CN105062899B - 一株二孢拟奥德蘑菌株及其粗多糖的提取和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真菌领域，公开了一株二孢拟奥德蘑菌株及其粗多糖的提取和应用。所述的二孢拟奥德蘑菌株命名为二孢拟奥德蘑Hymenopellis raphanipes SU41，并于2015年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M 2015269。从其液体发酵菌丝体中提取得到的多糖类物质，经多项试验检测具有显著的抗氧化作用，在制备天然抗氧化剂方面具有广泛的应用前景。

Description

一株二孢拟奥德蘑菌株及其粗多糖的提取和应用

技术领域

本发明涉及真菌领域，特别是指一株二孢拟奥德蘑菌株及其粗多糖的提取和应用。

背景技术

氧化反应与人体的新陈代谢息息相关。当人体正在利用氧气进行新陈代谢反应是，不可避免的会产生一些不稳定的自由基，当体内的自由基达到一定程度时，就会损害人体健康。为了减轻或者消除氧化反应的危害，抗氧化剂尤其是天然的抗氧化剂，越来越受到重视。天然的抗氧化剂大多来源于水果或者蔬菜，在预防心脏病、癌症等疾病，以及延缓衰老、增进脑力、美容、护肤等方面均有显著的效果。大型真菌是极具开发潜力的天然抗氧化剂资源，从大型真菌中寻找新的清除体内自由基的活性物质，也是现代医药、保健行业发展的方向。

发明内容

本发明第一个方面提供一株二孢拟奥德蘑(Hymenopellis raphanipes)菌株，命名为：二孢拟奥德蘑(Hymenopellis raphanipes)SU41，并于2015年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M 2015269。

所述的二孢拟奥德蘑SU41菌株其ITS序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的二孢拟奥德蘑菌株液体发酵液的制备方法，包括以下步骤：将灭过菌的麦麸-葡萄糖培养基倒入无菌培养皿中制成平板；待培养基凝固后，在无菌条件下，每平板接入活化菌种块，培养后用打孔器从平板中打取培养后的活化菌种块，接入装有麦麸-葡萄糖液体培养基的三角瓶中，摇床培养后即得一级摇瓶菌种；之后将一级摇瓶菌种接入用于二级摇瓶发酵的麦麸-葡萄糖液体培养基，摇床培养即得所述二孢拟奥德蘑菌株液体发酵液；所述的麦麸-葡萄糖培养基组成，以重量份数记为：麦麸50份，葡萄糖20份，磷酸二氢钾3份，硫酸镁1.5份，琼脂15份，水1000份；所述的麦麸-葡萄糖液体培养基组成，以重量份数记为：麦麸50份，葡萄糖20份，磷酸二氢钾3份，硫酸镁1.5份，水1000份。

进一步，活化菌种块在平板培养基上的培养条件为：28℃，黑暗条件下培养10-12d；摇床培养所需的条件为：120r/min、28℃、黑暗条件下培养10-12d；一级摇瓶菌种接入的体积为二级摇瓶内麦麸-葡萄糖液体培养基体积的5％。

本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的二孢拟奥德蘑SU41菌株粗多糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)将二孢拟奥德蘑SU41菌株液体发酵液离心，弃去上清液，沉淀用蒸馏水洗涤得到纯菌丝体，烘干至恒重；

(2)先将菌丝体粉碎，加入蒸馏水浸提，离心后收集上清液；

(3)合并上清液并减压浓缩得浓缩液，加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，冷冻干燥，即得二孢拟奥德蘑SU41粗多糖。

进一步，所述步骤(1)中，所述的沉淀用蒸馏水洗涤2-4次。

进一步，所述步骤(2)中，加入的蒸馏水的质量为菌丝体质量的50倍，重复浸提3次；浸提过程中控制温度50-70℃，浸提2-4h。

进一步，所述步骤(3)中减压浓缩至上清液体积的1/300；洗涤沉淀所用的试剂依次为无水乙醇、丙酮和***。

本发明的第四个方面是提供本发明第三个方面所述的所述二孢拟奥德蘑SU41粗多糖在制备抗氧化剂方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明所述的新菌株二孢拟奥德蘑Hymenopellis raphanipes SU41，从野生的子实体中分离获得，并于2015年4月29日进行了菌株保藏，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国湖北省武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M 2015269。从所述的二孢拟奥德蘑SU41菌株中提取的多糖类物质，经多次试验验证，具有较好的抗氧化作用，在制备天然抗氧化剂方面具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同碳源下二孢拟奥德蘑SU41菌落生长情况；

