CN102242069B - 一种蝉拟青霉菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种蝉拟青霉菌株及其应用。本发明所提供的是蝉拟青霉菌株[Paecilomycescicadae（Miq.）Samson]CGMCCNo.3453。本发明的蝉拟青霉菌株[Paecilomycescicadae（Miq.）Samson]CGMCCNo.3453具有易于培养、产量高的特点，其培养产物具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功效，因此具有广泛的工业化应用价值。

Description

一种蝉拟青霉菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种蝉拟青霉菌株及其应用。

背景技术

蝉花，别名虫花，是某些蝉若虫受蝉拟青霉菌寄生后的产物，是一种菌虫复合体。此菌于1838年由Miquel定名为蝉棒束孢霉Isaria cicadae。此后出现多种同物异名。如蝉草Cordyceps cicadae，基生棒束孢Isaria basili，辛克莱球壳孢Sphaeria sinclairii，丛生虫壳菌Torrubia caespitosa，辛克莱虫草Cordyceps sinclairii，哈里棒束孢Isariahariottii，小蝉茸Cordyceps sobolifera，辛克莱棒束孢Isaria sinclairii，蒙克苏棒束孢Isaria mokanshawii和多枝棒束孢Isaria arbuscula等等。

蝉拟青霉的有性阶段被认为是大蝉草Cordyceps cicadae，在自然界广为分布的是蝉拟青霉，大蝉草稀少。常采到的是蝉拟青霉及其寄主山蝉若虫寄生后的复合体。根据历史产区浙江的1467份样品的调查，药材蝉花主要是蝉拟青霉寄生后的虫菌复合体。蝉拟青霉属半知菌类真菌，其孢梗束自虫体头部长出，单生或丛聚成束，浅黄色，长1.5～8.0厘米，前端膨大，呈纺锤形或呈鸡冠花状。

蝉花含有多糖、腺苷、虫草酸、多种人体必需氨基酸、D-甘露醇、多种生物碱、麦角甾醇等活性成分，与冬虫夏草有相似的活性成分。传统中医认为蝉花具有疏散风热，透疹，熄风止痉，名目退翳之功效，现代医学研究发现，蝉花具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等作用。

野生冬虫夏草资源有限，多年来由于其身价昂贵，形成了滥采滥摘，给植被及生态环境带来严重破坏。鉴于蝉花与冬虫夏草有相似的活性成分，还有免疫调节、解热镇痛、改善肾功能、镇静催眠等多种药理作用，说明蝉花是一种具有应用前景广阔的药用虫生真菌，可作食品、保健品、药品、化妆品等研究开发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蝉拟青霉菌株及其应用。

本发明通过如下技术方案解决上述技术问题：

一种蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]，该菌株已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCC No.3453。

本发明的蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]采用如下方法进行分离：

从云南三江源头采集纯净无污染野生蝉花标本，在净化工作台上用火焰灭菌过的移植镊从样本上取少量分生孢子于加入孟加拉红的PSA平板上置22℃-25℃下培养120h后再挑取单菌落接入斜面培养基，在22℃-25℃下培养并经反复纯化即可得本发明所述的蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]。

本发明的蝉拟青霉菌株属于半知菌亚门Deuteromycotina，丝孢纲Hyphomycetes，束梗孢目Stilbellales，束梗孢科Stilbellaceae，拟青霉属Paecilomyces。

本发明的蝉拟青霉菌株于2009年9月10日送交中国科学院生物研究所进行形态特征鉴定，鉴定结果为：

蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]，其主要形态特征为：

在PDA培养基上25℃培养10天，菌落圆形，平展，初絮状，后粉状，白色至浅黄色，背面浅黄色，直径5～6厘米。菌丝无色，分枝，具隔膜，宽1.2～2.5μm。分生孢子梗多分枝，宽3.0～5.5μm，由每轮2～5个产孢细胞组成轮状分枝。产孢细胞瓶形，基部球状膨大，向上变细窄，4.5～6.5×2.5～3.5μm。分生孢子圆柱形，单细胞，无色，平滑，链生，直或弯曲，6.5～8.8(～11.0)×2.5～3.5μm。

蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]，具有以下微生物学特征：

1、培养学的特征：

(1)置分生孢子于24℃，1％的C₆H₁₂O₆溶液作载片培养，4h萌动，8h出芽长菌丝，从分生孢子萌发开始到次代分生孢子产生需要36h；

(2)菌落在马铃薯-蔗糖-琼脂上，生长繁茂，24℃温育14d，直径达60～72mm。菌丝体灰白到浅黄，茸毛状。培养后期，因产生大量分生孢子，致使菌落外观显粉质状。菌落在蛋白胨-蔗糖-琼脂上生长佳，14d直径54～70mm，局部凸起或陷落，肉色，后期布满分生孢子，背面深褐色；

(3)液体深层发酵合成培养基以Richard培养基(KNO₃ 10g，KH₂PO₄ 5g，MgSO₄.7H₂O 2.5g，蔗糖50g，FeCl₃ 0.03g，水1000ml)为佳；

(4)温湿度：

①温度：此菌生长起点温度6℃，最佳生长温度24～26℃，但孢梗束生长期温度偏低，纯培养物经过40℃处理30h，50℃处理2.5h后失活；

②湿度：在饱和湿度下，分生孢子萌发率24h为86％，96h为99％；RH 90％时，24h萌发率为0％，96h为78.3％；RH 76％时，72h萌发率为0％，96h为18％；

(5)PH：此菌在PH 4～12范围均能正常生长，但PH 5～6菌丝体产量高，斜面培养菌落不易老化；

(6)C、N源利用：该菌能利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、甘油等碳源，但不利用菊糖、山梨糖、鼠李糖和乳糖。以葡萄糖做为碳源，分生孢子产量显著高于上述几种碳源，用果糖做为碳源，菌丝体产量高于其他碳源。对硝基、亚硝基、氨基等9种无机N培养情况来看，此菌对KNO₃利用好，而且利用硝基N比氨基N好，但不能利用NaNO₂和硫脲。该菌对碳源要求量相当敏感。譬如，将碳源维持在2％的正常生长发育水平上，提高N源或降低N源对孢梗束生长和产孢量影响不大；但将N源固定在正常生长水平上，将碳源从2％降低到0.5％，发现不产生孢梗束，或极少有孢梗束产生。反之，将碳源提高10倍(20％)，则孢梗束多而不易老化，但分生孢子产生较晚；

(7)光：该菌有明显趋光性，孢梗束生长朝向光源方向倾斜，暗培养菌丝生长旺，仅产生菌核而不形成孢梗束。自然光和灯光均能刺激孢梗束生长和分生孢子形成；

(8)此菌有强烈抗辐射现象，平板菌落离30Wt紫外光源0.5m处照射281h，移殖后未见失活，亦未见生长异常；

(9)固体发酵：以小麦等谷物做培养基，接种量3％～5％(重量百分比)，接种后3～5天，可见灰白色茸毛状菌丝体覆盖基质表面。20～25天形成菌核并长出与寄主体上相类似的孢梗束。孢梗束蛋黄色，直立、柱状或掌状分枝，20～30(～80)×3～5mm，通常30天后产生大量分生孢子，嗣后孢梗束逐渐枯萎倒伏。

2、蝉拟青霉菌种序列测定：

本发明所述蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]于2009年9月11日送于中国科学院微生物研究所进行菌种鉴定，并收到检测鉴定报告(2009)微检字第249号，鉴定结果表明送检的菌种为蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]。本发明的蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]的18S rRNA基因序列如序列表中序列1所示；其ITS1基因序列如序列表中序列2所示；其5.8S rRNA基因序列如序列表中序列3所示；其ITS2基因序列如序列表中序列4所示。

本发明的蝉拟青霉菌株可以在上述培养基和培养条件下进行培养，具有易于培养、产量高的特点，其培养产物具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能，因此具有广泛的工业化应用价值。

附图说明

图1：虫草多糖标准曲线

图2：甘露醇标准曲线

图3：腺苷虫草素校正曲线图

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1、蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]CGMCC No.3453的分离

