CN117323350B - 长茎葡萄蕨藻多酚在制备治疗血栓药物中的应用 - Google Patents
长茎葡萄蕨藻多酚在制备治疗血栓药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117323350B CN117323350B CN202311443467.9A CN202311443467A CN117323350B CN 117323350 B CN117323350 B CN 117323350B CN 202311443467 A CN202311443467 A CN 202311443467A CN 117323350 B CN117323350 B CN 117323350B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polyphenol
- botrytis cinerea
- ethanol
- macroporous resin
- water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 89
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 title claims abstract description 89
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 10
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 claims abstract description 55
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 59
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 38
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 38
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 15
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 14
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 13
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 11
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 2
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 2
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N gallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 10
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 229940074391 gallic acid Drugs 0.000 description 7
- 235000004515 gallic acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 10h-anthracen-9-one;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 3
- 241000737252 Botrychium Species 0.000 description 2
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010037437 Pulmonary thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- 241001290342 Caulerpa Species 0.000 description 1
- 241001339217 Caulerpa lentillifera Species 0.000 description 1
- 241001493811 Caulerpaceae Species 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 1
- 229940127217 antithrombotic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 230000003073 embolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003072 epinephrine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/02—Algae
- A61K36/05—Chlorophycota or chlorophyta (green algae), e.g. Chlorella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
- A61K2236/15—Preparation or pretreatment of starting material involving mechanical treatment, e.g. chopping up, cutting or grinding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/30—Extraction of the material
- A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
- A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
- A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
- A61K2236/53—Liquid-solid separation, e.g. centrifugation, sedimentation or crystallization
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
- A61K2236/55—Liquid-liquid separation; Phase separation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Botany (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及海洋生物技术领域，特别涉及长茎葡萄蕨藻多酚在制备治疗血栓药物中的应用，本发明发现长茎葡萄蕨藻多酚可以显著提高肺血栓模型小鼠的存活率，同时显著降低尾血栓模型小鼠的黑尾率值。因此提供了其在制备治疗血栓药物中的应用，并进一步给出了长茎葡萄蕨藻多酚的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，特别涉及长茎葡萄蕨藻多酚的应用。
背景技术
长茎葡萄蕨藻(Caulerpa lentillifera)隶属绿藻门(Chlorophyta)羽藻目(Bryopsidales)蕨藻科(Caulerpaceae)蕨藻属(Caulerpa)，是一种即可食用又可药用的植物。
血栓性疾病是一组能够累及全身组织器官，严重危害人类生命健康的疾病，由于血栓形成后血流受阻，或栓子脱落导致下游血流中断，将会造成组织器官的缺血和坏死。据统计资料表明，每年全世界大约有1700万人因各种心脑血管疾病而死亡，血栓形成是引发各类严重心脑血管疾病的重要因素，因此血栓性疾病已经成为当今公众生命健康的主要威胁之一。目前临床上治疗血栓的抗血小板药物和抗凝药物仍存在出血事件、药效不够、选择性差等弊端，开发新型抗血栓药物一直以来备受关注。海洋植物因为独特的生存环境而具有一些陆生植物不具备的特性，且海洋植物分布广泛、数量庞大，从海洋植物中获取具有治疗血栓活性的有效成分是一种新颖且具发展前景的思路。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种新的海洋植物提取物，该提取物可以用于对血栓的治疗和预防。
为了实现本发明目的，具体采用如下技术手段：
长茎葡萄蕨藻多酚在制备治疗血栓药物中的用途，其特征在于，所述长茎葡萄蕨藻多酚的制备方法为：
(1)新鲜的长茎葡萄蕨藻冷冻干燥48小时，将其剪碎，然后将其放入粉碎机中并通过60目筛得到长茎葡萄蕨藻粉末；
(2)准确称取长茎葡萄蕨藻粉末，按照料液比1∶15加入体积浓度为80％的乙醇水溶液，充分混匀浸泡；
(3)用数控超声波清洗器进行多酚的提取，提取时间为40min，提取温度50℃，抽滤，得长茎葡萄蕨藻多酚粗提取液；
(4)用大孔树脂BS-45对长茎葡萄蕨藻多酚粗提取液进行初步纯化，以1BV/h流速进行上样，静置吸附1h，用0.78BV的去离子水洗除杂质，用2.5BV的80％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，40～50℃真空旋蒸浓缩，冻干得长茎葡萄蕨藻多酚粉末；
