CN109619352A - 一种黑、红枸杞复合发酵饮料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型黑、红枸杞复合发酵饮料及其制备方法，属于食品微生物发酵技术加工领域。主要包括：将原料预处理→榨汁→超声波辅助壳聚糖固定化复合酶处理→过滤→巴氏杀菌→乳酸菌复合发酵剂初步发酵→活性干酵母菌和醋酸菌二次发酵→糖酸调配→离心→巴氏杀菌→灌装→饮料成品。本发明提供的制备方法工艺简单,加工成本低,制备出来的饮料既有枸杞的风味，又有发酵特有的气味和愉悦的醇香和柔和的酸味,使口感更加细腻，无不良异味，色泽均一，营养保健功能俱佳；其总酸2.83％，pH3.70，植物水性蛋白质2.83g/L，总酚38.17mg/L，类胡萝卜素35.67ug/L，酒精度≤1％，细菌和大肠杆菌未检出。

Description

一种黑、红枸杞复合发酵饮料及其制备方法

技术领域

本发明属于食品微生物发酵技术加工领域，具体涉及一种黑、红枸杞复合发酵饮料及其制备方法。

背景技术

枸杞(Lyciumbarbarum)又名枸杞子或枸杞的果实，是茄科落叶灌木，广泛分布于中国西北部，欧洲东南部和地中海地区的干旱和半干旱地区。枸杞是世界上著名的中药材和保健食品，它具有帮助滋养肝肾，提神明目等功能。枸杞中主要的化学成分如枸杞糖类、色素、氨基酸、黄酮及碱类等有大量的药理作用。黑枸杞(LyciumruthenicumMurr)又名黑果枸杞，树属多棘刺灌木，大都分布在高山沙地，含有丰富的紫花色苷素，含有丰富的游离氨基酸、维生素、少量的微量元素，营养物质非常高，它具有可以延缓人体细胞组织的老化、护肝明目、抗疲劳、改善睡眠等作用。

目前，对于枸杞发酵饮品的研究众多。如公开号为CN104273625B的发明专利“一种枸杞奶醋保健饮料”，公开了一种以枸杞等中草药及牛奶为原料的功能性奶醋保健饮料，既是带有奶味的保健醋饮料，也是带有醋酸味的奶制品，能够满足人们对饮料风味、保健功效、营养等多层次的需求。本发明采用酒精发酵、醋酸发酵、乳酸发酵三段式发酵工艺，中草药采取先浸提、后与三段式发酵同步微生物发酵提取的两段式提取工艺，酒精发酵采用固态、液态发酵共存发酵工艺。产品色泽红棕，酸甜可口，柔和清凉爽滑，口感醇厚，汁液清澈明亮，无杂质；不仅保留了枸杞、牛奶的复合香味，也具备了微生物发酵产生的酸感及酯类等风味物质，具有生津止渴、增强免疫力、抗疲劳等功效，具有中草药活性成分浸出率高、风味好、生产周期短、劳动强度低、产品风味好等优势。

又如公开号为CN106367284A的发明专利“一种枸杞甘草苹果保健醋的液态深层发酵工艺”，提供一种枸杞甘草苹果保健醋的液态深层发酵工艺，包括如下步骤：(1)苹果原汁的制备；(2)调糖；(3)酵母前发酵；(4)液态深层醋酸发酵(5)粗滤、后熟；(6)枸杞甘草浸提液的制备；(7)调配、杀菌与灌装。本发明工艺将保健果醋与宁夏特有的枸杞和甘草有机结合，并利用液态深层发酵工艺，大大缩短发酵周期，制备一种营养价值高、口味清新独特、外观澄清色泽好、醋酸刺激味小的枸杞甘草苹果保健醋。

但传统果醋发酵过程通常采用先酒精发酵后醋酸发酵工艺，工艺流程复杂，发酵周期长。且所得果醋产品酸度过于尖锐，口感不佳。因此目前亟待提供一种枸杞发酵工艺，不仅可以保持枸杞中丰富的营养物质，而且可以带来口感风味俱佳的品评效果。

发明内容

本发明的目的提供一种采用酶解技术结合复合发酵菌剂两阶段发酵微生物技术制备出口味好、营养丰富的黑、红枸杞发酵饮料及其制备方法。所获得的饮料产品具有味道独特、口感细腻爽滑、营养丰富的特点。

一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法，具体步骤如下：

(1)枸杞汁的制备：将黑枸杞和红枸杞按照质量比为3-5：6-8混合，经浸泡后加水混合打浆，得到枸杞混合浆；

(2)过滤、酶解：将所述枸杞混合浆过滤、添加20g/L-25g/L的固定化复合酶进行超声酶解，得到枸杞酶解液；所述固定化复合酶中酶组成为：果胶酶：纤维素酶质量比1：2-3混合；