1、按照如下配比制备培养基；

马铃薯蔗糖琼脂培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，水1000ml；

蛋白胨蔗糖琼脂培养基：蛋白胨20g，蔗糖10g，琼脂20g，水1000ml。

2、菌种分离：

从云南三江源头采集纯净无污染野生蝉花标本，在净化工作台上用火焰灭菌过的移植镊从样本上取少量分生孢子于加入孟加拉红的PSA平板上置22℃-25℃下培养120h后再挑取单菌落接入斜面培养基，在22℃-25℃下培养并经反复纯化即可得本发明所述的蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]。

3、菌种培养：

将蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]CGMCC No.3453接于铃薯蔗糖琼脂培养基上，24℃温育14天，直径达60～72mm，生长繁茂，培养初期，菌丝体灰白到浅黄，茸毛状；培养后期，因产生大量分生孢子，致使菌落外观显粉质状。

将蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]CGMCC No.3453接于蛋白胨蔗糖琼脂培养基上，24℃温育14天，直径54～70mm，生长佳，局部凸起或陷落，肉色；后期布满分生孢子，背面深褐色。

4、菌种序列测定：

按如下配比制备马铃薯蔗糖培养液：马铃薯200g，蔗糖20g，水1000ml。

将蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]CGMCC No.3453在马铃薯蔗糖培养液摇瓶培养3天(140rpm，24℃)，过滤收集菌丝体，加液氮研磨破碎，以氯化苄法提取菌种的总DNA。

以总DNA为模板，参照文献《Eiji Yokoyama，Kenzo Yamagishi，Akira Hara，Development of a PCR-based mating-type assay for Clavicipitaceae，FEMS MicrobiologyLetters 237(2004)205-212》的方法扩增蝉拟青霉ITS1-5.8S-ITS2rDNA区域。

所用引物为Foreword primer：5’GTCATATGCTTGTCTCAAAG和Reverse primer：5’TTACTGGGGCAATCCCTGTT。PCR反应体系(25μL)为：2.5μL10×Taq酶缓冲液，dNTP各200μmol/L，MgCl₂ 1.5mmol/L，引物0.2ng，Taq酶1.5U，模板DNA20ng～1μg。

扩增反应在PCR仪上的反应程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃保持4分钟，共运行35个循环；72℃延伸10分钟。

PCR反应完毕后，将凝胶电泳产物用凝胶回收试剂盒纯化回收对所得序列与NCBI数据库进行序列比较分析，结果表明本发明所述菌种为蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]。

实施例2蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]CGMCC No.3453固体培养及成分分析

菌种的固体培养：

(1)菌种制备：实施例1所得菌种；

(2)配料装盒：配制固体培养基，将配好的培养基装入培养盒中，装料量为15％，用封口膜封口；本实施方式所述的固体培养基配比为基质46重量份，甘蔗渣10重量份，贝壳粉0.5重量份，蚕蛹粉5重量份，硝酸钾0.5重量份，水为44重量份；其中基质为粟和蔗糖(以粟和蔗糖的总重量计，粟的重量百分比为98％，蔗糖的重量百分比为2％)。其制备方法为：先将粟煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、贝壳粉、蚕蛹粉按照比例混合均匀。

(3)灭菌：将培养盒放入灭菌锅中，于0.15MPa压力下灭菌30min；

(4)接种：在固体培养基冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，每300ml一级种接80只培养盒；

(5)固体发酵：接种后的培养盒移至培养室在25℃，相对湿度80％下培养50天，后期孢梗束生长阶段要求采光，且环境温度相较前期菌丝体生长阶段需低2～3℃，每天需适时开窗通气，保持培养室内空气新鲜；

(6)采收：当蝉花培养物的孢梗束高度达9cm左右、表面有少量分生孢子出现时即可采收；采收时，去掉封口膜，用工具将培养基培养物取出分离孢梗束，烘干分级，冷却后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20℃贮存。