(5)取经大孔树脂纯化后的长茎葡萄蕨藻多酚，精密称定，用少量水超声溶解，离心，上清液上样于葡聚糖凝胶LH-20层析柱，分别以水、80％乙醇、无水乙醇洗脱，得到的80％乙醇洗脱液经旋蒸、冻干，即为制备的长茎葡萄蕨藻多酚。
有益效果
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种高纯度长茎葡萄蕨藻多酚的制备方法。
(2)采用该方法制备的长茎葡萄蕨藻多酚在小鼠动物模型上展现出显著抗血栓活性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1多酚提取率和纯度测定方法
多酚含量参照报道的福林酚(Folin-Ciocalteu)法测定，以没食子酸为标准品。具体步骤如下：精密移取0.1mg/mL没食子酸标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别加入10mL容量瓶中，分别加入2.5mL的10％福林酚试剂，避光反应5min。然后分别加入7.5％Na2CO3溶液2mL，混匀后分别用蒸馏水定容至10mL，避光反应2h。使用紫外分光光度计，以蒸馏水调零，765nm波长处测定各试管的吸光度。以没食子酸标准溶液的浓度为横坐标，各管测得的吸光度为纵坐标，绘制没食子酸(GA)标准曲线。
长茎葡萄蕨藻多酚提取率的测定：提取液稀释后，取1mL加入到10mL容量瓶中，加入2.5mL的10％福林酚试剂，避光反应5min。然后加入7.5％Na2CO3溶液2mL，混匀后用蒸馏水定容至10mL，避光反应2h。使用分光光度计，以蒸馏水调零，765nm波长处测定吸光度。利用没食子酸标准曲线方程求得多酚浓度，提取率按照下面公式计算。
提取率(mg GAE/g)＝c×nV/M
式中：GAE表示没食子酸当量；c表示多酚浓度(mg/mL)；n表示稀释倍数；V表示提取液体积(mL)；M表示海藻干粉质量(g)。
提取物经真空冷冻干燥，得到多酚固体提取物。将干燥后的产品称重并溶于蒸馏水，制成样品溶液。利用福利酚法求得多酚浓度，多酚纯度(％)＝多酚浓度×样品溶液体积/多酚固体提取物质量×100。
实施例2长茎葡萄蕨藻多酚的提取工艺
本部分采用单因素法筛选多酚的提取工艺。
(1)超声温度的考察
称取2g长茎葡萄蕨藻粉末，按照料液比1∶20(g/mL)，加入60％乙醇，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下超声提取40min，抽滤，取上清液在40℃～50℃下蒸发浓缩。测定浓缩液中长茎葡萄蕨藻多酚浓度并计算提取率，考察温度对多酚提取率的影响。
| 提取温度(℃) | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 |
| 提取率(mg GAE/g) | 0.3318 | 0.4342 | 0.5486 | 0.4858 | 0.4552 |
根据上述结果，提取温度定为50℃。
(2)乙醇浓度的考察
称取2g的长茎葡萄蕨藻粉末，按料液比1∶20(g/mL)加入不同浓度(60％、70％、80％、90％、95％)的乙醇，50℃超声提取40min，抽滤，取上清液在40℃～50℃下蒸发浓缩。测定浓缩液中长茎葡萄蕨藻多酚浓度并计算提取率，考察乙醇浓度对多酚提取率的影响。
| 乙醇浓度(％) | 60 | 70 | 80 | 90 | 95 |
| 提取率(mg GAE/g) | 0.4858 | 0.5195 | 0.8460 | 0.6689 | 0.6667 |
根据上述结果，确定乙醇浓度为80％。
(3)料液比的考察
称取2g的长茎葡萄蕨藻粉末，分别按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)，加入80％乙醇，在50℃下超声提取40min，抽滤，取上清液在40℃～50℃下蒸发浓缩。测定浓缩液中长茎葡萄蕨藻多酚浓度并计算提取率，考察料液比对多酚提取率的影响。
| 料液比(g/mL) | 1∶10 | 1∶15 | 1∶20 | 1∶25 | 1∶30 |
| 提取率(mg GAE/g) | 0.6876 | 1.122 | 0.8460 | 0.7750 | 0.6271 |
根据上述结果，确定料液比为1∶15。
(4)提取时间的考察
称取2g的长茎葡萄蕨藻粉末，按料液比1∶15(g/mL)加入80％乙醇，在50℃下，分别超声提取20、30、40、50、60min，抽滤，取上清液在40℃～50℃下蒸发浓缩。测定浓缩液中长茎葡萄蕨藻多酚浓度并计算提取率，考察提取时间对多酚提取率的影响。
| 提取时间(min) | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 提取率(mg GAE/g) | 0.5695 | 1.071 | 1.122 | 1.079 | 1.058 |