(3)杀菌：所述枸杞酶解液经杀菌、冷却得到枸杞清液；

(4)初步发酵：将嗜热乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李乳糖杆菌菌液按照体积比1-3：1-2：1-3混合，并按照总接种量2％-4％接种于所述枸杞清液中，控制发酵温度30℃-35℃，发酵时间40h-45h，得到枸杞初步发酵液；

(5)二次发酵：将酵母菌与醋酸菌菌液按照体积比1-2：1组合，并以接种量1％-3％接种于所述枸杞初步发酵液中，控制发酵温度26-28℃，发酵时间12-24h，得到二次发酵液；

(6)所述步骤(5)得到的二次发酵液经调配、离心、杀菌、灌装后得到饮料成品。

优选地，所述步骤(1)中，所述枸杞与水质量比为1：6-7；所述浸泡具体为用水浸泡，浸泡温度为60℃-65℃，浸泡时间为2-3h。

优选地，所述步骤(1)中，所述黑枸杞与红枸杞均为无斑点、无病害、无腐烂、无霉变质的枸杞。

优选地，所述步骤(2)中固定化复合酶的制备步骤如下：

①混合液A的制备：将壳聚糖与浓度为1％-1.5％的冰醋酸溶液按照质量体积比0.5-1.5g：100ml混合均匀，溶解，得到混合液A；

②混合液B的制备：将浓度为5％-15％的NaOH溶液与95％乙醇按照体积比(3-5)∶1混合，得到混合液B；

③所述混合液A与混合液B按照体积比4-8∶100，将混合液A逐滴加入到混合液B中，4℃条件下静置8-12h，再将戊二醛与混合液B按照体积比2-5：100，将戊二醛滴加至混合液B中，经搅拌后再静置2-4h，抽滤并水洗至偏中性，得到交联的壳聚糖-戊二醛载体，将所述壳聚糖-戊二醛载体加入复合酶液中，所述复合酶液中的复合酶与壳聚糖质量比为0.01-0.015：1，振荡均匀后，4℃固定12-15h，水洗，抽干即得固定化复合酶；所述复合酶组成为：果胶酶：纤维素酶质量比1：2-3混合。

所述步骤③中，戊二醛的浓度为5％-10％。

优选地，所述步骤(2)中，所述超声酶解温度50℃-55℃，超声酶解时间65min-70min；所述超声功率为100W-500W。

所述步骤(2)中，超声波有助于酶解是因为超声波的强烈振动和空化效应能使有用因素急速溶入溶剂，并且超声波具有促进酶解和用时短等优点。

优选地，所述步骤(2)中，所述过滤具体为利用纱布过滤所述枸杞混合浆。

优选地，所述步骤(4)中，所述嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳糖杆菌菌液按照体积比1：(1-2)：(1-2)混合。

优选地，所述步骤(4)中，所述嗜热乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李乳糖杆菌菌液制备步骤为：将所述嗜热乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李乳糖杆菌经活化后按照接种量1-3％分别接种至MRS培养基中，30-37℃分别静置培养：鼠李乳糖杆菌12-18h,植物乳杆菌8-12h,嗜热乳杆菌10-14h，将发酵液经离心，稀释菌体，得到菌种活力为1×10⁶-5×10¹⁰CFU/mL的菌液。

更优选地，所述步骤(4)中，所述离心条件为：7000-8000rpm，15-20min。

更优选地，所述步骤(4)中，MRS液体培养基的配方为：蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母膏5g，无水乙酸钠5g，柠檬酸钠5g，磷酸氢二钾5g，吐温1mL，四水合硫酸锰0.25g,七水合硫酸镁0.58g，葡萄糖20g,加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH为6.2-6.8，分装后121℃高压灭菌15-20min。

所述步骤(4)中，在此工艺条件下发酵枸杞饮料具有较好的品质，所述枸杞初步发酵液的pH为3-3.72。

所述步骤(4)中，此发酵过程产生愉悦的醇香。

优选地，所述步骤(5)中，所述酵母菌以及醋酸菌菌液的制备步骤为：将所述酵母菌以及醋酸菌经活化后按照接种量1％-1.5％分别接种至YPD液体培养基以及醋酸菌培养基中，在26-30℃静止培养22-24h，将发酵液经离心，稀释菌体，得到菌种活力为1×10⁶-5×10⁹CFU/mL的菌液。

更优选地，所述步骤(5)中，所述离心条件为：7000-8000rpm，15-20min。

更优选地，所述步骤(5)中，所述醋酸菌培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，余量为水，121℃灭菌15min。待培养基冷却至50℃时，加入2g经165℃干热灭菌30min的碳酸钙和3mL无水乙醇。

优选地，所述步骤(6)中，所述调配具体为：向所述二次发酵液中加入质量百分比1％-1.5％的白砂糖，使口感更加细腻，无不良异味。

优选地，所述步骤(6)中，所述离心具体为：用离心机离去不稳定的沉淀使色泽均一，离心转速为8000-10000rpm，离心时间是10-15min；

优选地，所述步骤(3)以及步骤(6)中，所述杀菌具体为巴氏杀菌，杀菌温度70℃-75℃，时间2-3h，杀菌后立刻冷却至10-15℃。

优选地，所述步骤(6)中，所述灌装具体为：将杀菌后的饮料在10-15℃条件下冷却，灌装即为饮料成品。

本发明的另一目的是提供由上述黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法制备获得的黑、红枸杞复合发酵饮料。