一：多糖检测方法

1实验原理

采用苯酚硫酸比色法对样品多糖进行检测。其原理是：多糖类在浓硫酸作用下先水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，糖醛衍生物再与酚性物质如苯酚反应生成有色化合物，在波长490nm处有最大吸收，且满足朗伯-比尔定律，通过检测样品在该波长下的吸光值，即可算出样品中多糖的含量。

2仪器与材料

2.1主要仪器  紫外可见分光光度计；电子天平；可调式封闭电炉；离心机H-1650。

2.2实验试剂  无水葡萄糖(AR)；苯酚(AR)；浓硫酸(AR)；屈臣氏蒸馏水。

试剂配制  5％苯酚溶液：精确称取5g苯酚，用水定容至100ml。

          葡萄糖标准液配制：配制浓度为0.25mg/mL的葡萄糖标准液，精确称取0.2500g烘干后的葡萄糖，加水定容至1000mL。

2.3材料  实施例3的培养产物

         天然蝉花(产自云南)

3实验方法

3.1样品粗多糖提取液的制备精确称取1g样品置于干燥的500ml锥形瓶内，称量瓶与样品的总质量记为ml，向三角瓶中加入沸腾蒸馏水约70ml，放置于电炉之上使其持续沸腾15min后，迅速放于冷水中冷却至室温，取出，擦干瓶外壁的水珠后，向其中加入蒸馏水至最终质量为ml+100g，加水完毕之后摇匀，过滤，接取过滤液，稀释2倍备用，即为待测样品，-20℃保存。

3.2样品粗多糖的测定

3.2.1标准曲线的绘制精密称取无水葡糖0.2500g，用蒸馏水配制成0.25mg/ml的葡萄糖标准品溶液，吸取葡萄糖标准液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1ml，分别置于具塞试管中，各加蒸馏水，使体积为2.0ml，再加5％苯酚溶液1ml，摇匀，迅速滴加98％硫酸5ml，摇匀后放置5分钟，置沸水浴中加热15分钟，取出冷水冷却至室温；另加蒸馏水2ml，同上操作做空白对照，于490nm处测定吸光值(Abs)。以标准品葡萄糖浓度(mg/ml)为横坐标，Abs为纵坐标，得回归方程：Y＝0.6622X+0.0088，R²＝0.9997，说明标准品葡萄糖量在0～2.75mg/ml范围内，与Abs呈良好的线性关系。

3.2.2实验数据处理

$M=\frac{a\×C\×V\×\left(8\mathrm{mL}\right)}{W\×\left(0.1\mathrm{mL}\right)}$

M：多糖含量(mg/g)；a：稀释倍数；C：待测液多糖浓度(mg/mL)；

V：体积(mL)；W：样品质量(g)

二：甘露醇检测方法

1实验原理利用多元醇化合物甘露醇成分与高碘酸钠及Nash试剂产生的显色反应，测定样品中甘露醇的含量。

2仪器与材料

2.1主要仪器  紫外可见分光光度计；电子天平；离心机H-1650；电热恒温水箱CU600型；可调式封闭电炉。

2.2实验试剂  甘露醇标准品；醋酸铵、乙酰丙酮、冰醋酸、高碘酸钾、L-鼠李糖。

试剂配制

高碘酸钾溶液：15mmol(即3.45g)高碘酸钾溶于1L 0.12mol/L盐酸溶液中。

Nash试剂：150g醋酸铵+2mL冰醋酸+2mL乙酰丙酮，用蒸馏水稀释至1L(现用现配)。

L-鼠李糖溶液：L-鼠李糖100mg，用蒸馏水定容至100mL。

2.3实验材料  实施例3的培养产物

             天然蝉花(产自云南)

3实验方法

3.1样品甘露醇提取液的制备精确称取1g样品置于干燥的500ml锥形瓶内，称量瓶与样品的总质量记为ml，向三角瓶中加入沸腾蒸馏水约70ml，放置于电炉之上使其持续沸腾15min后，迅速放于冷水中冷却至室温，取出，擦干瓶外壁的水珠后，向其中加入蒸馏水至最终质量为ml+100g，加水完毕之后摇匀，过滤，接取过滤液，即为待测样品，-20℃保存。

