成长梭形， 而tBHP处理组及Cygb预处理组细胞变得皱缩，有部分细胞变成圆形，同时相比正常FB细胞贴壁细胞数量减少；tBHP处理组与Cygb预处理组细胞相比无明显区别，上图中已经分析发现两组细胞增殖率无明显区别，可见两结果较一致，进一步推断，重组Cygb在抵抗tBHP导致的细胞应激衰老损伤方面无明显功能。 

从图14结果可以明显发现，0.5mM tBHP作用于HaCAT细胞3h，6h后，与对照组相比细胞活力明显降低，经统计分析后可发现，各浓度重组Cygb预处理组与tBHP模型组相比，细胞活力无明显差异(p＞0.05)，同样可推测，重组Cygb对于tBHP造成的HaCAT细胞氧化衰老损伤无明显保护作用。同时观察各组细胞形态变化可发现，相比空白组正常HaCAT细胞，tBHP处理组及重组Cygb预处理组细胞均变得皱缩，贴壁细胞数量减少；重组Cygb预处理组无明显改观，可判断重组Cygb对tBHP造成的HaCAT细胞氧化损伤无明显效果。 

实验结果显示，利用FB及HaCAT两种皮肤细胞氧化应激模型证明，Cygb对细胞进行预处理能够显著降低H₂O₂对细胞造成的氧化应激损伤；表明重组Cygb在抵抗H₂O₂导致的细胞氧化应激损伤方面具有明显作用，同时对细胞无毒性，细胞经重组Cygb预处理后，细胞内SOD含量显著提高，同时脂质过氧化产物MDA含量明显降低，而SOD是机体内重要抗氧化酶之一，其活力和含量能够反映机体清除自由基的能力。随着年龄的增长，SOD清除氧自由基的能力逐渐下降是衰老的重要指标之一。MDA是过氧化脂质的分解产物之一，能使膜交联和聚集，并最终导致DNA的交联，引起突变，因此MDA也可以间接反映体内自由基产生和老化程度。提示：重组Cygb通过发挥其过氧化物酶活性在抵抗H₂O₂导致的细胞氧化应激损伤方面具有明显作用。 

通过细胞核PCNA染色可发现，Cygb在促进细胞增殖方面无明显作用，由于细胞表面无Cygb的特异性受体，对其进入细胞内部发挥作用起到阻碍作用；同时在研究过程中发现，重组Cygb对于tBHP造成的细胞氧化损伤无明显保护作用 

实验二：重组大鼠Cygb抗小鼠局部皮肤衰老及相关功能检测 

D-galactose(D-gal)致小鼠局部皮肤衰老实验：饲养KM小鼠，连续6周每日背部皮下注射D-gal(1000mg/kg·d^-1)，实验组小鼠另外每日分别腹腔注射无菌Cygb(三个剂量浓度分别为0.75，1.5，3.0mg/kg·d^-1)，采用Vitamin E(50mg/kg·d^-1)及SOD(5KU/kg·d^-1)作为阳性对照。 

抗衰老功能测定 

体重变化： 

表5D-gal致小鼠皮肤衰老模型实验中各组小鼠的体重变化 

体重(g)    0week        1steek       2ndweek      3rdweek      4thweek      5tgweek      6tgweek
	正常组     26.88±1.51  28.46±1.16  30.72±1.03  34.56±1.69  35.10±1.60  36.40±1.81  39.70±2.66
D-gal      27.22±1.60  29.66±1.92  32.66±2.17  37.34±2.99  38.62±3.04  39.15±4.09  41.95±5.32
	低剂量     26.20±0.91  28.20±1.43  31.84±2.18  36.34±3.23  36.80±2.85  38.02±2.98  40.96±3.90
中剂量     27.26±2.35  27.86±2.01  29.56±2.18  35.60±2.68  36.12±2.40  36.74±1.92  38.13±3.30
	高剂量     27.26±2.78  29.30±3.70  32.40±4.30  36.58±4.61  37.08±4.84  38.68±5.31  39.60±5.07
Vitamin E  27.58±2.94  29.73±1.97  29.50±1.57  35.30±2.34  35.83±2.77  37.33±2.62  40.55±3.45
	SOD        26.20±2.87  29.58±1.84  29.26±2.73  34.93±3.46  35.38±2.33  36.15±2.24  37.08±3.15