图2为不同氮源下二孢拟奥德蘑SU41菌落生长情况；

图3为不同温度对二孢拟奥德蘑SU41菌丝生长的影响；

图4为不同温度下二孢拟奥德蘑SU41菌落生长情况；

图5为不同pH值对二孢拟奥德蘑SU41菌丝生长的影响；

图6为不同PH处理的二孢拟奥德蘑SU41菌落生长情况；

图7为二孢拟奥德蘑SU41菌株粗多糖对超氧阴离子自由基的清除效果；

图8为二孢拟奥德蘑SU41菌株粗多糖对羟自由基的清除效果；

图9为二孢拟奥德蘑SU41菌株粗多糖对DPPH自由基的清除效果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、菌株的获得

试验所用样品采集自江西省南昌市郊区。取野生子实体，放入无菌室内，用无菌水冲洗3次，进行表面消毒，随即用消毒过的解剖刀从菌盖中部纵切一刀，撕开，挑取菌盖和菌柄交界处的一小块菌肉，移接到麦麸-葡萄糖斜面培养基上，加上棉塞，在28℃、黑暗条件下培养3天，可见组织块上长出绒毛状菌丝，即得二孢拟奥德蘑菌株。

二、形态特征

子实体菌盖直径3-8.5cm，平展，中部凸起或似脐状；菌盖光滑，浅褐色或深褐色至暗褐色，有深色辐射状条纹。菌肉白色，薄。菌褶白色，弯生，较宽，不等长。菌柄近圆柱状，长6-17cm，粗0.3-1.2cm，浅褐色，近光滑，有纵条纹，表皮脆骨质，内部纤维质且松软，基部膨大且延生成假根。孢子印白色。担子具2小梗，担孢子(13-)14-20×10-18μm，宽椭圆形至近球形。平板培养的菌丝洁白，气生菌丝浓密。

三、生物学特性

培养条件：

(1)碳源对菌丝生长的影响：

基础培养基的组成为：碳源20g，大豆蛋白胨2g，磷酸二氢钾0.46g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，水1000mL，碳源分别选择麦芽糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、乳糖和葡萄糖，接入二孢拟奥德蘑菌株后，28℃，黑暗条件下培养12d。二孢拟奥德蘑在6种碳源下生长情况各不一样，二孢拟奥德蘑以麦芽糖为碳源时，生长12d的菌落直径最大；其后依次是淀粉、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖(表1)；差异显著性测验结果表明，麦芽糖对菌丝生长速度的影响较其他碳源而言，具有显著性差异(表1)；同时从生长势来看，以麦芽糖为碳源时，菌落菌丝浓密、生长势旺盛(图1)。由此可见，二孢拟奥德蘑菌丝生长的最适碳源为麦芽糖。

表1不同碳源对二孢拟奥德蘑菌丝生长的影响()

*平板培养12天的菌落直径；**同列字母不同表示差异显著。

(2)氮源对菌丝生长的影响

基础培养基的组成为：葡萄糖20g，氮源2g，磷酸二氢钾0.46g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，水1000mL。氮源分别选择氯化铵、蛋白胨、硫酸铵、酵母膏、牛肉膏，接入二孢拟奥德蘑菌株，28℃，黑暗条件下培养12d。二孢拟奥德蘑在供试的5种氮源中均能生长。当以氯化铵为碳源时，生长12d的菌落直径最大；其后依次是酵母膏、硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨(表2)。差异显著性测验结果表明，以氯化铵、酵母膏、硫酸铵、牛肉膏为氮源时，对菌丝生长速度的影响没有显著性差异，但蛋白胨和其他几种氮源比较，则有显著性差异(表2)；从生长势来看，当以酵母膏和牛肉膏为氮源时，菌落菌丝浓密、生长势旺盛；以氯化铵和硫酸铵为氮源时，菌落菌丝稀疏，生长势较弱(图2)。由此可见，酵母膏和牛肉膏为二孢拟奥德蘑菌丝生长的合适氮源。