3.2样品甘露醇的测定

3.2.1标准溶液的配制精密称取D-甘露醇标准品0.1g于烧杯中，加少量蒸馏水溶解完全，转移至100ml容量瓶中定容，配制成1mg/ml的甘露醇溶液，进行稀释后，得到质量浓度分别为10、50、90、130、170mg/L的甘露醇标准溶液。取上述浓度标准品甘露醇溶液各1mL，分置不同试管中，然后分别加1mL高碘酸钠溶液，混匀，室温放置10min，加2mL0.1％L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸盐，振荡混匀，加4mL新鲜配制的Nash试剂，53℃水浴加热15min使其显色，快速冷却至室温，在412nm波长处测定其吸光度。以蒸馏水代替甘露醇标准溶液，用同样的方法操作作为对照，测定其吸光度。以标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。以标准品甘露醇浓度(mg/ml)为横坐标，Abs为纵坐标，得回归方程：Y＝0.0826X+0.0019，R²＝0.9998，说明标准品甘露醇量在0～21.25mg/L范围内，与Abs呈良好的线性关系。

3.2.2实验数据处理

$M=\frac{a\×C\×V\×\left(8\mathrm{mL}\right)}{W\×\left(1\mathrm{mL}\right)}$

M：甘露醇含量(mg/g)；a：稀释倍数；C：待测液甘露醇浓度(mg/mL)；

V：提取溶液体积(mL)；W：测试样品量(g)

三：腺苷含量测定方法

1仪器与试剂

11仪器

Waters 1525 Binary HPLC Pump；

Waters 2998 Photodiode Aarry Detector；

超声波清洗仪SB25-12DT，宁波新芝生物科技股份有限公司；

电子天平AL104型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

二两装高速万能粉碎机QE-100克，浙江屹立工贸有限公司；

Simplicity，Millipore；

针筒式过滤器0.22μm，Pall。

1.2试剂

腺苷068K0691，Sigma；

虫草素2007914，Sigma；

乙腈HPLC，Lot100606，Fisher；

甲醇HPLC，Lot096964，Fisher；

石油醚AR级，60-90℃，国药集团化学试剂有限公司；

磷酸二氢钾AR，10017618，国药集团化学试剂有限公司；

屈臣氏蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司。

1.3样品  实施例3的培养产物

         天然蝉花(产自云南)

2方法

2.1色谱条件

色谱柱：XBridge C18色谱柱(Waters，4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾(5∶95)；

流速：1.0mL/min；

检测波长：260nm；

柱温：35℃；

进样量：20μL。

2.2腺苷虫草素标准曲线绘制

精密称取50mg腺苷对照品，置50mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度制成1mg/mL溶液。精密移取适量1mg/mL腺苷对照品溶液，分别配制成1、5、10、30、50、100μg/mL的腺苷标准液，备用。

2.3供试品溶液的制备

取约1.0g样品粉末，精密称定，置具塞100mL具塞锥形瓶中，加石油醚(60-90℃)10mL，密塞，超声30分钟，滤过，弃去石油醚，取药渣挥干，连同滤纸一并置具塞瓶中，在瓶中加入20mL超纯水，称总重(包括锥形瓶重量)，超声30min。快速冷却后称重，以超纯水补至总重，混匀后离心，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，备用。

2.4标准曲线绘制

将对照品1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、100μg/mL溶液进样，按

2.1项下色谱条件测定，以样品浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积(微伏·秒)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y＝7.08e+004x-1.05e+004，R²＝0.999978，在1～100μg/mL与峰面积线性关系良好。

2.5供试品腺苷含量测定

取2.3项下制备的供试品溶液，与超纯水以2∶1的比例混合，制成待测液。取待测液按2.1项下色谱条件进样，由回归方程得待测液腺苷浓度x(μg/mL)，根据下列公式得到供试品腺苷含量(mg/g)。

