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一种提高石斛多糖抗氧化能力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高石斛多糖抗氧化能力的微生物发酵法，属于植物活性成分功能提升领域。本发明通过接种有益微生物，利用微生物发酵将分子量大的多糖降解为利于生物体吸收的小分子多糖，并通过测定发酵液与原液的总抗氧化能力证实本方法有效提高了石斛多糖的抗氧化性。本发明的方法工艺简单，操作方便，反应条件温和，对环境友好，易于实施和推广；并且通过本方法获得的石斛多糖分子量小，利于生物体吸收，抗氧化能力强，在功能性药品和食品的研发等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种提高石斛多糖抗氧化能力的方法
技术领域
本发明涉及植物活性成分功能提升领域，尤其涉及一种提高石斛多糖抗氧化能力的方法。
背景技术
石斛(Dendrobium)是我国古文献中最早记载的兰科植物之一，具有益胃生津、滋阴清热的功效，其主要活性成分为多糖。近十年来，相关的研究工作主要集中在铁皮石斛的提取方法、化学成分、药理作用和指纹图谱等方面的研究(幺晨，铁皮石斛多糖的研究进展，中国民族民间医药，2015，24(15)：6-7)。
多糖是指由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚合物，广泛存在于动物，植物和微生物组织中，它是维持生命及正常运转的基本物质之一(成高敏等，中药植物多糖抗皮肤老化)。研究发现多糖及糖复合物参与和介导了细胞各种生命现象的调节(刘姚等，植物多糖生物活性研究进展，江苏农业科学，2013，41(1)：1-4)。
人体内有多种自由基，具有极强的氧化能力，能使各种生物膜的不饱和脂肪酸发生过氧化，形成过氧化脂质，造成核酸交联错误，蛋白质分解，DNA突变等重后果，与机体的衰老及多种疾病有关。科学研究也发现，氧化应激水平增高，与许多疾病相关。目前人们普遍认为植物多糖具有清除自由基、抗衰老作用。其作用机理,可能的解释有如下几种:(1)直接作用于ROS本身。(2)多糖分子作用于抗氧化酶。(3)多糖分子络合产生ROS所必需的金属离子。(4)促进SOD从细胞表面释放。随着人们对多糖研究的深入，已经发现多糖具有许多生物活性作用。在抗肿瘤、提高免疫、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、抗衰老和骨折愈合等方面都呈现出喜人的效果。这可能与多糖在各种实验体系中表现出较强的抗氧化活性有关(刘姚等，植物多糖生物活性研究进展，江苏农业科学，2013，41(1)：1-4)。
通常直接提取的多糖浸提液中，多糖分子量大，水溶性效果较差，不利于生物体吸收入体内，发挥其生物活性，这在一定程度上限制了多糖的应用，一定程度的降解，能保持甚至提高多糖的生物学活性，因而具有重要意义。在多糖降解方法中，微生物降解法不需要大量反应试剂，反应条件温和，且对环境友好。降解产物安全，可作为原料用于化妆品、食品及药品的生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高多糖抗氧化能力的方法，通过微生物发酵的方式，提高了多糖抗氧化能力，在不影响多糖主要成分的同时降低多糖分子量，利于生物体吸收和生物活性的提高，不需大量的反应试剂，反应条件温和，对环境友好。
本发明目的通过以下技术方案来予以实现：
一种提高石斛多糖抗氧化能力的方法，包括以下步骤：
(1)热水浸提法提取石斛多糖；
(2)活化微生物菌种；
(3)制备种子液；
(4)接种发酵。
优选地，所述微生物为枯草芽孢杆菌。由华南农业大学植物种质保护与利用研究中心保存，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为1.821的枯草芽孢杆菌。
优选地，步骤(1)具体过程如下：取新鲜石斛，切片，烘干至恒重，磨碎过筛，按1：80(g:mL)料液比加入石斛干粉和蒸馏水，80～90℃水浴加热1～2h后过滤，滤渣重复提取一次，合并两次提取液，加入无水乙醇至醇的终浓度为80％，过夜，过滤得粗多糖沉淀，将粗多糖沉淀用蒸馏水复溶，把复溶后溶液浓度调为10mg/mL，取50mL复溶后溶液至反应容器中，灭菌备用。
优选地，步骤(2)具体过程如下：用接种针挑取保存的菌落，在平板上划线，恒温培养箱37℃培养24h，挑取单菌种做斜面保存或继续划平板扩增。
优选地，步骤(3)具体过程如下：从培养24h的平板上刮取3环菌种于100mL的营养肉汤培养基，恒温摇床37℃，180r/min培养24h得种子液。
优选地，步骤(4)具体过程如下：加入1mL种子液于待发酵多糖溶液中，恒温摇床培养箱37℃，180r/min，16h后，121℃灭菌20min。
优选地，所述石斛为铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、玫瑰石斛、大苞鞘石斛、肿节石斛。
本发明具有以下有益效果：
本发明解决了应用成本条件一定情况下，减少石斛的用量而拥有原本同样的抗氧化性，这将大大减少多糖用量，为石斛多糖的开发利用提供基础数据，增加石斛多糖加工企业的经济效益。同时，经微生物发酵后，大分子多糖将降解为利于生物体吸收的小分子，将改善石斛多糖的药用价值，且对于功能性药品和食品的研发具有重要的意义。此方法操作简单，成本低廉，不需大量的反应试剂，反应条件温和，操作简单。
附图说明
图1为实施例1经生物发酵的多糖与多糖原液抗氧化能力的比较。
图2为实施例2经生物发酵的多糖与多糖原液抗氧化能力的比较。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