表2不同氮源对二孢拟奥德蘑菌丝生长的影响()

*平板培养12天的菌落直径；**同列字母不同表示差异显著。

(3)不同温度对菌丝生长的影响

使用麦麸-葡萄糖培养基，接入二孢拟奥德蘑菌株，黑暗条件下培养12d。培养温度为20℃时，菌丝生长较慢；随着温度的升高，菌丝生长速度逐步加快，并且在24℃时达到最大值；当温度大于28℃时，菌丝生长速度减慢，在32℃时，菌丝几乎不生长(图3)。差异显著性测验结果表明，温度28℃和32℃对菌丝生长速度的影响差异不显著，但两者和其他温度处理间有着显著的差异；从生长势来看，在24℃时，菌落菌丝较稀疏，在28℃时，菌落菌丝浓密(图4)。由此可知，二孢拟奥德蘑菌丝生长的最适温度为28℃。

所述麦麸-葡萄糖培养基的组成为：麦麸50g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，琼脂15g，水1000g；所述的麦麸水煮半小时，过滤，取滤汁。

(4)不同pH对菌丝生长的影响

使用麦麸-葡萄糖培养基，接入二孢拟奥德蘑菌株，黑暗条件下培养12d，结果表明，二孢拟奥德蘑在pH5.0-8.5都能生长，且差异显著性测验结果表明，各pH值对菌丝生长速度的影响差异不显著(图5)；从生长势来看，不同pH值下菌落生长都很旺盛(图6)。由此可知，二孢拟奥德蘑菌丝生长对酸碱环境无严格要求。

综合以上结果，二孢拟奥德蘑菌丝生长的最适碳源为麦芽糖，适合的氮源为酵母膏和牛肉膏，最适培养温度为28℃，对酸碱环境无严格要求。

四、菌株的鉴定

所得菌株的基因组DNA经过通用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增，获得大小为722bp的特异性DNA片断，序列信息参见序列表SEQ ID NO.1。

根据以上鉴定结果，所得的菌株命名为二孢拟奥德蘑HymenopellisraphanipesSU41，并于2015年4月29日进行了菌株保藏，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国湖北省武汉市武汉大学，其保藏号为CCTCC NO:M 2015269。

五、二孢拟奥德蘑菌株液体发酵菌丝体的制备方法

将灭过菌的麦麸-葡萄糖培养基倒入9cm的无菌培养皿中制成平板；待培养基凝固后，在无菌条件下，每平板接入活化菌种块，于25-28℃、黑暗条件下培养10-12d。用打孔器从平板中打取5块直径5mm的活化菌种块，接入装有200mL麦麸-葡萄糖液体培养基的500mL三角瓶，于120r/min、25-28℃、黑暗条件下培养10-12d，即得一级摇瓶菌种；之后在500mL的三角瓶中装入麦麸-葡萄糖液体培养基100mL，灭菌后，接入一级摇瓶菌种进行二级摇瓶发酵；一级摇瓶菌种接入的体积为二级摇瓶内麦麸-葡萄糖液体培养基体积的5％，于120r/min、25-28℃、黑暗条件下培养10-12d，即得所述二孢拟奥德蘑菌株菌丝体发酵液。

上述麦麸-葡萄糖液体培养基的组成为：麦麸50g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，水1000g；所述的麦麸水煮半小时，过滤，取滤汁。