根据上述结果，确定提取时间为40min。
综上，根据单因素实验结果，长茎葡萄蕨藻多酚的最佳提取工艺为：提取温度为50℃、乙醇浓度为80％、料液比为1∶15、提取时间为40min。
实施例3长茎葡萄蕨藻多酚的大孔树脂纯化工艺
超声提取液用大孔树脂进行纯化。
(1)大孔树脂预处理
大孔树脂在两倍量95％乙醇中浸泡24h，使其充分溶胀，用95％乙醇装柱，然后用95％乙醇洗至流出液加水无白色浑浊现象出现，蒸馏水洗至无乙醇味。
(2)大孔树脂静态实验筛选
分别精密吸取25ml体积的0.066g生药/mL长茎葡萄蕨藻多酚提取液加入到具有2g预处理好干树脂具塞锥形瓶中，每隔半小时振摇一次，使树脂充分吸附成分。振摇8次后，静置3h。用4层纱布过滤到100mL的锥形瓶中，得滤液。测定滤液的多酚浓度。
分别在过滤后的树脂中加80％乙醇25mL，每隔半小时振摇一次，振摇8次后，静置3h。用4层纱布过滤到100mL的锥形瓶中，得解吸液。测定解吸液的多酚浓度。
大孔树脂的吸附量(mg)、吸附率(％)、解吸量(mg)、解吸率(％)按照如下公式计算：
吸附量(mg)＝(C0-C1)V1
吸附率(％)＝[(C0-C1)/C0]×100％
解吸量(mg)＝C2V2
解吸率(％)＝[C2V2/(C0-C1)V1]×100％
式中：C0：初始总多酚浓度；C1：吸附结束时滤液总多酚浓度；C2：解吸液总多酚浓度；V1：提取液体积；V2：解吸液体积
实验结果如下表：
| 树脂型号 | 吸附率(％) | 解吸率(％) |
| AB-8 | 56.91 | 28.67 |
| XDA-7 | 56.71 | 28.90 |
| BS-45 | 63.86 | 38.58 |
| NKA-9 | 55.49 | 26.23 |
| ADS-17 | 52.69 | 31.23 |
| ADS-21 | 53.10 | 23.54 |
| HPD100 | 55.54 | 28.35 |
| LS-305A | 57.68 | 34.01 |
| DA201 | 53.39 | 29.81 |
| XAD16N | 49.84 | 33.97 |
由表结果可以发现，BS-45大孔树脂的吸附率和解析率均最高，选用BS-45大孔树脂进行后续考察。
(3)大孔树脂动态吸附径高比考察
分别称取BS-45大孔树脂17.376g、34.752g、52.128g、69.504g(相当于大孔树脂干重5g、10g、15g、20g)四份，按“大孔树脂预处理”进行预处理。装于四根相同内径的玻璃柱中，使径高比分别约为1∶1.4、1∶2.8、1∶4.2和1∶5.6。分别用25mL、50mL、75mL、100mL的0.066g生药/mL的长茎葡萄蕨藻多酚提取液以1BV/h流速上样(BV，柱体积)。上样结束后静置吸附1h。用2BV蒸馏水对树脂柱进行洗脱，洗脱速度为2BV/h，再分别用2BV体积80％乙醇进行洗脱，洗脱流速均为2BV/h。测定洗脱液中长茎葡萄蕨藻多酚含量并计算其转移率。
实验结果见下表
| 径高比 | 转移率(％) |
| 1∶1.4 | 23.59 |
| 1∶2.8 | 28.09 |
| 1∶4.2 | 35.63 |
| 1∶5.6 | 30.13 |
由表结果可见，以长茎葡萄蕨藻多酚的转移率为指标，径高比为1∶4.2时多酚转移率最高，因此选用径高比为1∶4.2进行下一因素考察。
(4)大孔树脂动态吸附上样量考察
称取BS-45大孔树腊52.128g，按“大孔树脂预处理”进行预处理。量取100mL浓度为0.066g生药/mL长茎葡萄蕨藻多酚提取液，然后对预处理后的大孔树脂进行上样，上样流速为1BV/h，每5mL收集一份上样流出液。测定流出液长茎葡萄蕨藻多酚含量，计算多酚泄露率。流出液中多酚的质量约为上样液多酚质量的10％时被认为达到泄漏点，此时上样量为最佳上样量。
泄漏率(％)＝流出液多酚质量/上样液中多酚质量×100％；
累积泄漏率＝∑泄漏率
实验结果见下表：
| 泄露液管号 | 泄露率(％) | 累积泄露率(％) |
| 1～8 | 0 | 0 |
| 9 | 0.598 | 0.598 |
| 10 | 0.952 | 1.550 |
| 11 | 2.083 | 3.633 |
| 12 | 2.674 | 6.307 |
| 13 | 3.261 | 9.568 |
| 14 | 3.833 | 13.401 |
当上样液体积达到65mL时多酚累积泄露率达9.568％，流出液中多酚的质量约为上样液多酚质量的1/10时被认为达到泄漏点，确定最佳上样量为65mL(0.72BV)。
(5)大孔树脂动态吸附水洗体积考察
采用蒸馏水洗脱除去样品液中的糖类等水溶性杂质，通过对水洗脱液中蒽酮硫酸反应的检测，确定还原糖被完全洗脱时需要水的体积。