检测结果

本实施例中制得的蝉花培养产物中的各种有效成分均比含量比天然蝉花高，且产物质量稳定，具有很高的实际应用价值。

实施例3、蝉拟青霉培养物对5/6肾切除大鼠模型的肾功能影响

受试物：实施例2的培养物(后简称人工蝉花)。

阳性对照药：科素亚，杭州默沙东制药有限公司生产；天然蝉花，产地为浙江。

实验动物：

SPF级雄性SD大鼠70只，2月龄，体重200±10g，由上海中医药大学实验动物中心提供。

分组与造模：

SD大鼠适应性喂养1周后，随机分成2组：空白组(假手术组)8只和实验组(手术组)62只。采用5/6肾大部分切除方法建立实验大鼠模型：第1次手术，手术组大鼠左肾总切除肾皮质重量占左肾重量的2/3；7d后进行第2次手术，右肾全切。两次手术供切除两肾总重量的5/6。假手术组SD大鼠采用同样步骤暴露肾脏，分离肾包膜，但不予肾切除。手术组动物存活54只，假手术组全部存活8只。于第2次手术后2周，所有动物行目内眦动静脉丛采血，进行血肌酐(Scr)检测。并将54只手术组大鼠，根据Scr分层随机分成5组：模型对照组(模型组)12只，科素亚组10只，天然蝉花组11只，人工蝉花大剂量组(A组)10只，人工蝉花小剂量组(B组)11只。科素亚组，天然蝉花组，人工蝉花大剂量组(A组)，人工蝉花小剂量组(B组)大鼠在第2次手术后4周开始喂药，治疗时间为42d。实验结束时大鼠存活44只，假手术组、人工蝉花大剂量组(A组)各8只，模型组、科素亚组、天然蝉花组、人工蝉花小剂量组(B组)各7只。

给药剂量：

天然蝉花组、人工蝉花大剂量组(A组)大鼠按4g·kg^-1·d^-1用量，人工蝉花小剂量组(B组)按2g·kg^-1·d^-1用量，加入饲料中给药，并每日用生理盐水灌胃1次；科素亚组大鼠采用灌胃法，按30mg·kg^-1·d^-1用量，溶于生理盐水中，每日灌胃1次。所有大鼠分组分笼饲养，每笼4-5只大鼠，实验期间全部大鼠自由饮水，进食市售块状颗粒普通饲料。

测试仪器及方法：

实验结束时检测所有大鼠的Scr、尿素氮(BUN)、白蛋白(Alb)；收集24h尿液，测定尿蛋白定量。以上指标采用日立7170型自动生化分析仪测定。

以HE染色和PAS染色肾组织病理片检查肾小球硬化，其中，肾小球硬化定义为毛细血管腔塌陷和/或玻璃样变。采用Rajj等的半定量方法只评估肾小球硬化程度。在光镜(×200)视野下，每张切片至少观察40个肾小球，根据肾小球硬化灶所占肾小球比例分为0-++++，0表示肾小球无硬化，+表示1个肾小球的25％受损，++表示26％-50％受损，+++表示51％-75％受损，++++表示76％-100％受损。然后计算肾小球硬化指数(GSI)。

采用SPSS Version 11.0 for Windows进行数据统计，以均数±标准差表示，组间比较采用One-Way ANOVA分析，统计显著性水平为P＜0.05。

试验结果：

结果发现，大鼠的Scr、BUN值，各治疗组较模型组显著降低(P＜0.05)，人工蝉花各组(大剂量组、小剂量组)与天然蝉花相比无统计学差异(P＞0.05)，大鼠的血白蛋白值，假手术组、科素亚组、天然蝉花组、人工蝉花大剂量组(A组)显著升高(P＜0.05)，而人工蝉花大剂量组(A组)与天然蝉花组及假手术组相比无统计学差异(P＞0.05)；大鼠的24h尿蛋白量，各组与假手术组相比，均明显增加(P＜0.05)，但科素亚组、天然蝉花组、人工蝉花大剂量组(A组)与模型组相比较，则有明显减少(P＜0.05)。见下表。