琼脂平板培养基：琼脂粉(干粉)20g/L、牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L,pH值为7.4±0.2；液体培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L,pH值为7.4±0.2。所用的微生物为枯草芽孢杆菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为1.821的枯草芽孢杆菌，按下述步骤进行发酵：
(1)热水浸提法提取铁皮石斛多糖：取新鲜石斛100g，切片，置于烘干机105℃进行烘干处理，5min后,65℃烘至恒重(约41.31g)，磨碎过40目筛，按1：80(g:mL)料液比加入石斛干粉20g和蒸馏水1600mL和，80℃水浴加热1h后过滤，滤渣重复提取一次，合并两次提取液，约3.00L，加入无水乙醇至醇的终浓度为80％，4℃过夜，过滤得粗多糖沉淀约13.77g，加5L蒸馏水复溶，把复溶后溶液浓度调为10mg/mL，取50mL复溶后溶液至100mL锥形瓶中,置于121℃，灭菌20min备用。
(2)活化微生物菌种：用接种针挑取保存的菌落，在平板上划线，恒温培养箱37℃培养24h，挑取单菌种做斜面保存或继续划平板扩增。
(3)制备种子液：从培养24h的平板上刮取3环菌种于100mL的营养肉汤培养基，恒温摇床37℃，180r/min培养24h得种子液。
(4)接种发酵：加入1mL种子液于待发酵多糖溶液中，恒温摇床培养箱37℃，180r/min，16h后，121℃灭菌20min。
测定发酵液总抗氧化能力：采用ABTS自由基清除能力测其总抗氧化性的高低，以未经过发酵的多糖原液作为对照，结果见图1。ABTS氧化后生成稳定的蓝绿色物质，在734nm处有最大吸收峰。而被测物抗氧化能力使该蓝绿色物质发生不同程度的褪色，根据吸光值的变化，计算被测物质总抗氧化能力。
从图1可以看出，和原液相比，经生物发酵的多糖总抗氧化能力得到增强。当发酵时间为16h，多糖浓度为2.5mg/mL时，对ABTS自由基的清除率为14.48％，具有较高的抗氧化能力。原液对ABTS自由基的清除率为6.21％。与原液相比，发酵16h的总抗氧化能力提高了2.3倍。
实施例2
琼脂平板培养基：琼脂粉(干粉)20g/L、牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L,pH值为7.4±0.2；液体培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L,pH值为7.4±0.2。所用的微生物为枯草芽孢杆菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为1.821的枯草芽孢杆菌，按下述步骤进行发酵：
(1)热水浸提法提取铁皮石斛多糖：取新鲜石斛200g，切片，105℃，5min后,65℃烘至恒重(约50.34g)，磨碎过40目筛，按1：80(g:mL)料液比加入石斛干粉30g和蒸馏水2400mL，90℃水浴加热1h后过滤，滤渣重复提取一次，合并两次提取液，约4.60L，加入无水乙醇至醇的终浓度为80％，4℃过夜，过滤得粗多糖沉淀约18.10g，加5L蒸馏水将沉淀复溶后，把浓度调为10mg/mL，取50mL至100mL的锥形瓶中,置于121℃，灭菌20min备用。
其余步骤同实施例1。
从图2可以看出，和原液相比，经生物发酵的多糖总抗氧化能力得到增强。当发酵时间为16h，多糖浓度为2.5mg/mL时，对ABTS自由基的清除率为15.13％，具有较高的抗氧化能力。原液对ABTS自由基的清除率为6.81％。与原液相比，发酵16h的总抗氧化能力提高了2.22倍。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种提高石斛多糖抗氧化能力的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)热水浸提法提取石斛多糖；
(2)活化微生物菌种；
(3)制备种子液；
(4)接种发酵。
2.根据权利要求1所述的提高石斛多糖抗氧化能力的方法，其特征在于：所述微生物为枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求1所述的提高石斛多糖抗氧化能力的方法，其特征在于：
步骤(1)具体过程如下：取新鲜石斛，切片，烘干至恒重，磨碎过筛，按1：80(g:mL)料液比加入石斛干粉和蒸馏水，80～90℃水浴加热1～2h后过滤，滤渣重复提取一次，合并两次提取液，加入无水乙醇至醇的终浓度为80％，过夜，过滤得粗多糖沉淀，将粗多糖沉淀用蒸馏水复溶，把复溶后溶液浓度调为10mg/mL，取50mL复溶后溶液至反应容器中，灭菌备用。
4.根据权利要求1所述的提高石斛多糖抗氧化能力的方法，其特征在于：
步骤(2)具体过程如下：用接种针挑取保存的菌落，在平板上划线，恒温培养箱37℃培养24h，挑取单菌种做斜面保存或继续划平板扩增。
5.根据权利要求1所述的一种提高石斛多糖抗氧化能力的方法，其特征在于：
步骤(3)中具体过程如下；从培养24h的平板上刮取菌种于100mL的营养肉汤培养基，恒温摇床37℃，180r/min条件下培养24h得种子液。
6.根据权利要求1所述的提高石斛多糖抗氧化能力的方法，其特征在于：
步骤(4)中具体过程如下：加入2％种子液于锥形瓶中，恒温摇床培养箱37℃，180r/min，恒温摇床培养箱37℃，180r/min，16h后，121℃灭菌20min。
7.根据权利要求1所述的提高石斛多糖抗氧化能力的方法，其特征在于：所述石斛为铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、玫瑰石斛、大苞鞘石斛、肿节石斛。
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