称取BS-45大孔树脂52.128g，按“大孔树脂预处理”进行预处理。量取浓度为0.066g生药/mL长茎葡萄蕨藻多酚提取液65mL，对预处理后的大孔树脂进行上样，上样流速为1BV/h，上样结束后静置吸附1h。再用150mL蒸馏水对树脂柱进行洗脱，洗脱速度为2BV/h，以每10mL为一流份，收集水洗脱液，同时分别采用蒽酮硫酸试剂检测每份水洗脱液，直到反应为阴性(还原糖被全部洗脱)时，停止用水洗脱除杂。实验结果如下表所示：
| 样品名 | 蒽酮硫酸反应结果 |
| 水洗脱液1 | 阳性 |
| …… | …… |
| …… | …… |
| 水洗脱液6 | 阳性 |
| 水洗脱液7 | 阴性 |
当水洗脱用量至70mL，水洗脱液的蒽酮硫酸反应呈现阴性结果，证明还原糖的杂质已经洗脱干净，故本实验将水洗脱用量定为70ml(0.78BV)。
(6)大孔树脂动态吸附80％乙醇洗脱体积考察
称取BS-45大孔树脂52.128g，按“大孔树脂预处理”进行预处理。量取浓度0.066g生药/mL长茎葡萄蕨藻多酚提取液65mL(0.72BV)，然后对预处理后的大孔树脂进行上样，上样流速为1BV/h，上样结束后静置吸附1h，用70ml(0.78BV)蒸馏水冲洗树脂柱，流速为2BV/h，然后用4BV 80％乙醇洗脱，以每0.5BV为1流份收集洗脱液，共收集8份。测定各洗脱液中多酚含量，计算多酚转移率。
转移率(％)＝洗脱液中多酚的质量/上样液中多酚的质量×100％
实验结果见下表：
| 洗脱体积(BV) | 累积转移率(％) |
| 0.5 | 17.07 |
| 1 | 29.77 |
| 1.5 | 37.17 |
| 2 | 41.29 |
| 2.5 | 44.30 |
| 3 | 44.69 |
| 3.5 | 43.88 |
| 4 | 44.57 |
有结果可知，使用2.5BV体积的80％乙醇洗脱体积时多酚洗脱能力达到最高，后续基本平衡，即确定最佳洗脱体积为2.5BV。
大孔树脂纯化工艺总结：BS-45树脂，径高比为1∶4.2，洗脱溶剂为80％乙醇、上样流速1BV/h，上样浓度0.066g生药/mL，上样体积0.72BV，静置吸附1h，水洗体积0.78BV，洗脱流速为2BV/h，洗脱溶剂体积为2.5BV(BV表示柱体积)。
(7)样品制备
采用上述工艺，放大20倍，多次重复制备多酚样品液，旋蒸浓缩，冻干，冻干粉用于后续进一步纯化。
实施例4葡聚糖凝胶LH-20进一步纯化
取大孔树脂纯化后的长茎葡萄蕨藻多酚冻干粉100mg于5mL水中溶解，以12000×g低温(4℃)离心5分钟，将上清液逐滴上Sephadex LH-20凝胶柱。
当样品渗入胶床后，分别用100mL蒸馏水、80％乙醇、无水乙醇依次洗脱，流速0.7mL/min，每10mL收集1管，采用福林酚法测定多酚浓度，以管数为横坐标，多酚浓度为纵坐标，绘制曲线，观察多酚洗脱情况。将1～10管、11～20管、21～30管分别合并，旋蒸浓缩，冻干，测定冻干粉重量和多酚纯度。纯度(％)＝多酚质量/冻干粉质量×100％
实验结果显示，80％乙醇相中长茎葡萄蕨藻多酚纯度最高，为65.98％，故选取80％乙醇相组分进行下面的研究。
实施例5抗血栓活性研究
(1)肺血栓模型
小鼠肺血栓造模剂：0.5mg/mL的I型胶原和0.05mg/mL盐酸肾上腺素混合溶液。
取雄性ICR小鼠50只，随机分为5组，每组10只。分为空白组、模型组、阿司匹林阳性对照组(给药剂量20mg/kg)、多酚低剂量组(给药剂量20mg/kg)、多酚高剂量组(给药剂量40mg/kg)。小鼠灌胃给药的体积为20mL/kg，每天给药1次，连续5天，空白组和模型组灌胃等体积生理盐水。末次给药2h后，除空白组外，小鼠尾静脉注射造模剂的体积为10mL/kg。观察小鼠造模后15min内死亡情况，计算小鼠造模后15min的存活率。
造模后15min内小鼠存活率见下表：
| 组别 | 死亡数(只) | 存活数(只) | 存活率(％) |
| 空白组 | 0 | 10 | 100％ |
| 模型组 | 10 | 0 | 0 |
| 阿司匹林阳性对照组 | 5 | 5 | 50 |
| 多酚低剂量组 | 6 | 4 | 40 |
| 多酚高剂量组 | 5 | 5 | 50 |
(2)小鼠尾血栓模型
取雄性ICR小鼠50只，随机分为5组，每组10只。分为空白组、模型组、阿司匹林阳性对照组(给药剂量20mg/kg)、多酚低剂量组(给药剂量20mg/kg)、多酚高剂量组(给药剂量40mg/kg)。小鼠灌胃给药的体积为20mL/kg，每天给药1次，连续7天，空白组和模型组灌胃等体积生理盐水。于最后一天给药1小时后，除空白组外，其他各组小鼠背部皮下注射0.1％角叉菜胶造模剂。造模24小时后测量小鼠尾部长度及尾部血栓形成长度，血栓形成长度占尾部总长度比例即为血栓形成相对平均长度，即黑尾率(％)。
| 组别 | 黑尾率(％) |
| 空白组 | 0 |
| 模型组 | 84.8±3.1 |