分析表5中各组小鼠体重数据可以发现，实验开始前(0week)随机分配编号的各组小鼠体重均为(25±2)g，各组之间无显著差异(p＞0.05)，实验过程中，各组小鼠体重均平稳增加，实验结束后各组小鼠体重均增长至40g左右，比较正常组、D-gal组及其它各实验组小鼠体重可以发现，各实验组小鼠体重与D-gal组(模型组)小鼠体重相比较没有显著差异(p＞0.05)，D-gal组与正常组相比也无显著差异(p＞0.05)。说明D-gal、重组Cygb、Vitamin E及SOD注射后对小鼠体重均无显著差异。

氧化相关因子水平测定 

SOD含量测定： 

表6血清和皮肤组织匀浆中总SOD含量检测 

*代表与模型组相比p＜0.05；**代表与模型组相比p＜0.01； 

由表6可以看出，D-gal组小鼠血清和皮肤匀浆组织中，T-SOD含量与正常组小鼠 相比均有极显著差异(p＜0.01)，说明动物模型造模很成功；与D-gal组相比，三个Cygb剂量组及Vitamin E腹腔注射，均能显著提高小鼠血清和皮肤匀浆组织中T-SOD含量(p＜0.01)；同时每日SOD腹腔注射也能显著缓解D-gal致小鼠血清中T-SOD含量下降(p＜0.05)，极显著提高小鼠皮肤组织中T-SOD含量(p＜0.01)。低、中剂量Cygb组及Vitamin E组与正常组相比，血清和皮肤中T-SOD含量均有明显提高(p＜0.01)，同时高剂量Cygb组及SOD组中T-SOD含量也达到正常水平。提示，小鼠腹腔注射重组Cygb能够显著减轻由于D-gal造成的小鼠皮肤抗氧化能力降低。 

总羟脯氨酸含量测定 

表7血清和皮肤组织匀浆中总羟脯氨酸含量检测 

*代表与模型组相比p＜0.05；**代表与模型组相比p＜0.01； 

由表7可以看出，D-gal组小鼠血清和皮肤组织匀浆中的羟脯氨酸含量显著低于正常组，其含量均只有正常组的60％左右；低、中、高Cygb剂量组中羟脯氨酸含量均显著高于D-gal组(p＜0.01)，其中以中剂量Cygb组小鼠血清和皮肤组织中羟脯氨酸含量最高，其羟脯氨酸已达到甚至超过正常组水平，说明Cygb在缓解并提高D-gal致小鼠血清和皮肤组织匀浆中羟脯氨酸水平具有明显作用；Vitamin E组及SOD组小鼠羟脯氨酸含量显著高于D-gal组(p＜0.01)；同时可发现Vitamin E及SOD在分别提高小鼠血清和皮肤组织均浆中羟脯氨酸含量方面比各剂量重组Cygb组具有更好的抗衰老效果。 

GSH-PX含量测定： 

从表8中可以看出，与正常组相比较，连续颈背部皮下注射D-gal后，小鼠血清和皮肤组织匀浆中GSH-PX显著下降(p＜0.01)，组织中GSH-Px含量小于正常小鼠皮肤含量的45％；三个Cygb剂量组、VitaminE组及SOD组中小鼠血清和皮肤组织匀浆中GSH-Px含量均显著高于模型组(p＜0.01)，Cygb的抗氧化作用呈现剂量依赖性，高剂量 Cygb表现出最佳抗氧化效果；同时VitaminE组及SOD组中GSH-Px含量高于三个剂量Cygb实验组，在提高GSH-Px含量、增强抗氧化功能方面的作用优于重组Cygb。 