模型大鼠血液学及尿液检测结果比较

注：与假手术组比较，^△P＜0.05；与模型组比较，^*P＜0.05；与天然蝉花组比较，^#P＜0.05

常规HE及PAS染色，光镜下观察肾组织病理学变化：假手术组大鼠肾小球血管开放，结构清晰，PAS染色后肾小球胶原呈细线状分布；模型组大鼠肾小球系膜区基质中重度增多伴系膜细胞中重度增生，部分毛细血管襻受压闭塞，玻璃样病变，并伴间质淋巴细胞浸润，部分肾小管内见蛋白管型。各治疗组肾小球硬化程度比模型组明显减轻(P＜0.05)，依次为B组＞A组＞科素亚组＞天然蝉花组，A组、B组和天然蝉花组相比无统计学差异(P＞0.05)。见下表

各组肾小球硬化指数及基质阳性面积比值比较

注：与假手术组比较，^△P＜0.05；与模型组比较，^*P＜0.05；与天然蝉花组比较，^#P＜0.05

实施例4急性经口毒性试验

A.样品名称：实施例2的培养物

B.样品配制：称取样品10000mg，加蒸馏水至40ml，充分混匀后作为受试样品。

C.实验动物：昆明种小鼠20只，雌雄各半，体重19-22克，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005。饲养室温度20-25℃，相对湿度：40-70％。实验室动物使用许可证号：SYXK(沪)2007-0008。小鼠饲料由苏州双狮实验动物饲料科技服务有限公司提供，登记证号：苏E饲生字(2002)006。

D.实验方法：

1.动物禁食(不禁水)16小时后，按体重要求选用雌、雄小鼠各10只，分放于两鼠笼内，同性别小鼠之间体重差不超过3g。

2.将受试样品采用最大耐受剂量法对实验动物染毒，小鼠逐只称重，灌胃容量按每次0.4ml/20g体重计，在24小时内二次对小鼠灌胃，灌胃间隔时间为6小时。

3.染毒后，观察动物的一般状态、体重变化、中毒症状和死亡情况等。观察期为一周。

4.实验末再次对动物称重。对死亡动物及到期处死的动物进行尸体解剖，肉眼观察大体病理改变情况。

5.实验全过程及观察内容均做详细记录，按最大耐受剂量法试验结果，求得小鼠急性经口MTD。

E.结果：

雌雄小鼠急性经口毒性试验结果

1.主要体征表现：

试验期间各组动物活动正常，毛色光泽度好，未见任何中毒体征和死亡；到期处死动物，大体解剖肉眼观察各脏器情况，未见异常。

2.雌性小鼠：MTD＞10000mg/kg

雄性小鼠：MTD＞10000mg/kg

F.结论：

样品对雌雄小鼠急性经口毒性试验的最大耐受剂量MTD均大于10000mg/kg。属于实际无毒级。

实施例5、蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]CGMCC No.3453培养物的药理作用

对本实施例中分离培养的蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]CGMCC No.3453培养物的药理作用进行检测，检测结果如下：

1、解热镇痛作用：具体检测方法参见“陈祝安，刘广玉，胡菽英，蝉花的人工培养及其药理作用研究，真菌学报，1993，12(2)：138；王海颖，陈以平，陈以平教授巧用蝉花经验，中国中医药信息杂志，2000，7(10)：71”，检测结果证明蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]CGMCC No.3453培养物具有很好的解热镇痛作用；

2、对免疫功能影响作用：具体检测方法参见“宋捷民，陈玲，陈玮等，蝉花对免疫功能影响的实验研究，中国中医药科技，2007，14(1)：371”，检测结果证明蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]CGMCC No.3453培养物可显著提高血清溶血素水平及巨噬细胞活性，促进免疫功能。

综上，可见蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]CGMCC No.3453培养物具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能。

Claims (2)

1.一种蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae（Miq.）Samson]，所述蝉拟青霉菌株的保藏号为CGMCC No.3453。

2.蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae（Miq.）Samson]在食品、保健品和药品制备中的应用，所述蝉拟青霉菌株的保藏号为CGMCC No.3453。

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