六、二孢拟奥德蘑SU41菌株粗多糖的提取

(1)将二孢拟奥德蘑SU41菌株发酵液离心，弃去上清液，沉淀用蒸馏水洗涤得到纯菌丝体，60℃烘干至恒重，菌丝体粉碎，过20目筛；

(2)称取菌丝体粉末40g，按1:50的料水质量比加入蒸馏水，50-70℃浸提2-4h，离心，得上清液，重复提取3次；

(3)合并上述上清液，减压浓缩至上清液原体积的1/300得浓缩液，加入液浓缩3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃上清液，加入与浓缩液体积相同的无水乙醇静置30min后弃上清液，沉淀以无水乙醇、丙酮、***依次洗涤3次，冷冻干燥，即得二孢拟奥德蘑SU41菌株粗多糖。

七、二孢拟奥德蘑SU41菌株液体发酵菌丝体粗多糖抗氧化活性测定

(1)二孢拟奥德蘑SU41菌株液体发酵菌丝体粗多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

在一系列的试管中加入2.8mL 0.1mol/L的Tris-HCL缓冲液(pH8.2)，然后加入0.1mL不同质量浓度(0.6，0.8，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mg/mL)的二孢拟奥德蘑液体发酵菌丝体粗多糖的样品溶液，混合均匀，于25℃水浴中保温10min，然后加入25℃水浴预温的3mmol/L邻苯三酚溶液0.1mL，混匀后迅速加入干燥的石英比色皿中，在325nm下每隔30s测定一次OD值，反应4.5min结束。以等体积10mmol/L的HCl代替邻苯三酚溶液作为调零管，空白组以等体积去离子水代替样品，VC作为阳性对照。作吸光度随时间变化曲线的回归方程，其斜率为邻苯三酚的自氧化速率V，按照下式计算样品对超氧阴离子自由基的清除率，并计算其EC₅₀值，其结果如图7及表3、表4所示。

清除率(％)＝[(V_空白-V_样品)]/V_空白×100％

V_空白为空白组邻苯三酚自氧化速率(ΔOD/min)，V_样品为样品或者阳性对照的邻苯三酚自氧化速率(ΔOD/min)。

由图7及表3、表4可见，二孢拟奥德蘑液体发酵菌丝体粗多糖具有清除超氧阴离子自由基的活性；其清除能力呈现出剂量依赖性,在0.6-8mg/mL的浓度范围内，随着浓度的增加，样品对超氧阴离子自由基的清除率也随之增加；其EC₅₀值为1.72mg/mL。

(2)二孢拟奥德蘑SU41菌株液体发酵菌丝体粗多糖对羟自由基的清除作用

分别移取20mmol/L水杨酸钠0.3mL和1.5mmol/L的硫酸亚铁1.0mL于各试管中，再分别加入不同质量浓度(0.6，0.8，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mg/mL)的二孢拟奥德蘑液体发酵菌丝体粗多糖1.0mL，最后加入0.7mL 6mmol/L H₂O₂，迅速混匀，37℃恒温水浴1h，于510nm波长下测定其OD值。以蒸馏水作为空白对照，VC作为阳性对照。按下式计算样品对羟自由基的清除率：

清除率(％)＝[(A₀-A₁)/A₀)]×100％

A₀为空白对照的OD值，A₁为加有样品或者阳性对照后的OD值。

由图8及表3、表4可见，二孢拟奥德蘑液体发酵菌丝体粗多糖具有清除羟基离子自由基的活性，EC₅₀值为1.96mg/mL；其清除能力呈现出剂量依赖性,在0.6-8.0mg/mL的浓度范围内，随着浓度的增加，样品对羟基离子自由基的清除率也随之增加。

(3)二孢拟奥德蘑SU41菌株液体发酵菌丝体粗多糖对DPPH自由基的清除作用

取1.5mL蒸馏水加入到1.5mLDPPH溶液中，迅速混匀，室温下避光静置30min后于517nm下测其OD值；取不同质量浓度(0.6，0.8，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mg/mL)的二孢拟奥德磨菌液体发酵菌丝体粗多糖溶液1.5mL加入到1.5mLDPPH溶液中，迅速混匀，室温下避光静置30min后于517nm下测其OD值。以VC作为阳性对照。按下式计算对DPPH自由基的清除率：