有益效果：

乳酸菌发酵饮品有其独特的乳酸香气，酵母菌发酵产品有酒精的醇香，醋酸菌发酵产品有乙酸所带来的刺激性酸味，而醋酸发酵中产生的柠檬酸、苹果酸和酒石酸含量增加缓冲了这种刺激性的酸味,使得醋酸味更加柔和,现将三者结合在一起，会进一步提高产品的价值及风味特征。

本发明以药食同源的黑红枸杞为原料，采用酶解技术结合乳酸菌和酵母菌、醋酸菌复合发酵剂二次发酵微生物技术制备出兼具风味与保健功能为一体的新型黑、红枸杞复合发酵饮料。本发明的制备方法具有以下技术效果：

(1)酶解高效：本发明在发酵前用壳聚糖固定化复合酶，可以解决使用游离酶制剂存在较难回收和资源较高等问题，并且以壳聚糖为载体制得的固定化酶，稳定性较高，机械机能较好且容易回收，而壳聚糖作为自然阳离子澄清剂，含有较好的絮凝作用，使其絮凝是由于它可以和果浆中带负电荷物质如蛋白质、果胶、纤维素互相作用。借助超声波有助于酶解是因为超声波的强烈振动和空化效应能使有用因素急速溶入溶剂，并且超声波具有促进酶解和用时短等优点。

且通过本发明制备的固定化酶能酶解出枸杞液中更多的活性成分，更有益于人体的消化吸收。

(2)混菌发酵：利用本发明混合菌剂发酵枸杞汁，不仅可以改善枸杞本身无悦人风味，赋予枸杞汁独特的风味，而且改善单一菌株发酵产生的不良酸味。

本发明在初步发酵过程中，利用嗜热乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李乳糖杆菌混合菌剂经过特定配比的组合发酵枸杞汁，通过测定发酵液pH值、总挥发性化合物验证说明，可显著改善发酵饮料和风味、保证产品安全性，本发明的初步发酵的菌剂组合所获得的技术效果显著优于单一菌发酵以及混合菌其他配比的发酵效果。

(3)本发明在二次发酵过程中，酵母菌剂以及醋酸菌的选择组合以及特定的配比有效控制了发酵生产过程中的(pH对于枸杞汁的风味尤为重要)，它不仅可以抑制菌种的活性，也是影响饮品质构,风味和产品的货架寿命。

本发明的酵母菌、醋酸菌二次混合发酵，优于先酵母再醋酸发酵的特征在于：分别测定两种发酵方法下的pH和感官评价可得，两者混菌发酵的pH数值适中且口感较好，而先活性干酵母粉后活性干醋酸菌发酵的饮料pH比较低且酸味重，其原因在于前者各自产生的酸和醇更好的转化成酯类，而后者先酵母发酵产生的醇没有很好的和醋酸发酵产生的酸更好的结合。发酵产生愉悦的醇香和柔和的酸味，制得一种风味独特且富含保健功能的拘杞发酵饮品。

附图说明：

图1为本发明黑、红枸杞复合发酵饮料的制备工艺流程；

图2为本发明实施例7中不同菌剂配比的总酸产量；

图3为本发明实施例7中不同菌剂配比的感官评分；

图4为本发明实施例10中不同菌剂组合的pH变化；

图5为本发明实施例11中枸杞发酵汁的风味感官特性(QDA)图；

图6为本发明实施例11中挥发性物质种类对比。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

固定化酶的制备

①混合液A的制备：将壳聚糖与浓度为1％-1.5％的冰醋酸溶液按照质量体积比1g：100ml混合均匀，溶解，得到混合液A；

②混合液B的制备：将浓度为5％-15％的NaOH溶液与95％乙醇按照体积比(3-5)∶1混合，得到混合液B；

③所述混合液A按照体积比4-8∶100逐滴加入到混合液B中，4℃条件下静置8-12h，按照戊二醛与混合液B按照体积比2-5：100，再向混合液B中滴入浓度为5％-10％的戊二醛，搅拌后再静置2-4h，抽滤并用水洗至偏中性，得到交联的壳聚糖-戊二醛载体，将所述壳聚糖-戊二醛载体加入复合酶液中，所述复合酶液中的复合酶与壳聚糖质量比为0.01-0.015：1，所述复合酶组成为：果胶酶：纤维素酶质量比1：2-3，振荡均匀后，4℃固定12-15h，用蒸馏水洗去未固定的酶，再抽干即得固定化复合酶。

