CN102643756A - 一株发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌 - Google Patents

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一株发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它涉及一株内生真菌。发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2012045，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本发明中发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，其以甘草为底物对其进行发酵可使甘草中的甘草次酸含量显著升高，甘草次酸是经典的抗炎药物，目前在医药化妆品等领域中广泛应用，还具有防癌和抗癌作用；本发明对采用内生真菌RE4发酵甘草生产甘草次酸具有指导意义。

Description

一株发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌
技术领域
本发明涉及一株内生真菌。
背景技术
微生物特别是真菌有非常强的分解转化物质的能力，并能产生丰富的次生代谢产物，通过微生物发酵中草药与一般的物理或化学加工方法相比能大幅度改变药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症。利用植物中的内生真菌对中药进行发酵，由于中药的某些物质可能对微生物的生长和代谢有促进或抑制作用，对活性成分的产生也可能有促进或抑制作用，微生物在中药的特殊环境中也可能改变自身的代谢途径，从而形成新的活性成分或改变各活性成分的相互比例，因此利用从药用植物中分离到的内生真菌来生产生物活性物质已成为当今学者的研究趋势。
发明内容
本发明提供了一株发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌。
本发明发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2012045，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日；它在PDA固体培养基上培养7d后，菌落直径为12～14cm，菌落为白色，渐变为灰绿色，基质为棕黄色，菌丝较密集，呈毡毛状，菌落边缘整齐，紧贴培养基，产分生孢子，分生孢子头呈球形，分生孢子单生，单细胞。
本发明发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，其ITS序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过MEGA5.03软件构建***进化树，RE4菌株的ITS序列与曲霉属菌(Aspergillusversicolor，编号JN545818.1)菌株的相似性都达到了98％以上，结合形态学观察结果，确定内生真菌RE4为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。
本发明发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2012045，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
本发明发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，能够以甘草为底物对其进行发酵，提高甘草中的主要活性成分——甘草次酸的含量。
本发明利用微生物制药手段提取分离甘草健康植株的内生真菌RE4，以甘草为底物进行发酵，采用HPLC法为分析手段测定甘草内生真菌RE4发酵甘草后甘草次酸的含量，最后将内生真菌RE4菌株通过形态学观察和18S rDNA序列分析鉴定其种属。
本发明中的这株能够通过发酵甘草提高甘草次酸的内生真菌RE4，它为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)，其以甘草为底物对其进行发酵可使甘草中的甘草次酸含量显著升高，甘草次酸是经典的抗炎药物，目前在医药化妆品等领域中广泛应用，还具有防癌和抗癌作用；本发明对采用内生真菌RE4发酵甘草生产甘草次酸具有指导意义。
附图说明
图1为具体实施方式一中杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4的孢子显微结构图；
图2为具体实施方式一中杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4的PCR扩增的电泳图，其中M泳道表示Marker，1泳道表示RE4；
图3为具体实施方式一中杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4的***进化树图；
图4为具体实施方式一中甘草次酸对照品的HPLC色谱图，其中1表示甘草次酸；
图5为具体实施方式一中甘草的HPLC色谱图，其中1表示甘草次酸；
图6为具体实施方式一中甘草加入对照品后甘草次酸的HPLC色谱图，其中1表示加对照品后甘草次酸；
图7为具体实施方式一中RE4发酵甘草后甘草次酸的HPLC色谱图，其中1表示加对照品后甘草次酸。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2012045，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
本实施方式中杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，它在PDA固体培养基上培养7d后，菌落直径为12～14cm，菌落为白色，渐变为灰绿色，基质为棕黄色，菌丝较密集，呈毡毛状，菌落边缘整齐，紧贴培养基，产分生孢子，分生孢子头呈球形，分生孢子单生，单细胞。
本实施方式中杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，其生长温度为28℃，生长pH值自然。
本实施方式中杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，该菌株分离自健康的野生甘草的根茎，采自大庆地区，植株年龄3年，植株健壮，无病虫害，其样本现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室；它按以下步骤进行分离培养：