清除率(％)＝[(A₀-A₁)/A₀]×100％

A₀为DPPH溶液本身的OD值(空白对照)，A₁为加有样品或者阳性对照的DPPH溶液的OD值。

由图9及表3、表4可见，二孢拟奥德蘑液体发酵菌丝体粗多糖具有清除DPPH自由基的活性，EC₅₀值为1.47mg/mL；其清除能力呈现出剂量依赖性,在一定浓度范围内，随着浓度的增加，样品对DPPH自由基的清除率也随之增加。

表3二孢拟奥德蘑SU41中液体发酵菌丝体粗多糖抗氧化活性的效果()

表4二孢拟奥德蘑液体发酵菌丝体粗多糖的IC₅₀(mg/mL)

此外，由表4可见，虽然采用不同的测定方法，但是二孢拟奥德蘑液体发酵菌丝体粗多糖的EC₅₀相差不大，说明尽管测得方法不同，反应的原理不同，但是二孢拟奥德蘑液体发酵菌丝体粗多糖均表现较好的抗氧化活性，且抗氧化活性基本一致。

以上实验从多个方面说明了二孢拟奥德蘑SU41液体发酵菌丝体中提取得到的粗多糖具有良好的抗氧化作用，在制备抗氧化剂方面具有广泛的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一株二孢拟奥德蘑(Hymenopellis raphanipes)菌株，命名为：二孢拟奥德蘑(Hymenopellis raphanipes)SU41，并于2015年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M2015269；其ITS序列如SEQ IDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的二孢拟奥德蘑菌株的液体发酵液的制备方法，其特征在于：将灭过菌的麦麸-葡萄糖培养基倒入无菌培养皿中制成平板，在无菌条件下，每平板接入权利要求1所述的二孢拟奥德蘑SU41菌株活化菌种块，培养后用打孔器从平板中打取菌种块，接入装有麦麸-葡萄糖液体培养基的三角瓶中，摇床培养后即得一级摇瓶菌种；之后将一级摇瓶菌种接入用于二级摇瓶发酵的麦麸-葡萄糖液体培养基中，摇床培养后即得所述二孢拟奥德蘑菌株液体发酵液；所述的麦麸-葡萄糖培养基组成，以重量份数记为：麦麸50份，葡萄糖20份，磷酸二氢钾3份，硫酸镁1.5份，琼脂15份，水1000份；所述的麦麸-葡萄糖液体培养基组成，以重量份数记为：麦麸50份，葡萄糖20份，磷酸二氢钾3份，硫酸镁1.5份，水1000份。

3.如权利要求2所述的二孢拟奥德蘑菌株的液体发酵液的制备方法，其特征在于，活化菌种块在平板培养基上培养条件为：28℃，黑暗条件下培养10-12d；摇床培养所需的条件为：120r/min、28℃、黑暗条件下培养10-12d；一级摇瓶菌种接入的体积为二级摇瓶发酵所用麦麸-葡萄糖液体培养基体积的5％。

4.一种二孢拟奥德蘑SU41菌株粗多糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求2-3任一项制得的所述的二孢拟奥德蘑SU41菌株液体发酵液离心，弃去上清液，沉淀用蒸馏水洗涤得到纯菌丝体，烘干至恒重；

(2)先将菌丝体粉碎，加入蒸馏水浸提，离心后收集上清液；

(3)合并上清液并减压浓缩得浓缩液，加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，冷冻干燥，即得二孢拟奥德蘑SU41粗多糖。

5.如权利要求4所述的二孢拟奥德蘑SU41菌株粗多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述的沉淀用蒸馏水洗涤2-4次。

6.如权利要求4所述的二孢拟奥德蘑SU41菌株粗多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中，加入的蒸馏水的质量为菌丝体质量的50倍，重复浸提3次；浸提过程中控制温度50-70℃，浸提2-4h。

7.如权利要求4所述的二孢拟奥德蘑SU41菌株粗多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤(3)中减压浓缩至上清液体积的1/300；洗涤沉淀所用的试剂依次为无水乙醇、丙酮和***。

8.如权利要求4至7任一项所述二孢拟奥德蘑SU41粗多糖的提取方法制得的二孢拟奥德蘑SU41粗多糖在制备抗氧化剂方面的应用。