在本发明一实施例中，所述步骤②中，NaOH浓度为5％-15％，具体可以为5％、8％、10％、12％、15％等。

在本发明一实施例中，所述步骤②中，NaOH与95％乙醇体积比(3-5)∶1混合，具体可以为3：1、4：1、5：1等。

在本发明一实施例中，所述步骤③中，戊二醛浓度为5％-10％，具体可以为5％、6％、7％、8％、9％、10％等。

在本发明一实施例中，所述步骤③中，所述复合酶组成为：果胶酶：纤维素酶质量比1：2-3，具体可以为果胶酶：纤维素酶质量比1：2、1：2.5、1：3等。

实施例1固定化酶的制备

①混合液A的制备：将壳聚糖与浓度为1％的冰醋酸溶液按照质量体积比1g：100ml混合均匀，溶解，得到混合液A；

②混合液B的制备：将浓度为10％的NaOH溶液与95％乙醇按照体积比4∶1混合，得到混合液B；

③所述混合液A按照体积比5∶100逐滴加入到混合液B中，4℃条件下静置8-12h，再将6％的戊二醛与混合液B按照体积比3.5：100，将戊二醛滴加至混合液B中，搅拌后再静置2-4h，抽滤并用水洗至偏中性，得到交联的壳聚糖-戊二醛载体，将所述壳聚糖-戊二醛载体加入复合酶液中，所述复合酶液中的复合酶与壳聚糖质量比为0.01：1，所述复合酶组成为：果胶酶：纤维素酶质量比1：2.5，振荡均匀后，4℃固定12-15h，用蒸馏水洗去未固定的酶，再抽干即得固定化复合酶。

游离酶经壳聚糖固定化后，固定化果胶酶活为62356U/g，固定化纤维素酶活为99450U/g。

实施例2发酵菌剂的制备

(1)嗜热乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李乳糖杆菌菌液制备

将所述嗜热乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李乳糖杆菌经活化后按照接种量1.5％分别接种至MRS液体培养基中，37℃分别静置培养：鼠李乳糖杆菌12h,植物乳杆菌8h，嗜热乳杆菌10h时，各自达到对数生长期，将发酵液经离心，用生理盐水重悬浮离心菌体，得到的嗜热乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李乳糖杆菌的菌悬液；

所述嗜热乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李乳糖杆菌的菌悬液的活菌个数分别为1.69×10⁹CFU/mL、1.22×10⁹CFU/mL、1.33×10¹⁰CFU/mL。

其中，离心条件为：7000-8000rpm，15-20min。

其中，MRS液体培养基的配方为：蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母膏5g，无水乙酸钠5g，柠檬酸钠5g，磷酸氢二钾5g，吐温1mL，四水合硫酸锰0.25g,七水合硫酸镁0.58g，葡萄糖20g,加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH为6.2-6.8，分装后121℃高压灭菌15-20min。

(2)酵母菌以及醋酸菌菌液的制备

将酵母菌以及醋酸菌按照接种量1％的活化好的分别接种至YPD液体培养基以及醋酸菌培养基中，在26℃静止培养22h达到对数生长期后，将发酵液经离心，用生理盐水重悬浮离心菌体，得到的酵母菌以及醋酸菌的菌悬液活菌个数分别为0.93×10⁹CFU/mL和0.89×10⁸CFU/mL。

其中，所述离心条件为：7000-8000rpm，15-20min。

其中，醋酸菌培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，余量为水，121℃灭菌15min。待培养基冷却至50℃时，加入2g经165℃干热灭菌30min的碳酸钙和3mL无水乙醇。

实施例3一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备

(1)枸杞汁的制备：将黑枸杞和红枸杞按照质量比为3：7混合，经浸泡后加水混合打浆，得到枸杞混合浆；其中混合后的枸杞与水质量比为1：6-7。

(2)过滤、酶解：将所述枸杞混合浆经过滤，得到滤液；将固定化复合酶加入所述滤液中，进行超声酶解，控制温度50℃-55℃，超声酶解时间65min-70min，超声功率为200-300W，得到枸杞酶解液；所述固定化复合酶用量为20g/L，其中固定化酶为实施例1所制备的固定化酶。

(3)杀菌：将所述枸杞酶解液经巴氏杀菌2-3h后，立即冷却，得到枸杞清液；

(4)初步发酵：将嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳糖杆菌菌液按照体积比1：(1-2)：(1-2)混合，并按照总接种量2％-2.5％接种于所述枸杞清液中，控制发酵温度30℃-35℃，发酵时间40h，得到枸杞初步发酵液；其中嗜热乳杆菌、植物乳杆菌以及鼠李乳糖杆菌菌液由实施例2制备获得。

(5)二次发酵：将酵母菌与醋酸菌菌液按照体积比1：1组合，并以接种量1％-1.5％接种于所述枸杞初步发酵液中，控制发酵温度28℃，发酵时间均为12h，得到二次发酵液，其中酵母菌与醋酸菌菌液由实施3制备获得。

(6)调配、离心、巴氏杀菌、灌装：将所述步骤(6)得到的二次发酵液经调配、离心、杀菌、灌装后得到饮料成品。

实施例4一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备(参照图1)