| 阿司匹林阳性对照组 | 44.9±2.6*** |
| 多酚低剂量组 | 67.4±3.1*** |
| 多酚高剂量组 | 55.3±2.9*** |
注：与模型组比，***P＜0.001
由上述结果可知，本发明制备的长茎葡萄蕨藻多酚具有显著地抗血栓效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.长茎葡萄蕨藻多酚在制备治疗血栓药物中的用途，其特征在于，所述长茎葡萄蕨藻多酚的制备方法为：
(1)新鲜的长茎葡萄蕨藻冷冻干燥48小时，将其剪碎，然后将其放入粉碎机中并通过60目筛得到长茎葡萄蕨藻粉末；
(2)准确称取长茎葡萄蕨藻粉末，按照料液比1∶15加入体积浓度为80％的乙醇水溶液，充分混匀浸泡；
(3)用数控超声波清洗器进行多酚的提取，提取时间为40min，提取温度50℃，抽滤，得长茎葡萄蕨藻多酚粗提取液；
(4)用大孔树脂BS-45对长茎葡萄蕨藻多酚粗提取液进行初步纯化，以1BV/h流速进行上样，静置吸附1h，用0.78BV的去离子水洗除杂质，用2.5BV的80％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，40～50℃真空旋蒸浓缩，冻干得长茎葡萄蕨藻多酚粉末；
(5)取经大孔树脂纯化后的长茎葡萄蕨藻多酚，精密称定，用少量水超声溶解，离心，上清液上样于葡聚糖凝胶LH-20层析柱，分别以水、80％乙醇、无水乙醇洗脱，得到的80％乙醇洗脱液经旋蒸、冻干，即为制备的长茎葡萄蕨藻多酚。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311443467.9A CN117323350B (zh) | 2023-10-27 | 2023-10-27 | 长茎葡萄蕨藻多酚在制备治疗血栓药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311443467.9A CN117323350B (zh) | 2023-10-27 | 2023-10-27 | 长茎葡萄蕨藻多酚在制备治疗血栓药物中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117323350A CN117323350A (zh) | 2024-01-02 |
| CN117323350B true CN117323350B (zh) | 2024-03-05 |
Family
ID=89275637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311443467.9A Active CN117323350B (zh) | 2023-10-27 | 2023-10-27 | 长茎葡萄蕨藻多酚在制备治疗血栓药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117323350B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150091771A (ko) * | 2014-02-04 | 2015-08-12 | 목포대학교산학협력단 | 바다포도 추출물을 포함하는 당뇨병 치료 또는 예방용 조성물 |
| CN109833334A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-06-04 | 香港科技大学 | 长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法和应用 |
| CN113491718A (zh) * | 2020-04-01 | 2021-10-12 | 台湾海洋大学 | 一种海葡萄萃取物用于制备缓解糖尿病及预防或治疗生殖障碍医药组合物或保健食品的用途 |
| TW202308672A (zh) * | 2021-08-23 | 2023-03-01 | 台灣粒線體應用技術股份有限公司 | 萃取物用於製備提高粒線體活性的醫藥或非醫藥組合物的用途 |
| CN115844920A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-03-28 | 江苏海洋大学 | 长茎葡萄蕨藻多糖在制备治疗骨质疏松症药物中的应用 |
| CN116617120A (zh) * | 2023-07-13 | 2023-08-22 | 广州海龟爸爸生物科技有限公司 | 一种海葡萄提取物的制备方法及其产品和应用 |
-
2023
- 2023-10-27 CN CN202311443467.9A patent/CN117323350B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150091771A (ko) * | 2014-02-04 | 2015-08-12 | 목포대학교산학협력단 | 바다포도 추출물을 포함하는 당뇨병 치료 또는 예방용 조성물 |