选取健康的野生甘草的根茎用自来水冲洗干净后以无菌滤纸吸干水分，切成1cm小段于无菌超净台内将野生甘草的根茎按下述方法进行表面消毒：75％酒精浸泡1min-2％次氯酸钠浸泡15min-无菌水冲洗3次；用无菌手术刀将野生甘草的根茎从中间切开，分别置于5％甘草提取液马铃薯固体分离培养基和5％甘草提取液马铃薯液体分离培养基中，于28℃恒温水浴摇床和恒温培养箱中，培养3～5d，待实验材料周围长出菌体，挑取菌体转入平板(5％甘草提取液马铃薯固体分离培养基)多次划线分离纯化，将纯化后的菌株置于斜面固体培养基中，4℃保存备用；
5％甘草提取液马铃薯固体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖、20g的琼脂和余量的5％甘草提取液组成，pH值为7.0～7.2，121℃下高压灭菌30min；
5％甘草提取液马铃薯液体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖和余量的5％甘草提取液组成，pH值为7.0～7.2，121℃下高压灭菌30min；
斜面固体培养基为取5mL5％甘草提取液马铃薯固体分离培养基装于试管中，121℃高压灭菌30min后，铺成斜面冷却，以备保存菌种。
结果：从野生甘草的根茎中分离出内生真菌RE4，根据《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》进行形态学鉴定，其菌落特征和孢子形态与曲霉属菌特征极为相近，孢子显微结构如图1所示；
分子鉴定：内生真菌RE4发酵液抽滤得菌丝体用25％乙醇漂洗2次，灭菌的去离子水冲洗2次，离心去上清液，提取总DNA后进行目的片段的PCR扩增，将含有目标条带的PCR产物全部进行再一次的点样，用2％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下用解剖刀将目的条带切下，用DNA胶回收试剂盒回收，制备感受态大肠杆菌细胞，将PCR产物与pMD18-T载体进行连接后，连接产物加入到感受态细胞中，进行菌落PCR验证；挑取单菌落进行大肠杆菌转化子的PCR检测，证明目的片段已成功转化进入感受态细胞中后，将克隆阳性菌株送上海生工生物工程技术服务有限公司测序；所测定的核苷酸序列在NCBI数据库中应用BLAST分析进行同源性比较，并根据分子生物学研究的基本原理选择相应种属代表菌株的18S rDNA序列应用软件CLUSTALX 1.83和MEGA5.03以近邻结合法(Neighbor-joining)构建***发育树，bootstrap检验值≥50％(1000重复)，确定目标菌株的分类地位；
内生真菌RE4基因组经尿素法提取后，采用PCR扩增后凝胶成像结果如图2所示，在500bp附近得到一扩增片段(碱基序列见SEQ ID NO：1)，证明已成功从内生真菌RE4菌株中提取出其基因组DNA；
根据内生真菌RE4的ITS序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过MEGA5.03软件构建***进化树(见图3)，RE4菌株的ITS序列与曲霉属菌(Aspergillus versicolor，编号JN545818.1)菌株的相似性都达到了98％以上，结合形态学观察结果，确定内生真菌RE4为杂色曲霉属菌(Aspergillus versicolor)。
本实施方式中的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，其发酵甘草提高甘草次酸的实验结果如表1所示，内生真菌RE4发酵甘草提高甘草次酸实验结果表明，内生真菌RE4能够通过发酵甘草使其中的甘草次酸含量显著升高。
表1
Figure BDA0000157778690000041
注：同生药组相比*P＜0.05，**P＜0.01；同阴性对照组相比△P＜0.05，△△P＜0.01；PDA对照无甘草次酸产生。
本实施方式中的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，其发酵甘草提高甘草次酸含量的检测如下：
取干燥甘草根，用粉碎机粉碎后过40目筛，精确称取6g甘草粉，放入100mL三角瓶中，再向其中加入30mL的蒸馏水，密封后，121℃高压灭菌30min。取出，作为底物。
向已活化的内生真菌RE4菌株试管中加入无菌水，制成1×106CFU/mL菌悬液，取此菌悬液5mL加入到底物中；另取底物加等量的无菌水作为空白对照，将上述制备好的各样品于28℃，120r/min摇床培养14天。取出，冻干，即为甘草发酵样品，备用。每个样品做6个重复。
精密称取甘草发酵样品1g，准确加入10mL色谱甲醇，称重，超声提取2h，取出，放冷，以色谱甲醇补足重量，过滤，取续滤液4mL，于10mL容量瓶中定容，待测。
同时精密称取甘草生药1g，准确加入10mL的色谱甲醇，称重，超声提取2h，取出，放冷，以色谱甲醇补足重量，取续滤液4mL，于10mL容量瓶中定容，作为生药对照待测。
甘草发酵前后甘草次酸含量的测定：
色谱条件
色谱柱：VenusiL XBP-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：甲醇-水-冰醋酸(82∶17∶1)；
流速：1mL·min-1；
检测波长：254nm；
柱温：25℃；
进样量：10μL
在色谱条件下，甘草内生真菌RE4发酵甘草所制备的供试品与甘草次酸对照品相应位置的色谱峰一致，而且色谱峰经过对照品加入法得到了较好的确认，结果见图4、5、6和7，结论：发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，即杂色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，其以甘草为底物进行发酵能够使甘草次酸含量显著升高，本实施方式对采用甘草内生真菌RE4生产甘草次酸具有指导意义。

Claims (1)

1.一株发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，其特征在于它为杂色曲霉(Aspergillusversicolor)RE4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2012045，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
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