一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法，具体步骤如下：

(1)枸杞汁的制备：将黑枸杞和红枸杞按照质量比为4：6混合，经清洗、浸泡后加水混合打浆，得到枸杞混合浆；其中，混合后的枸杞与水质量比为1：7，浸泡温度为65℃，浸泡时间为2h。

(2)过滤、酶解：经过滤，得到滤液；将固定化复合酶加入所述滤液中，进行超声酶解，控制温度50℃，超声酶解时间70min，超声功率为150W，得到枸杞酶解液；所述固定化复合酶用量为20g/L，其中固定化酶为实施例1所制备的固定化酶。

(3)杀菌：将所述枸杞酶解液经巴氏杀菌2h后，立即冷却，得到枸杞清液；

(4)初步发酵：将嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳糖杆菌菌液按照体积比1：1：1混合，并按照总接种量2％接种于所述枸杞清液中，控制发酵温度30℃，发酵时间均为40h，得到枸杞初步发酵液；其中嗜热乳杆菌、植物乳杆菌以及鼠李乳糖杆菌菌液由实施例3制备获得。

(5)二次发酵：将酵母菌与醋酸菌菌液按照体积比1：1组合，并以接种量1％接种于所述枸杞初步发酵液中，控制发酵温度28℃，发酵时间均为12h，得到二次发酵液；其中酵母菌与醋酸菌菌液由实施2制备获得。

(6)调配：调配具体为：调配具体为：向所述二次发酵液中加入1％的白砂糖，使口感更加细腻，无不良异味。

(7)离心：用离心机离去不稳定的沉淀使色泽均一，离心转速为8000rpm，离心时间是10-15min；

(8)巴氏杀菌：杀菌温度70℃，时间2h，杀菌后立刻冷却至10℃。

(9)灌装：将杀菌后的饮料在10-15℃条件下冷却,灌装即为饮料成品。

其中，步骤(1)中，所述黑枸杞与红枸杞均为无斑点、无病害、无腐烂、无霉变质的枸杞。

其中，步骤(2)中，所述过滤具体为利用纱布过滤所述枸杞混合浆。

其中，所述步骤(4)中，在此工艺条件下发酵枸杞饮料具有较好的品质，此发酵过程产生愉悦的醇香，所述枸杞初步发酵液的pH为3-3.72。

实施例5一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备

与实施例4不同之处在于：

(1)枸杞汁的制备：将黑枸杞和红枸杞按照质量比为3：6混合，混合后的枸杞与水质量比为1：7，浸泡温度为63℃，浸泡时间为3h。

(2)过滤、酶解：经过滤，超声酶解温度52℃，超声酶解时间66min，超声功率为300W；所述固定化复合酶用量为22g/L；

(4)初步发酵：将嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳糖杆菌菌液按照体积比1：1.5：1.5混合，控制发酵温度32℃，发酵时间42h；

(5)二次发酵：将酵母菌与醋酸菌菌液按照体积比1.5：1组合，发酵时间16h；

(7)离心：离心转速为9000rpm，离心时间是10min；

实施例6一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备

与实施例4不同之处在于：

(1)枸杞汁的制备：将黑枸杞和红枸杞按照质量比为5：8混合，混合后的枸杞与水质量比为1：6，浸泡温度为60℃，浸泡时间为3h。

(2)过滤、酶解：经过滤，超声酶解温度55℃，超声酶解时间65min，超声功率为100W；固定化复合酶用量为25g/L；

(3)杀菌：巴氏杀菌3h；

(4)初步发酵：将嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳糖杆菌菌液按照体积比1：2：2混合，并按照总接种量2.5％接种于所述枸杞清液中，控制发酵温度35℃，发酵时间43h；

(5)二次发酵：将酵母菌与醋酸菌菌液按照体积比2：1组合，并以接种量1.5％接种于所述枸杞初步发酵液中，控制发酵温度26℃，发酵时间13h；

(6)调配：调配具体为：调配具体为：向所述二次发酵液中加入1.5％的白砂糖，使口感更加细腻，无不良异味。

(7)离心：离心转10000rpm，离心时间是10min；

(8)巴氏杀菌：杀菌温度75℃，时间2.5h，杀菌后立刻冷却至15℃。

实施例7初步发酵中菌种不同配比

对本发明不同菌剂组合发酵得到的枸杞饮料进行测定，从总酸以及感官评定来评价枸杞饮料的品质。具体分组如下：

对照组：(未发酵组)，按照本发明实施例4步骤(1)至(3)得到的枸杞液；

实验组：按照本发明实施例4步骤(1)至(4)的制备方法制备得到的枸杞初步发酵液，唯一不同的菌剂组成不同，具体分组为：

A组：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳杆菌比例：1：1：1；

B组：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳杆菌比例：1：2：1；

C组：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳杆菌比例：1：1：2；

D组：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳杆菌比例：2：1：3；

E组：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳杆菌比例：1：2：3；

F组：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳杆菌比例：2：1：1；

G组：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳杆菌比例：3：2：1

测定方法：

(1)总酸

总酸测定参照GB/T 123456-2008中测定,利用氢氧化钠滴定,测试结果以乳酸计％。

(2)感官评价：邀请不同年龄阶段的人共100人，对产品进行感官评定，主要从①口感协调、醇厚爽口，②酸味突出、是否有异味，③颜色光泽度，④香气浓郁协调，果香浓郁，⑤独特风味五个维度进行评分，每个维度满分20分，感官评定总分为100分进行打分。

经测定，对照组总酸<0.1％，感官评定总分为52分。而本发明制备的枸杞液总酸含量均在0.1％以上，感官评定均高于对照组(参照附图2、3)。

本发明得到的总酸含量均高于对照组，总酸含量高说明嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳杆菌比例发酵性能较好，三菌株产生共生作用，使三菌株在发酵过程中，可以相互提供营养物质，使产酸速度得到很大的提升。

其中，结合发酵总酸含量以及感官评定，A、B、C组在总酸含量以及感官评定中的技术效果更优于D、E、F、G组，说明A、B、C组的菌剂比例产生了更好的共生作用，并且结合显著的感官评价，可以看出菌种复配产生了更为显著的风味物质。

实施例8固定化复合酶和游离复合酶对理化指标的影响

通过不同方式添加复合酶，对枸杞汁进行酶解处理，通过理化指标的测定，比较不同酶添加方式对于枸杞释放活性物质含量的影响。将实验分为两组，分别为：

实验组：按照本发明实施例4步骤(1)至(3)制备的枸杞酶解液，其中固定化复合酶用量为20g/L，其中果胶酶：纤维素酶质量比1：2.5。(固定化酶制备方法同实施例1)

对照组：同样按照实施例4步骤(1)至(3)制备的枸杞酶解液，唯一不同的是酶的添加方式不同，所用复合酶为游离复合酶，游离复合酶用量同样为20g/L，复合酶组成同样为果胶酶：纤维素酶质量比1：2.5。

固定化酶的酶活力：固定化果胶酶活为62356U/g，固定化纤维素酶活为99450U/g。

游离酶的酶活力：果胶酶10万U/g，纤维素酶10万U/g。

表1固定化复合酶和游离复合酶对理化指标的影响

由表1可以看出，本发明制备的固定化酶能酶解出枸杞液中更多的活性成分，更有益于人体的消化吸收。

需要说明的是，本发明实施例3、5-6制备获得的中间产物：枸杞酶解液同样具有与本发明实施例4相近的技术效果。

实施例9初步发酵中发酵菌剂在理化指标中的差异性对比

通过在枸杞汁初步发酵中添加不同组合的菌剂，来比较不同菌剂对于枸杞汁中产生的挥发性物质含量以及种类的影响，以下分组分别为：

实验组：按照本发明实施例4步骤(1)至(4)制备得到的枸杞初步发酵液；

对照组1-7制备方法同实施例4步骤(1)至(4)，唯一不同的是：

对照组1：步骤(4)不加发酵菌剂，但仍然控制同样的发酵温度、发酵时间；

对照组2：步骤(4)菌剂组成仅为植物乳杆菌；

对照组3：步骤(4)菌剂组成仅为嗜热乳杆菌；

对照组4：步骤(4)菌剂组成仅为鼠李乳糖杆菌；

对照组5：步骤(4)菌剂组成为植物乳杆菌：嗜热乳杆菌＝1：1；

对照组6：步骤(4)菌剂组成为植物乳杆菌：鼠李乳糖杆菌＝1：1；

对照组7：步骤(4)菌剂组成为嗜热乳杆菌：嗜热乳杆菌＝1：1。

表2初步发酵中发酵菌剂在理化指标中的差异性对比

结合对比表2，经测定，实验组制备得到的枸杞初步发酵液，相较于对照组5，产生了新的挥发性物质，分别是具有风味特性的一种酮类物质(2-十三酮)、一种酯类物质和一种醛类物质(β-环柠檬醛)。

此外，特别需要特别说明的是，其中上述具有风味特性的酮类物质和醛类物质并未在对照组1-7任何一组中产生(注：对照组1-7的发酵条件对于菌剂发酵都是较适合的发酵条件)，即单一菌以及其中两种菌剂的两两组合均未发酵产生上述风味物质，而仅在实验组中，在三种菌剂复配发酵中产生。

此外，多出的酮类物质即2-十三酮是具有显著特性的风味物质成分，其感官特征丰富，具有果香、甜香、蜡香、皂香、青香及椰子、奶油的气味，可有效提高枸杞汁的风味。

实验组较照组6多了一种酯类物质和一种杂烷烃类物质()；其中该杂烷烃类风味物质同样并未在对照组1-7任何一组中产生，该物质对于枸杞汁的风味均有显著的提高作用。

实验组较照组7多了一种酮类物质。

需要说明的是，本发明实施例3、5-6制备获得的中间产物：枸杞初步发酵液在获得的挥发性物质种类以及含量上同样具有与本发明实施例4相近的技术效果。

此外，需要说明的是，上述挥发性物质以及表中所罗列出的挥发性物质的含量均在国家食品安全标准所要求挥发性物质含量的范围内。

实施例10二次发酵中菌剂对于发酵产品的影响

通过在枸杞汁二次发酵中添加不同组合的菌剂，来比较二次发酵不同菌剂组合对于枸杞汁的感官评价的影响，以下分组分别为：

实验组：利用本发明实施例4步骤(1)至(5)获得的枸杞二次发酵液，其中酵母菌：醋酸菌为1：1；

对照组1：利用本发明实施例4步骤(1)至(5)获得的枸杞二次发酵液，唯一不同的是，发酵菌剂仅为酵母菌(即酵母菌：醋酸菌为1：0)；

对照组2：利用本发明实施例4步骤(1)至(5)获得的二次发酵液，唯一不同的是，发酵菌剂仅为醋酸菌(即酵母菌：醋酸菌为0：1)。

测定方法：

(1)感官评价：邀请不同年龄阶段的人共100人，对产品进行感官评定，主要从①口感协调、醇厚爽口，②酸味突出、是否有异味，③颜色光泽度，透明无悬浮物④香气浓郁协调，果香浓郁，⑤独特风味五个维度进行评分，每个维度满分10分。

低pH值可抑制腐败菌和致病菌的繁殖进而降低细菌毒素的产生，但是综合QDA直观雷达图的风味感官特性，酸度过高会降低消费者对产品的接受度，酸度过低口感不乐观。参照附图4和5，本发明中，在二次发酵中选择酵母菌：醋酸菌比为1：1，进行的发酵，无论是在口感协调醇厚、风味独特、果香浓郁、香气浓郁协调亦或是颜色光泽、透明无悬浮物等评判角度，均获得了显著的技术效果，技术效果均优于对照组。

需要说明的是，本发明实施例3、5-6制备获得的中间产物，在获得的感官评价上同样具有与本发明实施例4相近的技术效果。

实施例11枸杞汁发酵前后参数测定

对发酵前后枸杞汁的总酸，pH，植物水性蛋白质，总酚，类胡萝卜素，挥发性香气成分进行测试，对比枸杞汁发酵前后的营养物质差别，分组分别为：

实验组：本发明实施例4步骤(1)至(9)制备的枸杞发酵汁；

对照组：本发明实施例4步骤(1)-(3)、(6)-(9)制备得到的枸杞饮料。

1)测试方法如下：

1.总酸

总酸测定参照GB/T 123456-2008中测定,利用氢氧化钠滴定,测试结果以乳酸计％。

2.pH

取20mL试样,搅拌均匀后用pH计进行测定三次取平均值。

3.总酚、植物水性蛋白质、类胡萝卜素的测定

分别采用福林酚法、考马斯亮蓝、紫外分光度计法。

4.挥发性香气物质的测定

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法。

5.大肠杆菌的检测

大肠菌群的测定：参照GB 4789.3-2010。

2)实验结果：

表3枸杞汁营养物质对比

(1)总酸(参照表3)：食品中的总酸度是指食品中所有酸性物质的总量,包括已离解的酸浓度和未离解的酸浓度，采用标准碱液来滴定，并以样品中主要代表酸的百分含量表示。酸度反映了食品质量指标。易是食品品质的重要构成形状之一，更是食品品质的重要因素。本发明经益生菌发酵后，其总酸含量达2.83％，显著高于发酵前枸杞汁酸度，说明发酵效果明显，产酸能力好，由于发酵过程中分解利用饮料的单糖、多糖等碳水化合物，产生柠檬酸、乙酸等，这些有机酸既提高饮料中的营养物质，又影响饮料的风味的形成，还具有一定的抑菌效果，对发酵饮料的生产有重要的影响。

(2)pH(参照表3)：

由于发酵生产过程中pH控制很重要，它不仅可以抑制菌种的活性，而且会影响饮品质构、风味和产品的货架寿命。

(3)总酚、植物水性蛋白质、类胡萝卜素的测定(参照表3)：

枸杞中主要的化学成分如枸杞糖类、氨基酸、黄酮及类胡萝卜素等有大量的药理作用，营养物质非常高。而通过本发明混合菌剂发酵生产的枸杞汁，使得其有效成分显著提高。

(4)挥发性物质(参照附图6和表4)：本饮品总检出6种醇类，主要有苯乙醇、3-壬烯-1-醇(Z)和5-甲基-1-己醇等，1种酚类：4-乙基苯酚，7种烷烃类，主要有八甲基环四硅氧烷、环烷基硅氧烷十八、环己硅氧烷等，2种酸类分别是乙酸和正辛酸，8种酯类挥发性香气化合物，主要有辛酸乙酯、乙酸异戊酯、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇单异丁酸酯、十三烷酸乙酯等，且无论是种类还是含量均显著高于对照组未发酵的枸杞汁，对于枸杞汁风味物质、口感的提高具有显著的影响。

利用本发明方法制备的枸杞汁中，产品检出6种醇类，1种酚类，7种烷烃类，2种酸类，8种酯类挥发性香气化合物，对于提高枸杞汁的风味和口感均具有显著的作用。

表4枸杞汁挥发性风味物质对比

需要说明的是，本发明枸杞汁中各挥发性物质均为微量，总挥发性物质总量较低。

(5)大肠杆菌检测

实验组未检出大肠杆菌。而对照组未发酵的枸杞汁中检出大肠杆菌1.98LgCFU/g。由此可以看出，本发明发酵制备的枸杞汁具有一定的抑菌效果，即抑制腐败菌和致病菌的繁殖，对发酵饮料的生产有重要的影响。

需要说明的是，本发明实施例3、5-6制备获得的枸杞饮料，在获得本实施例枸杞汁发酵前后参数测定的技术效果上与本发明实施例4相近的技术效果。

Claims (10)

1.一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)枸杞汁的制备：将黑枸杞和红枸杞按照质量比为3-5：6-8混合，经浸泡后加水混合打浆，得到枸杞混合浆；

(2)过滤、酶解：将所述枸杞混合浆过滤、添加20g/L-25g/L的固定化复合酶进行超声酶解，得到枸杞酶解液；所述固定化复合酶中酶组成为：果胶酶：纤维素酶质量比1：2-3混合；

(3)杀菌：所述枸杞酶解液经杀菌、冷却得到枸杞清液；

(4)初步发酵：将嗜热乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李乳糖杆菌菌液按照体积比1-3：1-2：1-3混合，并按照总接种量2％-4％接种于所述枸杞清液中，控制发酵温度30℃-35℃，发酵时间40h-45h，得到枸杞初步发酵液；

(5)二次发酵：将酵母菌与醋酸菌菌液按照体积比1-2：1组合，并以接种量1％-3％接种于所述枸杞初步发酵液中，控制发酵温度26-28℃，发酵时间12-24h，得到二次发酵液；

(6)所述步骤(5)得到的二次发酵液经调配、离心、杀菌、灌装后得到饮料成品。

2.如权利要求1所述一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述枸杞与水质量比为1：6-7；所述浸泡具体为用水浸泡，浸泡温度为60℃-65℃，浸泡时间为2-3h。

3.如权利要求1所述一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，固定化复合酶的制备步骤为：

①混合液A的制备：将壳聚糖与浓度为1％-1.5％的冰醋酸溶液按照质量体积比0.5-1.5g：100ml混合均匀，溶解，得到混合液A；

②混合液B的制备：将浓度为5％-15％的NaOH溶液与95％乙醇按照体积比3-5：1混合，得到混合液B；

③所述混合液A与混合液B按照体积比4-8∶100，将混合液A逐滴加入到混合液B中，4℃条件下静置8-12h，再将戊二醛与混合液B按照体积比2-5:100滴加至混合液B中，经搅拌后再静置2-4h，抽滤并水洗至偏中性，得到交联的壳聚糖-戊二醛载体，将所述壳聚糖-戊二醛载体加入复合酶液中，所述复合酶液中的复合酶与壳聚糖质量比为0.01-0.015：1，振荡均匀后，4℃固定12-15h，水洗，抽干即得固定化复合酶；所述戊二醛的浓度为5％-10％；所述复合酶组成为：果胶酶：纤维素酶质量比1：2-3混合。

4.如权利要求1所述一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述超声酶解温度50℃-55℃，超声酶解时间65min-70min；所述超声功率为100W-500W。

5.如权利要求1所述一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述嗜热乳杆菌：植物乳杆菌：鼠李乳糖杆菌菌液按照体积比1：1-2：1-2混合。

6.如权利要求1所述一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述嗜热乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李乳糖杆菌菌液制备步骤为：将所述嗜热乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李乳糖杆菌经活化后按照接种量1-3％分别接种至MRS液体培养基中，30-37℃分别静置培养12-18h、8-12h、10-14h，将发酵液经离心，稀释菌体，得到菌液。

7.如权利要求1所述一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，所述酵母菌以及醋酸菌菌液的制备步骤为：将所述酵母菌以及醋酸菌经活化后按照接种量1％-1.5％分别接种至YPD液体培养基以及醋酸菌培养基中，在26-30℃静止培养22-24h，将发酵液经离心，稀释菌体，得到菌液。

8.如权利要求1所述一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中，调配具体为：向所述二次发酵液中加入1％-1.5％的白砂糖。

9.如权利要求1所述一种黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)以及步骤(6)中，所述杀菌具体为：杀菌温度为70℃-75℃，时间为2-3h。

10.由权利要求1-9任一所述黑、红枸杞复合发酵饮料的制备方法制备获得的黑、红枸杞复合发酵饮料。