表8血清和皮肤组织匀浆中GSH-PX含量检测 

*代表与模型组相比p＜0.05；**代表与模型组相比p＜0.01； 

MDA含量测定： 

表9血清和皮肤组织匀浆中MDA含量检测 

*代表与模型组相比p＜0.05；**代表与模型组相比p＜0.01； 

从表9中数据分析可以看出，与正常组小鼠相比，D-gal颈背部皮下注射显著增加了模型组小鼠血清和皮肤组织中MDA的含量(p＜0.01)，说明模型组小鼠由于D-gal代谢紊乱导致机体脂质过氧化程度明显增强；SOD腹腔注射在缓解脂质过氧化产物MDA生成方面相比其它各实验组具有最好的效果，SOD注射使小鼠血清和皮肤组织中MDA含量低于正常组水平，由此可见SOD在抗氧化方面的作用；同时三个Cygb剂量组处理与D-gal组相比，也显著降低了MDA的生成(p＜0.01)，起到比较明显的抗脂质过氧化的效果；其次与D-gal组相比，可见Vitamin E在降低皮肤组织中MDA的生存方面也有明显作用(p＜0.05)。 

乳酸脱氢酶含量测定： 

从表10中数据可以看出，与正常组相比较而言，D-gal降低小鼠血清中LDH含量(p＜0.01)，却增加了皮肤组织匀浆LDH含量(p＜0.01)，由此可见D-gal对小鼠血清及皮肤组织中LDH含量没有定量影响；但与D-gal组相比，三个Cygb剂量组及SOD组中小鼠血清和组织匀浆中LDH含量明显下降(p＜0.01)，说明实验组中小鼠细胞完整性得到一定程度保护。 

表10血清和皮肤组织匀浆中乳酸脱氢酶含量检测 

*代表与模型组相比p＜0.05；**代表与模型组相比p＜0.01； 

病理组织切片观察： 

各组小鼠颈背部皮肤组织切片的显微镜下观察，可以明显地区分表皮、真皮和皮下脂肪空泡组织，细胞核呈现蓝紫色，而细胞质呈现淡红色。分析各张切片可以发现：(1)正常组小鼠皮肤表皮薄但结构层次清晰完整，真皮组织中胶原纤维排列正常，同时真皮下脂肪组织较少；(2)D-gal组与正常组相比较，真皮厚度明显降低，胶原纤维含量明显减少，同时皮下脂肪空泡组织明显增多，而这都是皮肤衰老的表现；(3)低剂量组小鼠皮肤表皮结构完整，与正常组小鼠皮肤相比真皮胶原纤维含量明显减少，同时皮下脂肪填充量增多；但是相对D-gal组小鼠真皮胶原纤维含量明显增多，皮下脂肪填充量减少；(4)中剂量组小鼠皮肤结构明显趋于正常化，真皮胶原纤维增多且排列紧密，表皮厚度有一定增加；(5)与D-gal组相比，高剂量组小鼠皮肤表皮厚度明显增加，同时真皮胶原纤维紧密交错排列，较中剂量有所增加，皮下脂肪空泡组织填充量明显减少；(6)Vitamin E组、SOD组两个阳性对照组与D-gal组相比，小鼠皮肤表皮和真皮厚度明显增加，同时胶原纤维排列紧密含量增加，皮下脂肪含量也有所下降。 

二甲苯致小鼠耳廓肿胀急性炎症实验模型： 

二甲苯致小鼠耳廓肿胀急性炎症模型：每只小鼠耳廓外侧均匀涂抹20μl二甲苯30 min，小鼠耳廓肿胀至最大极限后，耳廓内侧均匀涂抹无菌Cygb(100，200，400μg/g)，阳性对照组均匀涂抹***，作用1h后麻醉小鼠，剪下双耳朵，叠在一起打孔后精确称量两圆片重量，分析得出肿胀抑制率。 

从图15中可以看出，通过利用二甲苯致小鼠耳廓肿胀急性炎症模型检测重组Cygb的抗炎症作用，纵坐标表示各组小鼠耳廓肿胀量，通过比较各组小鼠耳廓肿胀量，与基质组相比，可容易发现用药后肿胀程度均有所降低，同时高剂量组小鼠耳廓肿胀程度最低，效果略好于***阳性对照组，但没有明显差异(p＞0.05)，中剂量实验组的抗炎效果与***阳性对照组也无明显差异(p＞0.05)；另外，可明显看出低剂量实验组小鼠耳廓肿胀量最高，无明显抗炎症效果，与***阳性对照组相比有明显差异(p＜0.05)。 

重组Cygb促皮肤创伤愈合功能研究： 

大鼠皮肤创伤愈合模型：采用全层皮肤切除模型，每只大鼠背部均匀地打5个孔，分别为空白组，汞溴红阳性对照组，低、中、高剂量Cygb组(20，40，80μg·d-1)，每日拍照记录观察伤口愈合情况。 

创面一般观察：对照组、红药水组与三个剂量Cygb组之间创面修复情况有较明显差别。首先，术后1d，三个剂量组及红药水组伤口开始出现少许红晕，表明肉芽组织已经开始生长，而对照组伤口比较湿润；用药后第3d，中、高剂量Cygb组伤口肉芽组织生长明显，局部已经长出薄层或点状上皮，创缘皮肤收缩明显，而低剂量Cygb组、红药水组及对照组伤口表面的血液、渗出液及坏死物质干燥后形成黑褐色硬痂，在痂下进行愈合，此种愈合方式所需时间通常要长于无痂皮者。通常痂皮需待表皮再生完成之后，方可脱落。痂下愈合也首先是创缘的表皮基底细胞增生，于痂下向创面中心移行，然后肉芽组织增生。痂下愈合的速度一般较无痂皮者为缓慢，愈合时间较长，这是因为表皮再生时必需将所遇到的痂皮加以溶解后，才能向前生长；用药后第10d，中、高剂量Cygb组伤口创面已基本为肉芽组织所填充，伤口较红润，而对照组、红药水组及低剂量Cygb组伤口仍见痂皮生成；用药后第15d，中、高剂量Cygb组伤口已基本愈合，而对照组、红药水组及低剂量Cygb组创面愈合效果欠佳。说明重组Cygb在促进伤口愈合方面具有一定的作用，推测重组Cygb通过发挥其抗炎症作用在伤口愈合过程中发挥主要作用。 

观察用药后第15天皮肤组织切片可发现，与正常皮肤(标号1)相比，空白对照组、红药水组及三个Cygb剂量组大鼠皮肤组织切片均存在疤痕组织，且疤痕组织的面积无 明显区别，提示重组Cygb作用于伤口后并不能明显减轻伤口愈合时疤痕的产生面积，推测重组Cygb在创伤愈合过程中可能主要通过抗炎症发挥作用。 

实验结果显示：通过小鼠颈背部皮下注射D-galactose致皮肤衰老实验模型，通过测定小鼠皮肤组织匀浆及血清中SOD、MDA、羟脯氨酸含量及GSH-Px活性等与抗氧化相关的各项指标，证明与D-galactose模型组相比，小鼠腹腔注射重组Cygb实验组，小鼠血清及皮肤组织匀浆中SOD活性显著提高、脂质过氧化产物MDA含量显著下降、同时与抗氧化显著相关的GSH-PX含量有不同程度提高。证明小鼠每日腹腔注射纯化的重组Cygb具有较明显的延缓皮肤衰老作用，为今后对Cygb在抗炎症、抗氧化等领域的基础研究和临床应用做了有力铺垫；同时重组Cygb在二甲苯致小鼠耳廓肿胀急性炎症模型实验中能显著降低肿胀率，起到明显的抗炎症效果；最后，在大鼠全层皮肤切除模型中重组Cygb发挥其抗炎功能而在皮肤创伤愈合过程中表现出较好的作用。 

通过上述2个实验结果表明： 

(1)重组大鼠Cygb具有较高的过氧化物酶活性，其过氧化物酶活性单位为(193.5±7.2)U/mg·min，在偏酸性条件下(pH＝6.0左右)具有最高的过氧化物酶活性。 

(2)皮肤细胞受氧化应激损伤前经Cygb预处理，能够显著减轻H₂O₂造成的皮肤细胞氧化应激损伤，细胞培养液及细胞裂解液中抗氧化相关因子SOD的活性显著增强，脂质过氧化产物含量降低，LDH的含量也明显降低，细胞膜的损伤程度明显降低。表明重组Cygb预处理能够明显减轻细胞氧化应激损伤。同时小鼠腹腔注射重组Cygb对于D-galactose背部皮下注射造成的小鼠局部皮肤衰老具有明显的保护作用，背部皮肤组织病理切片结果表明，重组Cygb各剂量组小鼠皮肤真皮厚度明显增加，胶原纤维含量增加，血清及皮肤组织匀浆中SOD、GSH-PX的活性明显增强。 

(3)大鼠皮肤全层切除动物模型实验结果表明，Cygb可在一定程度上促进伤口收缩，促进肉芽组织生长，同时伤口愈合速度有一定提高；二甲苯致小鼠耳廓肿胀急性炎症模型实验中，重组Cygb组小鼠耳廓的肿胀率相比阴性对照组明显降低，初步推测重组Cygb具有一定抗炎功能。 

综上所述，本发明所述的重组Cygb在减轻皮肤细胞氧化应激损伤、提高细胞抗氧化能力、延缓皮肤衰老等几个方面具有较好效果；另外，本发明所述的重组Cygb还具有抗炎症、促进上皮组织生长方面的功能。 

附图说明：

图1不同浓度H₂O₂对FB增殖活力的影响 

其中：a-对照；b-500；c-600；d-700；e-800；f-900；g-1000；h-1100；i-1200；j-1300(H₂O₂μm)

6h； 

12h； 24h 

图2不同浓度tBHP对胎鼠皮肤成纤维细胞增殖活力的影响 

其中：a-对照；b-0.1；c-0.5；d-1.0；e-1.5；f-2.0；g-2.5；h-3.0；i-3.5；j-4.0(mM) 

1.5h； 

3h； 

6h 

图3低浓度H₂O₂和tBHP对HaCAT细胞活力的影响 

其中：a-对照；b-0.1；c-0.2；d-0.3；e-0.4；f-0.5(H₂O₂ mM)；g-0.1；h-0.2；i-0.3；j-0.4(t-BHPmM) 

3h； 

6h； 9h 

图4高浓度H₂O₂和tBHP对HacaT活力的影响 

其中：a-对照；b-0.6；c-0.7；d-0.8；e-0.9；f-1.0(H₂O₂ mM)；g-0.5；h-1.0；i-1.5；(mM) 

3h； 

6h； 

9h 

图5Cygb对原代真皮成纤维细胞FB毒性检测 

其中：a-对照；b-4×10^-4；c-2×10^-3；d-1×10^-2；e-5×10^-2；f-25×10^-2；g-1.0；h-5.0；i-12.5；j-50(μg/mL) 

24h； 

48h； 

72h； 

96h 

图6Cygb对人永生化表皮细胞HaCAT毒性检测 

其中：a-对照；b-4×10^-4；c-2×10^-3；d-1×10^-2；e-5×10^-2；f-25×10^-2；g-1.0；h-5.0；i-12.5；j-50(μg/mL) 

24h； 

48h； 

72h 

图7结晶紫染色法测定Cygb对FB的毒性 

其中：a-对照；b-4×10^-4；c-2×10^-3；d-1×10^-2；e-5×10^-2；f-25×10^-2；g-1.0；h-5.0；i-12.5；j-50.0(μg/mL) 

24h； 

48h； 

72h； 

96h 

图8结晶紫染色法测定Cygb对HaCAT的毒性 

其中：a-对照；b-50；c-12.5；d-5.0；e-1.0；f-25×10^-2；g-5×10^-2；h-1×10^-2；i-2×10^-3；j-4×10^-4(μg/mL) 

24h； 

48h； 

96h 

图9Cygb抗H₂O₂(700μm，3h)氧化应激作用检测 

其中：a-对照；b-H₂O₂；c-H₂O₂+0.0024；d-H₂O₂+0.012；e-H₂O₂+0.048；f-H₂O₂+0.24；g-H₂O₂+0.6；h-H₂O₂+1.2；i-H₂O₂+2.4(Cygb μm)；j-H₂O₂+Ve(25μm)

图10SOD含量测定 

其中：a-对照；b-H₂O₂；c-H₂O₂+0.096；d-H₂O₂+0.48；e-H₂O₂+2.4(Cygb μm)；f-H₂O₂+Ve(25μm)

图11MDA含量测定 

其中：a-对照；b-H₂O₂；c-H₂O₂+0.096；d-H₂O₂+0.48；e-H₂O₂+2.4(Cygb μm)；f-H₂O₂+Ve(25μm)

图12LDH含量测定 

其中：a-对照；b-H₂O₂；c-H₂O₂+0.096；d-H₂O₂+0.48；e-H₂O₂+2.4(Cygb μm)；f-H₂O₂+Ve(25μm)

图13重组Cygb抗tBHP致原代真皮FB细胞损伤检测 

其中：a-对照；b-0.2mM t-BHP；c-t-BHP+2.0；d-t-BHP+10.0；e-t-BHP+50.0(μg/mL) 

3h； 

6h 

图14重组Cygb抗tBHP致HaCAT细胞损伤检测 

其中：a-对照；b-0.5mM t-BHP；c-t-BHP+95.0；d-t-BHP+50.0；e-t-BHP+25.0；f-e-t-BHP+12.5；g-t-BHP+6.0；h-t-BHP+3.0；i-t-BHP+1.5；j-t-BHP+0.75；(μg/mL) 

3h； 6h 

图15二甲苯致小鼠耳廓肿胀急性炎症模型 

其中：a-对照(0.2％CMCNa)；b-***；c-100μg/g；d-200μg/g；e-400μg/g； 

具体实施方式：

通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。 

《实施例1》、重组大鼠Cygb的制备 

(1)采用基因工程的方法构建高效表达重组大鼠Cygb的基因工程菌pET22b-Cygb/E.coli.BL21(DE3)； 

(2)基因工程菌经大量培养后，经离心得到菌体沉淀经反复冻融后，重悬得粗蛋白提取液，上清总蛋白分别经DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、Sephacryl S-100 凝胶过滤层析及Sephadex G25脱盐层析纯化得到高纯度重组Cygb蛋白。 

《实施例2》、重组大鼠Cygb 

重组大鼠Cygb原核表达载体的构建 

提取含Rat-Cygb基因的质粒，经PCR后鉴定得到600bp左右的条带，同时菌落PCR同样可以得到Cygb基因(泳道4)，对比DNAMarker可发现与Cygb分子量大小600bp左右相符，可以确定PCR结果正确。回收Cygb基因PCR产物与表达载体pET22b均经内切酶Nde I、EcoR I双酶切后，将两双酶切产物连接并电泳鉴定(泳道2)，将连接产物经过EcoR I/Nde I双酶切鉴定(泳道3)，证明表达载体pET22B-Cygb构建成功。接下来将重组的连接产物pET22b-Cygb转化DH5α感受态细胞并涂平板，挑取多个单克隆接种到含Amp(50～100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃，238rpm过夜培养，提取质粒pET22b-Cygb，转化E.coli BL21(DE3)，获得基因工程菌，筛选出Cygb高表达菌株。同时，对比DNA测序结果，也证实质粒中确实含有正确的目的基因Cygb，进一步确定大鼠重组细胞球蛋白表达载体构建正确。 

重组大鼠Cygb的诱导表达及纯化 

取pET22b-Cygb/E.coli BL21高表达基因工程菌接种到含25μg/ml Amp的LB液体培养基中，于37℃，238r·min^-1摇床过夜培养，转接至含Amp的乳糖诱导FML培养基中，与上述同样条件下继续诱导培养12～16h，菌液离心后获得总蛋白沉淀并在4℃和-20℃中反复冻融2～3次，然后用10mmol/L Tris-HCl缓冲液按照质量比1∶10溶解沉淀，11000rpm，4℃离心获得可溶性上清总蛋白。然后将总上清蛋白依次经过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、Sephacryl S-100凝胶过滤层析、Sephadex G25脱盐柱层析，最后获得纯度较高的重组Cygb。 

DEAE-Sephadex A-50离子交换层析 

总上清蛋白以流速5ml/min上样到平衡至OD280基线的DEAE-Sephadex A-50离子交换层析柱中，上样完毕后，首先用不含盐的10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗脱到OD280基线，然后依次用含NaCl浓度为30mM、60mM、120mM的10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗脱，并依次收集洗脱过程中出现的各峰蛋白(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，上样过程中无蛋白峰出现，含30mM NaCl和60mM NaCl缓冲液洗脱时分别出现一个蛋白峰(Ⅱ和Ⅲ)，但是取各峰蛋白样品做SDS-PAGE后结果发现，Ⅰ和Ⅱ峰蛋白分子量均与目的蛋白Cygb分子量(约20.9KD)不符，其中几乎不存在目的蛋白；从图1-4中可以看到， 含120mM的10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗脱时出现蛋白峰Ⅲ，通过电泳检测发现只有峰Ⅲ蛋白中含有大量分子量与Cygb分子量大小一致的蛋白，所以推测含120mM NaCl的缓冲液洗脱得到的蛋白峰Ⅲ为目的Cygb蛋白。 

含120mM NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱完毕，用含500mM NaCl的Tris-HCl高盐缓冲液洗脱去掉阴离子交换柱上的全部剩余杂蛋白，然后用10mmol/L Tris-HCl缓冲液将柱子平衡至基线，并将上步收集得到的蛋白峰Ⅲ稀释后上样，最后用含500mM NaCl的Tris-HCl高盐缓冲液浓缩洗脱，收集浓缩蛋白峰Ⅳ。 

Sephacryl S-100凝胶过滤层析： 

将收集到的浓缩蛋白峰Ⅳ上样到已平衡至OD280基线的Sephacryl S-100凝胶过滤层析柱中，用含150mM NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)慢速洗脱(1ml/min)，上样过程中没有蛋白峰出现，开始洗脱后在约180min位置出现一个小的蛋白峰，后面证明并非是目的Cygb蛋白，在240min左右，OD280值急剧升高，出现蛋白峰V，经过电泳检测，可发现蛋白峰V即为经过Sephacryl S-100凝胶过滤层析的目的Cygb蛋白。 

Sephadex G25脱盐层析： 

Sephadex G25脱盐柱首先用1×D-Hank’s缓冲液(pH 7.0)平衡至基线，收集到的蛋白峰Ⅴ样品上样后，用1×D-Hank’s缓冲液(pH 7.0)洗脱，流速3ml/min，收集蛋白峰Ⅵ，并做SDS-PAGE检测。 

将上述层析纯化过程中收集到的几个蛋白峰做SDS-PAGE检测，用空载体转化后的菌落同样用含乳糖的FML培养基诱导表达后离心获得沉淀反复冻融，用缓冲液溶解作为空白载体对照。泳道5为诱导表达后总蛋白沉淀重悬后的样品，比较泳道5和6同时对照蛋白分子量标准可以明显发现，泳道5中分子量位于20KD和30KD之间存在一条浓度较高的蛋白条带，而泳道6中分子量在20KD和30KD之间没有条带，说明基因工程菌pET22b-Cygb/E.coli BL21诱导表达Cygb成功；比较泳道3和泳道4可以发现，总蛋白悬液经离心后，目的Cygb蛋白绝大部分存在于上清中，而同时沉淀中也有很少一部分Cygb未溶出；泳道2为总蛋白上清经DEAE阴离子交换层析后的蛋白峰，与泳道3中总蛋白上清相比，大部分杂蛋白已经被洗脱去除，只剩余少量杂蛋白；泳道1中蛋白即为DEAE阴离子交换层析后的样品进一步经Sephacryl S-100凝胶过滤层析后的蛋白峰，比较泳道1和泳道2可以发现，泳道1中几乎没有杂蛋白存在，纯度得到进一步提高，经凝胶成像***扫描分析可以得知，纯化得到的目的重组Cygb纯度达到95％以 上。 

纯化Cygb的western blot鉴定 

经纯化后脱盐的样品蛋白峰首先经过15％SDS-PAGE电泳后，转PVDF膜做Western blot检测。发现染色后有两条明显的蛋白条带，与预染Marker相比较，上面一条相对细的条带分子量小于49KD，和CYGB二聚体的分子量基本一致；而下面一条染色深的带分子量小于26KD，大小约为21KD，和CYGB单体的分子量吻合。说明粗蛋白经过多步层析最后获得了很高纯度的目的重组Cygb。 

纯化的Cygb蛋白浓度测定(BCA法) 

纯化Cygb蛋白经western blot鉴定正确后，利用BCA法测定其蛋白浓度，横坐标表示OD578，纵坐标表示蛋白浓度(μg/ml)，做出标准曲线。根据标准曲线方程，计算可以得出纯化的重组大鼠Cygb的浓度为950μg/ml。 

过氧化物酶活性测定 

根据愈创木酚法测定纯化Cygb的过氧化物酶活性单位，于470nm波长利用分光光度计每30s测一次连续5min测得吸光度A470变化。波长470nm处反应体系每min吸光度A值变化0.01定义为一个过氧化物酶活性单位(U/mg·min)，调节浓度比例设立三个测定组，每组测三次，取平均值。得出纯化Cygb的过氧化物酶活性单位为(193.5±7.2)U/mg·min。 

Claims (7)

1.一种重组大鼠细胞球蛋白，经过以下步骤制成：构建基因工程菌pET22b-Cygb/E.coli.BL21菌株，经培养，分离，纯化，得到重组大鼠细胞球蛋白。

2.根据权利要求1所述的重组大鼠细胞球蛋白，其特征在于，经过以下步骤制成：

(1)采用基因工程的方法构建基因工程菌pET22b-Cygb/E.coli.BL21；

(2)培养后，经离心得到菌体沉淀，经反复冻融后，重悬得粗蛋白提取液，上清总蛋白分别经DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、Sephacryl S-100凝胶过滤层析及Sephadex G25脱盐层析纯化，得到高纯度重组Cygb蛋白。

3.权利要求1或2所述重组大鼠细胞球蛋白在制备延缓皮肤衰老药物中的应用。

4.权利要求1或2所述重组大鼠细胞球蛋白在制备减轻细胞氧化损伤药物中的应用。

5.权利要求1或2所述的重组大鼠细胞球蛋白在制备提高细胞抗氧化能力药物中的应用。

6.权利要求1或2所述的重组大鼠细胞球蛋白在制备抗炎症药物中的应用。

7.权利要求1或2所述的重组大鼠细胞球蛋白在制备促进皮肤创伤愈合药物中的应用。

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