| CN109833334A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-06-04 | 香港科技大学 | 长茎葡萄蕨藻提取物的制备方法和应用 |
| CN113491718A (zh) * | 2020-04-01 | 2021-10-12 | 台湾海洋大学 | 一种海葡萄萃取物用于制备缓解糖尿病及预防或治疗生殖障碍医药组合物或保健食品的用途 |
| TW202308672A (zh) * | 2021-08-23 | 2023-03-01 | 台灣粒線體應用技術股份有限公司 | 萃取物用於製備提高粒線體活性的醫藥或非醫藥組合物的用途 |
| CN115844920A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-03-28 | 江苏海洋大学 | 长茎葡萄蕨藻多糖在制备治疗骨质疏松症药物中的应用 |
| CN116617120A (zh) * | 2023-07-13 | 2023-08-22 | 广州海龟爸爸生物科技有限公司 | 一种海葡萄提取物的制备方法及其产品和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王小兵 ; 罗蕊琪 ; 黄勃 ; .海葡萄蕨藻多糖ASE提取工艺研究.广东农业科学.2013,(16),110-112. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117323350A (zh) | 2024-01-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111995694B (zh) | 一种滇黄精多糖的脱色纯化方法 | |
| CN104130226B (zh) | 一种高含量丹参丹酚酸b的制备方法 | |
| CN101229335B (zh) | 酶法制备黑刺菝葜总皂苷提取物的方法 | |
| CN109160954B (zh) | 一种香瓜茄酸性多糖及其提纯方法和用途 | |
| JP2010528063A (ja) | シャジクソウ属植物、大豆属植物、イチョウ属植物からセコイトール含有抽出物を取得する方法及び用途 | |
| CN117323350B (zh) | 长茎葡萄蕨藻多酚在制备治疗血栓药物中的应用 | |
| WO2020220863A1 (zh) | ***油的制备方法及其制备的***油 | |
| CN107929544A (zh) | 白及属植物中militarine部位及单体的制备方法及其应用 | |
| CN108159108B (zh) | 猴耳环总酚酸的制备及其在抗菌抗炎药物中的应用 | |
| CN107213180B (zh) | 一种三七黄酮的分离提取方法 | |
| CN107095893B (zh) | 一种太白三七活性物质的提取方法及其应用 | |
| CN101190906B (zh) | 红花黄色素b的制备方法及其应用 | |
| CN106880655B (zh) | 一种生产无农残食药提取物的方法 | |
| CN115844920A (zh) | 长茎葡萄蕨藻多糖在制备治疗骨质疏松症药物中的应用 | |
| CN112851621B (zh) | 牛白藤总环烯醚萜提取物、提取纯化方法及其应用 | |
| CN105732653B (zh) | 一种从毛叶香茶菜中制备冬凌草甲素的方法 | |
| CN1943647B (zh) | 一种枇杷叶三萜酸提取物的制备方法 | |
| CN112043733A (zh) | 一种水溶性银杏叶提取物的生产方法 | |
| CN113278089A (zh) | 一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法 | |
| CN113754705A (zh) | 从黑果枸杞中分离制备两种矮牵牛素类化合物的方法 | |
| CN102382152A (zh) | 一种制备红景天苷的方法 | |
| CN104606297A (zh) | 一种管花肉苁蓉中活性成分的提取方法 | |
| CN114790251B (zh) | 一种具有免疫活性的滇重楼多糖及其组合物和应用 | |
| CN105380996B (zh) | 一种具有活血止血作用的中药组合物及其制剂 | |
| CN115192624B (zh) | 一种凉山杜鹃的提取工艺及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |