具体实施方式
除非有相反陈述,在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
术语“立体异构体”表示由于至少一个不对称中心形成的异构体。在具有一个或多个 (例如一个、两个、三个或四个)不对称中心的化合物中,其可产生外消旋体、外消旋混合物、内消旋体、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单独的非对映异构体。特定个别分子也可以几何异构体(顺式/反式)存在。
术语“溶剂合物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂物理结合的化合物形式。此物理结合包含氢键结合。常规溶剂包含水、乙醇、甲醇、乙酸等。式(II)化合物可以结晶形式制备且可呈溶剂合物形式(例如水合形式)。适宜溶剂合物包含药学可接受的溶剂合物(例如水合物),且进一步包含化学计量溶剂合物及非化学计量溶剂合物。在某些情形下,例如当一个或多个溶剂分子纳入结晶固体的晶格中时,溶剂合物将能够解离。“溶剂合物”涵盖溶液相及可解离溶剂合物。代表性溶剂合物包含水合物、乙醇合物及甲醇合物等。
术语“前药”是指通过与酶、胃酸等在生理条件下在活体内例如通过各自在酶催化下进行的氧化、还原、水解等反应转化为本发明化合物的衍生物。
术语“代谢物”是指在细胞或有机体优选人中源自本发明任意化合物的所有分子。
术语“同位素衍生物”是指构成化合物的一或多个原子处,以非天然比例含有同位素的所述的化合物。例如氘(2H或D)、氚(3H或T)、碳-13(13C)、氮-15(15N)、氧- 18(18O)等。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本发明所述化合物或其生理学/药学上可接受的盐或前体药物与其他化学组分的混合物,其他组分例如生理学/药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药,利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
所述载体包括药学领域所有的可用于制成注射和非注射给药途径的药物制剂,例如稀释剂、润湿剂、填充剂、粘合剂、湿滑剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、阻滞剂、吸附剂、助悬剂、絮凝剂、反絮凝剂、乳化剂、常用基质、增溶剂、助溶剂、潜溶剂、防腐剂、矫味剂、着色剂、抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂、等渗调节剂、pH调节剂、金属离子络合剂、硬化剂、增稠剂等。
实施例
以下结合实施例用于进一步描述本发明,但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂,为市场购买的常规试剂。
本发明中的缩写具有以下含义:
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR化学位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6),氘代氯仿(CDCl3),氘代甲醇(CD3OD),内标为四甲基硅烷(TMS)。
反应的监测采用薄层色谱法(TLC)或LC-MS。
薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板,薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm~0.2mm,薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4 mm~0.5mm。
柱层析一般使用烟台黄海硅胶200~300目或300~400目硅胶。
使用的展开剂体系有:石油醚和乙酸乙酯体系、正己烷和乙酸乙酯体系、二氯甲烷和甲醇体系。溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。
纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括:石油醚和乙酸乙酯体系、正己烷和乙酸乙酯体系、二氯甲烷和甲醇体系。溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节,也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。
在以下实施例中,如无特殊说明,反应的温度为室温(20℃~30℃)。
中间体制备方法实施例:
一、中间体(反式)-3-(2-溴乙酰基)-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯I-1的制备
第一步(反式)-2-戊烯酸乙酯I-1b的制备
在反应瓶中加入(反式)-2-戊烯酸I-1a(20.0g,0.20mol),碘乙烷(62.4g,0.40mol),碳酸钾(20.4g,0.15mol),18-冠-6(11.6g,0.044mol)和无水四氢呋喃(400mL),然后在70℃下搅拌6小时。TLC监测反应完成,反应液冷却,过滤,滤液在25℃浓缩后过柱纯化(v/v,石油醚/乙酸乙酯=100:1-50:1)得到标题化合物I-1b(20.0g,0.156mol),收率为78%。LCMS(ESI)m/z:129[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):7.06-6.99(m, 1H),5.84-5.79(m,1H),4.21-4.16(m,2H),2.25-2.21(m,2H),1.31-1.27(t,J=7.6Hz,3H), 1.09-1.05(t,J=7.6Hz,3H)。
第二步(反式)-1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸乙酯I-1c的制备
在反应瓶中加入二氯甲烷(260mL),然后分别加入化合物(反式)-2-戊烯酸乙酯I-1b (13.0g,100mmol)和N-(甲氧甲基)-N-(三甲基硅甲基)苄胺(28.4g,120mmol),降温至0℃,缓慢滴加三氟乙酸(1.14g,10mmol)的二氯甲烷溶液(3mL),然后在冰水浴下搅拌2小时,TLC监测反应完成,将体系用旋转蒸发仪减压浓缩、干燥,过柱纯化 (v/v,石油醚/乙酸乙酯=50:1-5:1)得到标题化合物I-1c(13.3g,51mmol),收率为51%。 LCMS(ESI)m/z:262[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):7.34-7.28(m,5H), 4.16-4.11(m,2H),3.67-3.54(m,2H),2.84-2.73(m,3H),2.62-2.56(m,1H),2.38-2.33(m,1 H),2.29-2.25(m,1H),1.59-1.54(m,1H),1.46-1.41(m,1H),1.26-1.23(t,J=7.2Hz,3H), 0.91-0.87(t,J=7.2Hz,3H).
第三步(反式)-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸乙酯I-1d的制备
在反应瓶中加入化合物(反式)-1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸乙酯I-1c(15.0g,57.5 mmol),湿钯-碳(1.5g),甲酸铵(21.7g,345mmol)并加入乙醇(150mL)溶解,然后在80℃下搅拌1小时,TLC监测反应完成。反应液冷却至室温,过滤,滤液浓缩得到标题化合物I-1d(9.0g,52.6mmol),收率为91.6%。LCMS(ESI)m/z:172[M+H]+。
第四步(反式)-1-苄氧基羰基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸乙酯I-1e的制备
在反应瓶中加入化合物(反式)-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸乙酯I-1d(9.0g,52.6mmol),碳酸钠(11.1g,105mmol)溶于二氧六环(180mL)和水(90mL)中,冷却到0℃,加入氯甲酸苄酯(13.5g,78.9mmol),室温下搅拌3小时,LCMS监测反应完成,将体系倒入水中,用乙酸乙酯萃取,有机相进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱纯化(v/v,石油醚/乙酸乙酯=10:1-6:1)得到标题化合物I-1e(15.0g,49.2mmol),收率为93.8%。LCMS(ESI)m/z:306[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):7.38-7.26(m, 5H),5.13(s,2H),4.19-4.13(m,2H),3.81-3.69(m,2H),3.61-3.54(m,1H),3.09-3.02(m,1 H),2.72-2.67(m,1H),2.40-2.32(m,1H),1.67-1.61(m,1H),1.40-1.31(m,1H),1.28-1.25(t,J =7.2Hz,3H),0.95-0.90(m,3H).
第五步(反式)-1-苄氧基羰基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸I-1f的制备
在反应瓶中加入化合物(反式)-1-苄氧基羰基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸乙酯I-1e(15.0g, 49.2mmol)和乙醇(150mL),冷却到0℃,加入氢氧化钠水溶液(49.2mL,2mol/L), 0℃下搅拌2小时,TLC监测反应完成,用2mol/L盐酸调pH=3,用乙酸乙酯萃取三次,有机相进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱纯化(v/v,石油醚/乙酸乙酯=20:1-3:1)得到标题化合物I-1f(10g,36.1mmol),收率为73.5%。LCMS(ESI)m/z:278 [M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3,δppm):7.36-7.31(m,5H),5.14(s,2H),3.83-3.70(m,2 H),3.67-3.60(m,1H),3.13-3.05(m,1H),2.77-2.73(m,1H),2.42-2.38(m,1H),1.71-1.66(m, 1H),1.39-1.36(m,1H),0.97-0.92(m,1H).
第六步(反式)-1-苄氧基羰基-4-乙基-吡咯烷-3-酰基氯I-1g的制备
在反应瓶中加入(反式)-1-苄氧基羰基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸I-1f(3.00g,10.8mmol),二氯甲烷(60mL),冷却到0℃,加入草酰氯(2.79g,21.6mmol),0℃搅拌2小时,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品标题化合物I-1g(3.19g,10.8mmol)。
第七步(反式)-3-(2-溴乙酰基)-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯I-1的制备
在反应瓶中加入化合物(反式)-1-苄氧基羰基-4-乙基-吡咯烷-3-酰基氯I-1g(3.00g,10.8 mmol)并用四氢呋喃(30mL)和乙腈(30mL)溶解,冷却到0℃,缓慢滴加三甲基硅基重氮甲烷(16.2mL,2mol/L),室温搅拌2小时,再冷却到0℃,缓慢滴加氢溴酸水溶液(21.9g,108mmol)。室温搅拌4小时,TLC监测反应完成,将体系倒入水中,用乙酸乙酯萃取三次,有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗,水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱纯化(v/v,石油醚/乙酸乙酯=20:1-6:1)得到标题化合物I-1(1.5g,4.25mmol),收率为39.4%。LCMS(ESI)m/z:354[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):7.37-7.31 (m,5H),5.13(s,2H),3.95-3.89(m,2H),3.82-3.78(m,1H),3.48-3.44(m,2H),3.28-3.22(m, 1H),3.14-3.09(m,1H),2.46-2.41(m,1H),1.54-1.51(m,1H),1.41-1.34(m,1H),0.95-0.91(t, J=7.6Hz,3H).
二、中间体(顺式)-3-(2-溴乙酰基)-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯I-2的制备
第一步(顺式)-2-戊烯酸乙酯I-2b的制备
在反应瓶中加入化合物2-戊炔酸乙酯I-2a(130g,1.03mol)和无水四氢呋喃(1.3L),然后加入喹啉(13mL)和林德拉催化剂(13.0g),体系在氢气球保护下搅拌5小时。TLC 监测反应完成,将体系用硅藻土过滤,滤液用旋转蒸发仪减压干燥(10-15℃)得粗品,然后过柱纯化(石油醚),得到标题化合物I-2b(70g,0.55mol),收率为53%。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):6.21-6.16(m,1H),5.75-5.71(m,1H),4.19-4.14(m,2H),2.67-2.63(m,2H),1.30-1.26(t,J=7.2Hz,3H),1.07-1.03(t,J=7.6Hz,3H)。
第二步(顺式)-1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸乙酯I-2c的制备
在反应瓶中加入二氯甲烷(1.4L),然后分别加入化合物(顺式)-2-戊烯酸乙酯I-2b(70.0 g,0.54mol)和N-(甲氧甲基)-N-(三甲基硅甲基)苄胺(130g,0.54mol),降温至0℃,缓慢滴加三氟乙酸(6.20g,0.054mol),然后在冰水浴下搅拌2小时,TLC监测反应完成。将体系用旋转蒸发仪减压浓缩、干燥,过柱纯化(v/v,石油醚/乙酸乙酯=50:1-5:1),得到标题化合物I-2c(70.0g,0.27mol),收率为49%。LCMS(ESI)m/z:262[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):7.35-7.28(m,5H),4.16-4.10(m,2H),3.65(s,2H),3.12-3.02(m,3H),2.70-2.64(m,,1H),2.40-2.35(m,1H),2.11-2.06(t,J=9.2Hz,1H),1.49-1.43(m,1H),1.29-1.23(m,1H),1.28-1.24(t,J=6.8Hz,3H),0.87-0.84(t,J=7.6Hz,3H)。
第三步(顺式)-1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸I-2d的制备
将化合物(顺式)-1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸乙酯I-2c(70.0g,0.27mol)溶于1,4- 二氧六环(700mL),然后加入浓盐酸(700mL),然后在90℃下搅拌16小时,LCMS 监测反应完成。在冰水浴下,用6mol/L的氢氧化钠溶液调节体系的pH=9,然后用乙酸乙酯萃取(700mL x 2)。将水相用2mol/L的盐酸调节pH=7,然后用旋转蒸发仪减压干燥得粗品。将粗品用乙醇(200mL)打浆,过滤,滤液用旋转蒸发仪减压干燥得标题化合物 I-2d(35.0g,0.15mol),收率为56%。LCMS(ESI)m/z:234[M+H]+。1H NMR(400MHz, CDCl3,δppm):7.60-7.58(m,2H),7.39-7.37(m,3H),4.43-4.34(m,2H),3.66-3.62(m,1H), 3.49-3.42(m,2H),3.26-3.22(m,1H),3.02-2.97(m,1H),2.62-2.55(m,1H),1.63-1.56(m,1 H),1.41-1.34(m,1H),0.94-0.90(t,J=7.2,3H)。
第四步(顺式)-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸I-2e的制备
在氢化瓶中加入化合物(顺式)-1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸I-2d(10.0g,42.9mmol),甲醇(100mL)和Pd/C(5.00g),于50psi氢气压力下室温搅拌6小时,TLC监测反应完成。将体系用硅藻土过滤,滤液用旋转蒸发仪减压浓缩、干燥,得到标题化合物I-2e(7.50g,52.4mmol),收率为92.6%。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):3.62-3.57(m,1H), 3.50-3.45(m,1H),3.37(s,1H),3.18-3.09(m,2H),2.48-2.46(m,1H),1.65-1.59(m,1H), 1.49-1.42(m,1H),1.07-1.03(t,J=7.2Hz,2H).
第五步(顺式)-1-苄氧基羰基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸I-2f的制备
在反应瓶中加入化合物(顺式)-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸I-2e(7.50g,52.4mmol),二氧六环(150mL),水(150mL)和碳酸钠(11.1g,105mmol),冷却到0℃,加入苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺(14.3g,57.6mmol),室温下搅拌过夜,TLC监测反应完成,用2mol/L 盐酸调pH=1,用乙酸乙酯萃取三次,有机相进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱纯化(v/v,石油醚/乙酸乙酯=20:1-5:1)得到标题化合物I-2f(8.00g,28.9mmol),收率为54.5%。LCMS(ESI)m/z:278[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):7.36-7.31 (m,5H),5.19-5.10(m,2H),3.83-3.83(m,1H),3.66-3.53(m,2H),3.33-3.23(m,1H), 3.15-3.08(m,1H),2.40-2.33(m,1H),1.57-1.50(m,1H),1.43-1.36(m,1H),1.00-0.94(m,3 H)。
第六步(顺式)-1-苄氧基羰基-4-乙基-吡咯烷-3-酰基氯I-2g的制备
在反应瓶中加入化合物(顺式)-1-苄氧基羰基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸I-2f(4.00g,14.4 mmol),二氯甲烷(40mL),冷却到0℃,加入草酰氯(3.71g,28.8mmol),0℃搅拌2小时,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品标题化合物I-2g(4.25g,14.4mmol)。
第七步(顺式)-3-(2-溴乙酰基)-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯I-2的制备
在反应瓶中加入化合物(顺式)-1-苄氧基羰基-4-乙基-吡咯烷-3-酰基氯I-2g(4.25g,14.4 mmol)并用四氢呋喃(40mL)和乙腈(40mL)溶解,冷却到0℃,缓慢滴加三甲基硅烷重氮甲烷(25.2mL,2mol/L),室温搅拌2小时,再冷却到0℃,缓慢滴加氢溴酸水溶液(29.2 g,144mmol)。室温搅拌4小时,TLC监测反应完成,将体系倒入水中,用乙酸乙酯萃取三次,有机相进行饱和碳酸氢钠洗,水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱纯化(v/v,石油醚/乙酸乙酯=20:1-6:1)得到标题化合物I-2(2.5g,7.08mmol),收率为49%。LCMS(ESI)m/z:354[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):7.36-7.31(m, 5H),5.18-5.09(m,2H),3.95-3.87(m,2H),3.73-3.67(m,1H),3.65-3.52(m,3H),3.43-3.33 (m,1H),2.43-2.40(m,1H),1.43-1.25(m,2H),0.97-0.92(m,3H)。
三、中间体(反式)-3-氨基-4-乙基-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺I-3的制备
第一步(反式)-1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸I-3a的制备
在反应瓶中加入化合物(反式)-1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸乙酯I-1c(300g,1.15mol) 并加入甲醇(2L)溶解,冰水浴下缓慢滴加氢氧化钠溶液(1.15L,2mol/L),然后在室温下搅拌10小时,TLC监测反应完成。将体系使用旋转蒸发仪浓缩,去除多余甲醇,用水和二氯甲烷萃取,取水相用盐酸溶液(0.767L,3mol/L)低温缓慢调pH=6,然后浓缩除水得粗品,再加入无水乙醇搅拌,过滤,滤液浓缩得到标题化合物I-3a(200g,0.86mol),收率为74.9%。LCMS(ESI)m/z:234[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):7.33-7.23 (m,5H),3.72-3.63(q,J=13.2Hz,2H),2.85-2.75(m,3H),2.57-2.52(m,1H),2.30-2.20(m,2 H),1.51-1.46(m,1H),1.38-1.31(m,1H),0.82-0.78(t,J=7.6Hz,3H)。
第二步(反式)-(1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯I-3b的制备
在反应瓶中加入叔丁醇(500mL),然后分别加入化合物(反式)-1-苄基-4-乙基-吡咯烷 -3-甲酸I-3a(50.0g,215mmol),三乙胺(43.3g,430mmol)和叠氮磷酸二苯酯(76.7g,279.5mmol),室温下搅拌1小时,然后回流反应16小时。LCMS监测反应完成。将体系用旋转蒸发仪减压浓缩、干燥,用乙酸乙酯和水萃取,有机相进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱纯化(v/v,PE/EA=50:1-15:1)得到标题化合物I-3b(10.0g, 32.9mol),收率为15.3%。LCMS(ESI)m/z:305[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm): 7.33-7.22(m,5H),4.90-4.88(d,J=7.6Hz,1H),3.76(s,1H),3.55(s,2H),3.02-2.98(t,J= 8.4Hz,1H),2.64-2.62(m,1H),2.57-2.53(m,1H),1.91-1.86(t,J=8.4Hz,1H),1.80-1.73(m, 1H),1.60-1.55(m,1H),1.43(s,9H),0.91-0.87(t,J=7.2Hz,2H)。
第三步(反式)-(4-乙基-吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯I-3c的制备
在氢化瓶中加入化合物(反式)-(1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯I-3b(40.0g, 132mmol),甲醇(400mL)和Pd/C(40.0g),50psi氢气压力下于室温搅拌3小时,TLC 监测反应完成。将体系用硅藻土过滤,滤液用旋转蒸发仪减压浓缩、干燥,得到标题化合物I-3c(20.0g,93.5mmol),收率为71.2%。LCMS(ESI)m/z:215[M+H]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3,δppm):4.69(s,1H),3.70(s,1H),3.21-3.14(m,2H),2.76-2.72(m,1H), 2.55-2.51(m,1H),1.74-1.67(m,1H),1.62-1.55(m,1H),1.44(s,9H),1.39-1.26(m,2H), 0.96-0.92(t,J=7.2Hz,3H)。
第四步(反式)-{4-乙基-1-[(2,2,2-三氟乙基)氨基甲酰基]吡咯烷-3-基}氨基甲酸叔丁酯 I-3d的制备
在反应瓶中加入二氯甲烷(20mL),三乙胺(1.89g,18.7mmol)和三氟乙胺(0.97 g,9.35mmol),然后在0℃加入三光气(1.11g,3.70mmol),保持0℃搅拌2小时,然后0℃加入化合物(反式)-(4-乙基-吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯I-3c(2.00g,9.35mmol),缓慢恢复至室温搅拌6小时,TLC监测反应完成。将体系倒入水中,用二氯甲烷萃取,有机相进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱纯化(v/v,PE/EA=20:1-5:1) 得到标题化合物I-3d(1.00g,2.95mmol),收率为31.6%。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ ppm):5.40(s,1H),4.56-4.50(m,2H),3.94-3.83(m,5H),3.80-3.76(m,1H),3.69-3.65(t,J= 8.4Hz,1H),3.13-3.05(m,2H),1.95-1.93(m,1H),1.67-1.62(m,1H),1.45(s,9H),1.38-1.30 (m,1H),0.98-0.95(t,J=8.4Hz,3H)。
第五步(反式)-3-氨基-4-乙基-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺I-3的制备
在反应瓶中加入化合物(反式)-{4-乙基-1-[(2,2,2-三氟乙基)氨基甲酰基]吡咯烷-3-基}氨基甲酸叔丁酯I-3d(1.00g,2.95mmol)并用甲醇(10mL)溶解,缓慢滴加盐酸甲醇(5mL, 4mol/L),室温搅拌2小时,TLC监测反应完成。将体系浓缩并用氢氧化钠溶液(2mol/L) 调节pH=9,用旋转蒸发仪减压浓缩、干燥,用无水乙醇打浆过滤,滤液用旋转蒸发仪减压浓缩、干燥,得到标题化合物I-3(0.50g,2.09mmol),收率为70.9%。LCMS(ESI)m/z: 240[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):6.86-6.83(t,J=6.4Hz,1H),4.01(br s,3 H),3.83-3.76(m,1H),3.59-3.54(m,1H),3.14-3.09(m,1H),3.04-3.01(m,1H),2.94-2.90(m,1H),1.82(s,1H),1.65-1.63(m,1H),1.19-1.15(m,1H),0.90-0.87(t,J=7.6Hz,3H)。
四、中间体(顺式)-3-氨基-4-乙基-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺I-4的制备
第一步(顺式)-(1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯I-4a的制备
将化合物(顺式)-1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸I-2d(2.00g,8.58mmol),三乙胺(1.73 g,17.2mmol)和叠氮磷酸二苯酯(3.54g,12.9mmol)加入叔丁醇(20mL)中,然后氮气保护下于室温搅拌2小时,然后于90℃反应16小时,TLC监测反应完成。将体系用旋转蒸发仪减压浓缩、干燥,用乙酸乙酯和水萃取,有机相进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱纯化(v/v,石油醚/乙酸乙酯=50:1-10:1)得到标题化合物I-4a(0.55 g,1.81mmol),收率为20%。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):7.33-7.23(m,5H),4.81-4.78 (m,1H),4.23-4.21(m,1H),3.66-3.55(m,2H),2.82-2.78(m,1H),2.67-2.63(t,J=9.2Hz,1H),2.46-2.43(m,1H),2.32-2.29(m,1H),2.19-2.14(m,1H),1.48-1.43(m,1H),1.44(s,9H), 1.28-1.18(m,1H),0.89-0.85(t,J=7.2Hz,3H)。
第二步(顺式)-(4-乙基-吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯I-4b的制备
在氢化瓶中加入化合物(顺式)-(1-苄基-4-乙基-吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯I-4a(10.0g, 32.9mmol),甲醇(100mL)和Pd/C(10.0g),于50psi氢气压力下室温搅拌6小时, TLC监测反应完成。将体系用硅藻土过滤,滤液用旋转蒸发仪减压浓缩、干燥,得到标题化合物I-4b(6.00g,28.0mmol),收率为85%。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):4.82(br s,1H),4.16(br s,1H),3.21-3.14(m,2H),2.80-2.77(m,1H),2.55-2.49(t,J=10.0Hz,1H),2.32-2.26(m,1H),2.05-2.01(m,1H),1.51-1.45(m,1H),1.44(s,9H),1.31-1.24(m,1H),0.95-0.92(t,J=7.2Hz,3H)。
第三步(顺式)-{4-乙基-1-[(2,2,2-三氟乙基)氨基甲酰基]吡咯烷-3-基}氨基甲酸叔丁酯 I-4c的制备
在反应瓶中加入二氯甲烷(60mL),三乙胺(5.67g,56.1mmol)和三氟乙胺(2.78 g,28.0mmol),然后在0℃加入三光气(3.32g,11.2mmol),保持0℃搅拌2小时,然后0℃加入化合物(顺式)-(4-乙基-吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯I-4b(6.00g,28.0mmol),缓慢恢复至室温搅拌6小时,TLC监测反应完成。将体系倒入水中,用二氯甲烷萃取,有机相进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱纯化(v/v,石油醚/乙酸乙酯=30:1-2:1)得到标题化合物I-4c(2.50g,7.37mmol),收率为26%。LCMS(ESI)m/z:362 [M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):7.11-7.09(d,J=8.8Hz,1H),6.73-6.70(t,J= 6.4Hz,1H),4.04(br s,1H),3.82-3.73(m,2H),3.41-3.36(m,2H),3.20-3.17(d,J=10.8Hz,1 H),3.10-3.05(t,J=10.0Hz,1H),2.10(br s,1H),1.38(s,9H),1.36-1.34(m,1H),1.30-1.23 (m,1H),0.87-0.83(t,J=7.2Hz,3H)。
第四步(顺式)-3-氨基-4-乙基-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺I-4的制备
在0℃将化合物(顺式)-{4-乙基-1-[(2,2,2-三氟乙基)氨基甲酰基]吡咯烷-3-基}氨基甲酸叔丁酯I-4c(2.50g,7.37mmol)溶于盐酸甲醇(25mL,4.8mol/L),室温搅拌2小时, TLC监测反应完成。将体系浓缩,然后加入水,并用氢氧化钠溶液(2mol/L)调节pH=9,用乙酸乙酯萃取,有机相用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压浓缩、干燥,得标题化合物I-4(1.5g,6.20mmol),收率为85%。LCMS(ESI)m/z:240[M+H]+。1H NMR(400MHz, DMSO-d6,δppm):4.52(br s,1H),3.98-3.85(m,2H),3.55-3.50(m,3H),3.32-3.30(m,1H), 3.15-3.10(t,J=9.6Hz,1H),2.12-2.07(m,1H),1.57-1.41(m,2H),1.25(br s,2H),1.00-0.96 (t,J=7.2Hz,3H)。
终产物制备方法实施例:
实施例1
(反式)-3-(3H-双咪唑并[1,2-a:4',5'-e]吡嗪-8-基)-4-乙基-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺H01的制备
第一步5-溴-2,3-二氨基吡嗪1b的制备
将化合物3,5-二溴-2-氨基吡嗪1a(20.0g,106mmol)加入到氨水(100mL)中,反应液110℃反应过夜,LCMS监测反应完全。将反应体系倒入水(300mL)中,用乙酸乙酯萃取(500mLx2),合并有机相进行饱和食盐水(200mL)洗,无水硫酸钠干燥,浓缩。粗品过柱(v/v,石油醚/乙酸乙酯=30:1-2:1)纯化得到标题化合物1b(9.0g,47.8mmol),收率为60%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):7.19(s,1H),6.39(br s,2H),6.08(br s,2 H)。
第二步5-溴-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪1c的制备
将化合物5-溴-2,3-二氨基吡嗪1b(12.0g,63.8mmol)加入到原甲酸三乙酯(94.4g, 638mmol)中,反应液145℃反应过夜。TLC监测反应完全,冷却后浓缩过柱(v/v,二氯甲烷/甲醇=100:1-30:1)纯化得到标题化合物1c(10.0g,50.5mmol),收率为79.4%。1HNMR (400MHz,DMSO-d6,δppm):13.78(br s,1H),8.83(s,1H),8.59(s,1H)。
第三步5-溴-1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪1d的制备
将化合物5-溴-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪1c(9.00g,45.2mmol)加入到水(90mL)和四氢呋喃(180mL)中,加入碳酸钾(15.6g,113mmol),0℃下加入对甲苯磺酰氯(9.00g,47.5mmol),室温下反应过夜,TLC监测反应完成。将反应体系倒入水(300mL)中,用乙酸乙酯萃取(200mLx3),有机相合并后进行饱和食盐水(100mL)洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱(v/v,二氯甲烷/甲醇=50:1-30:1)纯化得到标题化合物1d(6.00g,30.3mmol),收率为37.5%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):9.33-9.31(d,J=11.2Hz,1H), 8.82-8.74(m,1H),8.12-8.10(d,J=8.0Hz,2H),7.56-7.51(m,2H),2.41-2.40(m,3H)。
第四步(1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-5-基)氨基甲酸叔丁酯1e的制备
将化合物5-溴-1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪1d(4.00g,11.3mmol)加入到甲苯(40mL)中,然后分别加入氨基甲酸叔丁酯(2.00g,17.0mmol),Pd2(dba)3(1.30 g,1.13mmol)、Xantphos(1.30g,2.26mmol)和碳酸钾(3.10g,22.6mmol),反应液于100℃反应10小时,TLC监测反应完成。体系降到室温加入水(100mL),用乙酸乙酯萃取(100mLx3),有机相合并后用饱和食盐水(100mL)洗,浓缩后过柱(v/v,石油醚 /乙酸乙酯=30:1-2:1)纯化得到标题化合物1e(2.00g,5.14mmol),收率为45%。LCMS(ESI) m/z:390[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):9.32-9.21(d,J=44.0Hz,1H),8.66-8.58 (d,J=30.0Hz,1H),8.14-8.12(d,J=8.4Hz,1H),8.07-8.05(d,J=8.4Hz,1H),7.38-7.23(m, 3H),2.44-2.42(m,3H),1.57-1.54(m,9H)。
第五步(反式)-3-[N-叔丁氧基羰基-N-(1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯1f的制备
将化合物(1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-5-基)氨基甲酸叔丁酯1e(0.30g, 0.77mmol)加入DMF(5mL),然后加入碳酸钾(0.271g,1.54mmol),0℃下加入化合物(反式)-3-(2-溴乙酰基)-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯I-1(0.27g,0.77mmol),室温搅拌2小时,TLC监测反应完成。向反应体系中加入水(50mL),用乙酸乙酯萃取(100mLx3),有机相合并后进行水(100mL)洗,饱和食盐水(100mL)洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱(v/v,石油醚/乙酸乙酯=30:1-3:1)纯化得到标题化合物1f(0.3g,0.45mmol),收率为58.8%。LCMS(ESI)m/z:663[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):9.12(br s,1H), 8.62-8.54(m,1H),8.12-8.09(d,J=8.4Hz,1H),7.91-7.87(m,1H),7.35-7.29(m,7H), 5.13-5.11(m,2H),4.85-4.82(m,2H),3.75-3.71(m,3H),3.13-3.10(m,2H),2.42-2.38(m,4 H),1.75-1.67(m,1H),1.51-1.50(m,9H),1.43-1.38(m,1H),0.95-0.90(m,3H)。
第六步(反式)-3-乙基-4-[(1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-吡咯烷-1-甲酸苄酯1g的制备
将化合物(反式)-3-[N-叔丁氧基羰基-N-(1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯1f(0.50g,0.75mmol)溶于二氯甲烷中,加入三氟乙酸(0.86g,7.5mmol),反应体系室温搅拌2小时,冰水浴下用饱和碳酸钠溶液将pH调到8,用二氯甲烷萃取(100mLx3),有机相合并,饱和食盐水(50mL)洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后得到粗品标题化合物1g(400mg,0.71mmol),收率为95%。LCMS(ESI) m/z:563[M+H]+。
第七步(反式)-3-乙基-4-(3-对甲苯磺酰基-3H-双咪唑并[1,2-a:4',5'-e]吡嗪-8-基)吡咯烷 -1-甲酸苄酯1h的制备
将化合物(反式)-3-乙基-4-[(1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-吡咯烷-1-甲酸苄酯1g(400mg,0.71mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)中,加入劳森试剂 (280mg,0.71mmol),然后在85℃下搅拌2小时。加入水(50mL),用乙酸乙酯萃取(50mLx3),有机相合并,饱和食盐水(50mL)洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱子纯化(v/v,石油醚/乙酸乙酯=30:1-1:1)得到标题化合物1h(120mg,0.22mmol),收率为 31%。LCMS(ESI)m/z:545[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):8.86(s,1H),8.35(s, 1H),8.21-8.19(d,J=7.2Hz,2H),7.58(s,1H),7.40-7.33(m,7H),5.23-5.16(m,2H), 4.76-4.72(m,1H),3.94-3.87(m,1H),3.84-3.73(m,2H),3.42-3.32(m,1H),2.68-2.66(m,1 H),2.43(s,3H),1.22-1.14(m,1H),0.95-0.91(m,1H),0.75-0.70(m,3H)。
第八步(反式)-8-(4-乙基吡咯烷-3-基)-3H-双咪唑并[1,2-a:4',5'-e]吡嗪1i的制备
将化合物(反式)-3-乙基-4-(3-对甲苯磺酰基-3H-双咪唑并[1,2-a:4',5'-e]吡嗪-8-基)吡咯烷 -1-甲酸苄酯1h(120mg,0.22mmol)溶于氢溴酸醋酸溶液(2mL)中,室温搅拌1小时。 LCMS监测反应完成,将反应液用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品标题化合物1i(120mg), 直接用于下一步反应。LCMS(ESI)m/z:257[M+H]+。
第九步(反式)-3-(3H-双咪唑并[1,2-a:4',5'-e]吡嗪-8-基)-4-乙基-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺的制备
将三氟乙胺(93mg,0.94mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中,加入三乙胺(237mg,2.30mmol),0℃下加入三光气(138mg,0.47mmol),0℃下搅拌2小时,加入化合物(反式)-8-(4-乙基吡咯烷-3-基)-3H-双咪唑并[1,2-a:4',5'-e]吡嗪1i(120mg,0.47mmol),室温下搅拌6小时,LCMS监测反应完成,在体系中加入水(50mL),用二氯甲烷萃取(50mLx3),有机相合并,饱和食盐水(50mL)洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后制备TLC纯化(v/v,二氯甲烷/甲醇=8:1)得到标题化合物H01(5.4mg,0.01mmol),两步收率为6.4%。LCMS(ESI) m/z:382[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):13.74(s,1H),8.73(s,1H),8.30(s,1 H),7.81(s,1H),6.88-6.86(m,1H),4.20-4.18(m,1H),4.09-4.05(m,1H),3.84-3.76(m,3H), 3.39-3.35(m,1H),3.16-3.11(t,J=9.6Hz,1H),2.68-2.67(m,1H),1.57-1.55(m,1H), 1.40-1.38(m,1H),0.88-0.84(t,J=7.2Hz,3H)。
实施例2
(顺式)-3-(3H-双咪唑并[1,2-a:4',5'-e]吡嗪-8-基)-4-乙基-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺H02的制备
第一步(顺式)-3-[N-叔丁氧基羰基-N-(1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯2a的制备
将化合物(1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-5-基)氨基甲酸叔丁酯1e(3.00g, 7.71mmol)加入DMF(30mL),然后加入碳酸钾(2.1g,15.4mmol),0℃下加入化合物(顺式)-3-(2-溴乙酰基)-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯I-2(2.7g,7.7mmol),室温搅拌4小时,TLC监测反应完成。向反应体系中加入水(100mL),用乙酸乙酯萃取(100mLx3),有机相合并后进行水(100mL)洗,饱和食盐水(100mL)洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱纯化(v/v,石油醚/乙酸乙酯=30:1-2:1)得到标题化合物2a(1.3g,1.96mmol),收率为25%。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):9.11(br s,1H),8.62-8.53(m,1H),8.12-8.09(d, J=8.4Hz,1H),7.92-7.87(m,1H),7.36-7.27(m,7H),5.13-5.07(m,2H),4.88-4.77(m,2H), 3.75-3.71(m,1H),3.65-3.52(m,2H),3.46-3.42(m,1H),3.37-3.29(m,1H),2.51-2.43(m,1 H),2.42-2.37(m,3H),1.53-1.50(m,10H),1.46-1.33(m,1H),1.00-0.93(m,3H)。
第二步(顺式)-3-乙基-4-[(1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-吡咯烷-1-甲酸苄酯2b的制备
将化合物(顺式)-3-[N-叔丁氧基羰基-N-(1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯2a(1.3g,1.96mmol)溶于二氯甲烷中,加入三氟乙酸 (2.2g,19.6mmol),反应体系室温搅拌2小时,冰水浴下用饱和碳酸钠溶液将pH调到9,用乙酸乙酯萃取(200mLx3),有机相合并,饱和食盐水(100mL)洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后得到粗品标题化合物2b(800mg,1.42mmol),收率为72.7%。
第三步(顺式)-3-乙基-4-(3-对甲苯磺酰基-3H-双咪唑并[1,2-a:4',5'-e]吡嗪-8-基)吡咯烷 -1-甲酸苄酯2c的制备
将化合物(顺式)-3-乙基-4-[(1-对甲苯磺酰基-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-吡咯烷-1-甲酸苄酯2b(800mg,1.42mmol)溶于1,4-二氧六环(8mL)中,加入劳森试剂 (575mg,1.42mmol),然后在85℃下搅拌4小时。加入水(50mL),用乙酸乙酯萃取(100mLx3),有机相合并,饱和食盐水(100mL)洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后制备TLC 纯化(v/v,二氯甲烷/甲醇=10:1)得到标题化合物2c(200mg,0.36mmol),收率为25.8%。 LCMS(ESI)m/z:545[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):8.85(s,1H),8.35(s,1H), 8.21-8.19(d,J=7.2Hz,2H),7.58(s,1H),7.40-7.33(m,7H),5.22-5.16(m,2H),4.76-4.72(m, 1H),3.94-3.87(m,1H),3.84-3.73(m,2H),3.42-3.32(m,1H),2.68-2.66(m,1H),2.43(s,3 H),1.22-1.14(m,1H),0.95-0.91(m,1H),0.75-0.70(m,3H)。
第四步(顺式)-8-(4-乙基吡咯烷-3-基)-3H-双咪唑并[1,2-a:4',5'-e]吡嗪2d的制备
将化合物(顺式)-3-乙基-4-(3-对甲苯磺酰基-3H-双咪唑并[1,2-a:4',5'-e]吡嗪-8-基)吡咯烷 -1-甲酸苄酯2c(220mg,0.40mmol)溶于氢溴酸醋酸溶液(2mL)中,室温搅拌1小时。 LCMS监测反应完成,将反应液用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品标题化合物2d(400mg)。 LCMS(ESI)m/z:257[M+H]+。
第五步(顺式)-3-(3H-双咪唑并[1,2-a:4',5'-e]吡嗪-8-基)-4-乙基-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺H02的制备
将三氟乙胺(80mg,0.81mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中,加入三乙胺(410mg,4.06mmol),0℃下加入三光气(120mg,0.40mmol),0℃下搅拌2小时,加入化合物(顺式)-8-(4-乙基吡咯烷-3-基)-3H-双咪唑并[1,2-a:4',5'-e]吡嗪2d(104mg,0.40mmol),室温下搅拌6小时,LCMS监测反应完成,在体系中加入水(50mL),用二氯甲烷萃取(100mLx3),有机相合并,饱和食盐水(50mL)洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后制备TLC纯化(v/v,二氯甲烷/甲醇=8:1)得到标题化合物H02(28mg,0.06mmol),两步收率为18.1%。LCMS(ESI) m/z:382[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):13.73(s,1H),8.72(s,1H),8.28(s,1 H),7.48(s,1H),6.97-6.94(m,1H),4.79-4.78(m,1H),3.88-3.71(m,4H),3.62-3.58(m,1H), 3.26-3.22(m,1H),2.72-2.67(m,1H),1.17-1.13(m,1H),0.80-0.78(m,1H),0.67-0.64(t,J= 7.2Hz,3H)。
实施例3
(反式)-3-乙基-4-(3H-咪唑并[1,2-a]吡唑并[3,4-e]吡嗪-8-基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷 -1-甲酰胺H03的制备
第一步3,6-二溴吡嗪-2-甲酸甲酯3b的制备
将化合物3-氨基-6-溴吡嗪-2-甲酸甲酯3a(20.0g,86.2mmol)加入到500mL三口烧瓶中,加入二氧六环(40mL),HBr(200mL)和乙酸(40mL),搅拌溶解。-5℃向反应体系中滴加入NaNO2(19.6g,285mmol)在乙酸(20mL)中的溶液,在-5℃搅拌4小时。将体系倒入到Na2SO3溶液中,乙酸乙酯萃取。有机相水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥,过柱纯化得到标题化合物3b(12.0g,40.8mmol),收率为47.3%。LCMS(ESI)m/z:295[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):8.58(s,1H), 4.03(s,3H)。
第二步3,6-二溴吡嗪-2-甲醛3c的制备
将化合物3,6-二溴吡嗪-2-甲酸甲酯3b(12.0g,40.8mmol)溶于四氢呋喃(120mL),N2置换3次,干冰丙酮降温至-70℃,滴加DIBAL-H溶液(81.6mL,122.4mmol),在-70℃下反应1小时。向体系中加1M盐酸淬灭,加入乙酸乙酯,搅拌20min。过滤,滤液分液,水相用乙酸乙酯萃取。合并有机相,用饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得标题化合物3c(8.0g,30.3mmol),收率为74.3%。LCMS(ESI)m/z:266[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):10.18(s,1H),8.65(s,1H)。
第三步5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪3d的制备
将化合物3,6-二溴吡嗪-2-甲醛3c(8.0g,30.3mmol)溶于异丙醇(200mL)。加入N2H4.H2O(7.1g,151.5mmol),加热至110℃闷罐反应过夜。将体系降至室温,加入水和乙酸乙酯,搅拌后分液,水相用乙酸乙酯(20mL)萃取一次,合并有机相,用饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得标题化合物3d(3.0g,15.2mmol),收率为50.2%。LCMS(ESI)m/z:200[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):8.73(s, 1H),8.46(s,1H)。
第四步5-溴-1-对甲苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪3e的制备
将化合物5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪3d(3.0g,15.2mmol)溶于四氢呋喃(60mL)。加入对甲苯磺酰氯(2.9g,15.2mmol)和碳酸钾(5.2g,38.0mmol)水溶液(30mL),室温搅拌过夜。向体系中加水和乙酸乙酯,搅拌后分液,水相用乙酸乙酯萃取一次,合并有机相,用饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥,过柱纯化得到标题化合物3e(2.5g,7.1mmol),收率为46.7%。LCMS(ESI)m/z:354[M+H]+。1H NMR (400MHz,DMSO-d6,δppm):8.98(s,1H),8.86(s,1H),7.92-7.90(m,2H),7.46-7.44(m,2H), 2.36(s,3H).
第五步(1-对甲苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪-5-基)氨基甲酸叔丁酯3f的制备
将化合物5-溴-1-对甲苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪3e(2.5g,7.1mmol)溶于甲苯 (25mL),依次加入氨基甲酸叔丁酯(1.2g,10.7mmol),碳酸钾(2.0g,14.2mmol), Pd2(dba)3(350mg)和Xantphos(825mg),N2置换3次,加热回流6h。体系降至室温,加水和乙酸乙酯,搅拌后分液,水相用乙酸乙酯萃取一次,合并有机相,用饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥,过柱纯化得到标题化合物3f(1.4g,3.6 mmol),收率为50.7%。LCMS(ESI)m/z:390[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm): 9.43(s,1H),8.21(s,1H),8.04-8.02(m,2H),7.29-7.27(m,2H),2.38(s,3H),1.55(s,9H).
第六步(反式)-3-[N-叔丁氧基羰基-N-(1-对甲苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯3g的制备
将化合物(1-对甲苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪-5-基)氨基甲酸叔丁酯3f(1.4g, 3.6mmol)溶于DMF(30mL)中降温至0℃,加入化合物(反式)-3-(2-溴乙酰基)-4-乙基- 吡咯烷-1-甲酸苄酯I-1(1.9g,5.4mmol)和碳酸钾(1.5g,10.8mmol)。室温反应2小时。加水和乙酸乙酯,搅拌后分液,水相用乙酸乙酯萃取一次,合并有机相,用饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥,过柱纯化得到标题化合物3g(1.6g,2.4mmol),收率为66.7%。LCMS(ESI)m/z:563[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm): 9.25(s,1H),8.20(s,0.5H),8.07(s,0.5H),8.02-8.00(m,2H),7.35-7.27(m,7H),5.12-5.11(m,2H),4.76-4.74(m,2H),3.84-3.56(m,3H),3.49-3.48(m,4H),3.12-2.97(m,2H), 2.49-2.48(m,1H),2.38(s,3H),1.57(s,9H),1.54-1.52(m,1H),0.97-0.95(m,3H).
第七步(反式)-3-[(1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-4-乙基吡咯烷-1-甲酸苄酯3h 的制备
将化合物(反式)-3-[N-叔丁氧基羰基-N-(1-对甲苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯3g(1.6g,2.4mmol)溶于乙酸乙酯(16mL),滴加 HCl甲醇溶液(16mL),室温搅拌反应0.5小时。将体系用旋转蒸发仪减压干燥,溶于水中,用饱和Na2CO3调pH为9,乙酸乙酯萃取,有机相用饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品标题化合物3h(1.2g)。
第八步(反式)-3-乙基-4-(3H-咪唑并[1,2-a]吡唑并[3,4-e]吡嗪-8-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯 3i的制备
将化合物(反式)-3-[(1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-4-乙基吡咯烷-1-甲酸苄酯3h (1.2g)溶于二氧六环(20.0mL),加入劳森试剂(1.0g,2.4mmol),85℃搅拌2小时。向体系中加水和乙酸乙酯,搅拌后分液,水相用乙酸乙酯萃取一次,合并有机相,用饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥,制备TLC纯化得到标题化合物3i(650.0mg,1.7mmol),收率为70.8%。LCMS(ESI)m/z:391[M+H]+。1H NMR(400MHz, CDCl3,δppm):11.16(s,1H),8.89(s,1H),8.17-8.16(m,1H),7.66(s,1H),7.52-7.29(m,5H), 5.19-5.16(m,2H),4.18-3.87(m,2H),3.65-3.49(m,2H),3.36-3.29(m,1H),2.57-2.56(m,1 H),1.71-1.66(m,1H),1.49-1.42(m,1H),0.97-0.94(m,3H).
第九步(反式)-8-(4-乙基吡咯烷-3-基)-3H-咪唑并[1,2-a]吡唑并[3,4-e]吡嗪3j的制备
将化合物(反式)-3-乙基-4-(3H-咪唑并[1,2-a]吡唑并[3,4-e]吡嗪-8-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯 3i(650.0mg,1.7mmol)溶于HBr的醋酸溶液(20mL),室温搅拌2小时。将反应体系用旋转蒸发仪减压干燥,得到粗品标题化合物3j(600mg)。
第十步(反式)-3-乙基-4-(3H-咪唑并[1,2-a]吡唑并[3,4-e]吡嗪-8-基)-N-(2,2,2-三氟乙基) 吡咯烷-1-甲酰胺H03的制备
将化合物三氟乙胺(167mg,1.7mmol)溶于二氯甲烷(50mL),在0℃下加入三乙胺(310mg,3.1mmol)和三光气(182mg,0.6mmol),反应体系在0℃搅拌1小时。将化合物(反式)-8-(4-乙基吡咯烷-3-基)-3H-咪唑并[1,2-a]吡唑并[3,4-e]吡嗪3j(600mg)加入到反应体系中0℃搅拌1小时。反应液水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥,制备HPLC得到标题化合物H03(15.0mg,0.04mmol),收率为2.3%。 LCMS(ESI)m/z:382[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):14.12(s,1H),8.83(s,1 H),8.69(s,1H),7.77(s,1H),6.90-6.87(m,1H),4.01-3.97(m,1H),3.89-3.75(m,4H), 3.36-3.32(m,1H),3.20-3.15(m,2H),1.51-1.40(m,2H),0.85-0.83(m,3H).
实施例4
(顺式)-3-乙基-4-(3H-咪唑并[1,2-a]吡唑并[3,4-e]吡嗪-8-基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷 -1-甲酰胺H04的制备
第一步(顺式)-3-[N-叔丁氧基羰基-N-(1-对甲苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯4a的制备
将化合物(1-对甲苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪-5-基)氨基甲酸叔丁酯3f(2.8g, 7.2mmol)溶于DMF(30mL)中,加入碳酸钾(2.0g,14.4mmol),0℃下加入化合物 (顺式)-3-(2-溴乙酰基)-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯I-2(2.5g,7.2mmol)。反应液室温反应 2小时。加入水(100mL),用乙酸乙酯(200mL x 3)萃取,合并有机相,用水(100mL) 洗,再用饱和食盐水(200mL)洗,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥。粗品过柱子纯化(v/v,石油醚/乙酸乙酯=30:1-2:1)得到标题化合物4a(1.4g,2.11mmol),收率为29.4%。LCMS(ESI)m/z:663[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):9.24(s,1H), 8.21-8.06(d,J=60Hz,1H),8.02-8.00(d,J=8.0Hz,2H),7.35-7.27(m,7H),5.15-5.03(m,2 H),4.83-4.68(m,2H),3.89-3.53(m,4H),3.43-3.28(m,2H),2.42-2.40(m,1H),2.38(s,3H), 1.57-1.55(m,1H),1.52-1.51(m,9H),1.43-1.35(m,1H),1.00-0.95(m,3H).
第二步(顺式)-3-[(1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-4-乙基吡咯烷-1-甲酸苄酯4b 的制备
将化合物(顺式)-3-[N-叔丁氧基羰基-N-(1-对甲苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-4-乙基-吡咯烷-1-甲酸苄酯4a(1.4g,2.11mmol)溶于乙酸乙酯(10mL)中,加入HCl甲醇溶液(10mL),室温搅拌反应0.5小时。将体系用旋转蒸发仪减压干燥,用饱和碳酸钠溶液将pH调到9,乙酸乙酯(200mL x 3)萃取,合并有机相,用饱和食盐水(100 mL)洗,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品标题化合物4b(1.0g,2.45mmol)。
第三步(顺式)-3-乙基-4-(3H-咪唑并[1,2-a]吡唑并[3,4-e]吡嗪-8-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯 4c的制备
将化合物(顺式)-3-[(1H-吡唑并[3,4-b]吡嗪-5-基)甘氨酰基]-4-乙基吡咯烷-1-甲酸苄酯4b (1.0g,2.45mmol)溶于二氧六环(10mL)中,加入劳森试剂(1.0g,2.45mmol),反应液氮气保护下85℃搅拌1小时。向体系中加入水(100mL),用乙酸乙酯萃取(100mL x3),合并有机相,用饱和食盐水(100mL)洗,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥。粗品用制备TLC纯化(v/v,二氯甲烷/甲醇=10:1)得到标题化合物4c(200mg,0.51mmol),收率为24.4%。LCMS(ESI)m/z:391[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):8.93(s,1H), 8.19(s,1H),7.60(s,1H),7.42-7.32(m,5H),5.23-5.16(m,2H),4.11-4.06(m,1H),4.01-3.78 (m,3H),3.48-3.40(m,1H),2.64-2.62(m,1H),1.25-1.21(m,1H),0.98-0.93(m,1H), 0.78-0.73(m,3H).
第四步(顺式)-8-(4-乙基吡咯烷-3-基)-3H-咪唑并[1,2-a]吡唑并[3,4-e]吡嗪4d的制备
将化合物(顺式)-3-乙基-4-(3H-咪唑并[1,2-a]吡唑并[3,4-e]吡嗪-8-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯 4c(250mg,0.64mmol)溶于氢溴酸醋酸溶液(2mL)中,反应液室温搅拌1小时。将反应体系用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品标题化合物4d(300mg)。LCMS(ESI)m/z:257[M+H]+。
第五步(顺式)-3-乙基-4-(3H-咪唑并[1,2-a]吡唑并[3,4-e]吡嗪-8-基)-N-(2,2,2-三氟乙基) 吡咯烷-1-甲酰胺H04的制备
将化合物三氟乙胺(127mg,1.28mmol)和三乙胺(647mg,6.4mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中,在0℃下加入三光气(190mg,0.64mmol),反应体系在0℃下搅拌2 小时。加入化合物(顺式)-8-(4-乙基吡咯烷-3-基)-3H-咪唑并[1,2-a]吡唑并[3,4-e]吡嗪4d(164 mg,0.64mmol),反应体系室温反应6小时。加水(50mL)淬灭,用二氯甲烷(100mL x 3)萃取,合并有机相,用饱和食盐水(50mL)洗,无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥。粗品用制备TLC纯化(v/v,二氯甲烷/甲醇=8:1)得到标题化合物H04(38mg, 0.10mmol),两步收率为15.6%。LCMS(ESI)m/z:382[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6, δppm):14.17(s,1H),8.85(s,1H),8.68(brs,1H),7.51(s,1H),6.98(s,1H),4.26(s,1H), 3.86-3.68(m,5H),3.28-3.25(m,1H),2.58-2.51(m,1H),1.09-1.06(m,1H),0.89-0.84(m,1 H),0.66-0.63(t,J=6.8Hz,3H).
实施例5
(反式)-3-乙基-4-(6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪-1-基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷 -1-甲酰胺H05的制备
第一步2-氨基-3-(三甲基硅基乙炔基)-5-溴吡嗪5a的制备
向反应瓶中加入四氢呋喃(50ml),三甲基硅基乙炔(580mg,5.9mmol),三乙胺(1.2g, 11.8mmol),CuI(0.1g),Pd(PPh3)4(0.1g)和化合物3,5-二溴-2-氨基吡嗪1a(1.0g,3.95mmol),氮气保护下,室温反应3小时。TLC显示反应完毕,加入50ml水,用乙酸乙酯(30mL)萃取水相2次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,过柱子纯化得到粗品标题化合物5a(0.5g,18.5mmol),收率47.1%。LCMS (ESI)m/z:270[M+H]+。
第二步2-溴-5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪5b的制备
将化合物2-氨基-3-(三甲基硅基乙炔基)-5-溴吡嗪5a(5.0g,18.5mmol)溶于DMF(100 ml)中,0℃左右分批加入NaH(0.96g,24mmol),搅拌2小时,分批加入TsCl(4.6g,24mmol)。室温搅拌10h,TLC显示反应完毕。0℃左右加入100ml氯化铵水溶液,用乙酸乙酯(100mL) 萃取水相3次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,过柱子纯化得到标题化合物5b(2.0g,5.6mmol),收率30.7%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):8.59(s,1H),8.38(d,J=4.4Hz,1H),7.99(d,J=8.4Hz,2H),7.46(d,J=8.4Hz,2H),7.03(d,J=4.0Hz,1H),2.36(s,3H).
第三步2-氰基-5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪5c的制备
将化合物2-溴-5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪5b(4.0g,11.3mmol),氰化锌(2.4 g,22.7mmol)和Pd(PPh3)4(1.6g)溶于DMF(100ml)中,氮气保护下,110℃反应过夜。TLC 显示反应完毕,加入150ml冰水,用乙酸乙酯(100mL)萃取水相2次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,过柱子纯化得到标题化合物5c(2.0g,6.7mmol),收率58.8%。LCMS(ESI)m/z:299[M+H]+。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6,δppm):8.99(s,1H),8.58(d,J=4.0Hz,1H),8.04(d,J=8.4Hz,2H),7.47 (d,J=8.4Hz,2H),7.17(d,J=4.4Hz,1H),2.37(s,3H).
第四步(5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪-2-基)甲基胺5d的制备
将化合物2-氰基-5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪5c(5.0g,16.7mmol)溶于 MeOH(100ml)中,加入Pd-C(0.5g),50psi的氢气压力下室温搅拌2h,TLC显示反应完毕。抽滤,收集滤液,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品标题化合物5d(2.5g,8.2mmol),收率为50%,直接用于下一步反应。LCMS(ESI)m/z:303[M+H]+。
第五步(反式)-3-乙基-4-{[(5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪-2-基)甲基]氨基甲酰基}吡咯烷-1-甲酸苄酯5e的制备
向反应瓶中加入乙腈(150ml),化合物(5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪-2-基)甲基胺5d(2.4g,7.9mmol),化合物(反式)-1-苄氧基羰基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸I-1f(2.4g, 8.7mmol),HATU(4.5g,11.9mmol)和TEA(4.0g,39.6mmol),室温下搅拌过夜。TLC显示反应完毕,加入130ml水,用乙酸乙酯(100mL)萃取水相2次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,过柱子纯化得到标题化合物5e(1.5g,2.67mmol),收率33.6%。LCMS(ESI)m/z:562[M+H]+。
第六步(反式)-3-乙基-4-{[(5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪-2-基)甲基]氨基硫代甲酰基}吡咯烷-1-甲酸苄酯5f的制备
向反应瓶中加入化合物(反式)-3-乙基-4-{[(5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪-2-基) 甲基]氨基甲酰基}吡咯烷-1-甲酸苄酯5e(1.0g,1.7mmol),劳森试剂(0.72g,1.7mmol) 和1,4-二氧六环(20ml),90℃反应过夜。TLC显示反应完毕,加入50ml碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(30mL)萃取水相2次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,过柱子纯化得到标题化合物5f(1.0g,1.7mmol),收率 97.1%。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):10.76-10.74(m,1H),8.41(s,1H),8.31(d,J=4.0Hz,1H),8.00(d,J=7.6Hz,2H),7.44(d,J=7.6Hz,2H),7.37-7.31(m,5H),6.98-6.96(m,1H),5.06-5.05(m,2H),4.96-4.93(m,2H),3.68-3.53(m,4H),3.11-2.96(m,2H),2.34(s,3H), 1.47-1.42(m,1H),1.26-1.21(m,1H),0.84-0.76(m,3H).
第七步(反式)-3-乙基-4-(6-对甲苯磺酰基-6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪-1-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯5g的制备
向反应瓶中加入化合物(反式)-3-乙基-4-{[(5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪-2-基) 甲基]氨基硫代甲酰基}吡咯烷-1-甲酸苄酯5f(0.5g,0.8mmol),醋酸汞(0.19g,0.6mmol) 和THF(10mL),室温反应1小时。补加醋酸汞(0.13g,0.4mmol),继续搅拌3小时。TLC 显示反应完毕,加入20ml碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(30mL)萃取水相2次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,过柱子纯化得到标题化合物5g(0.18g,0.3mmol),收率38.3%。LCMS(ESI)m/z:544[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):8.63(s,1H),8.08-8.05(m,2H),7.82(s,1H),7.61(d,J=4.0 Hz,1H),7.38-7.29(m,7H),6.81(d,J=4.0Hz,1H),5.15-5.13(m,2H),4.04-3.91(m,2H),3.65-3.57(m,2H),3.27-3.22(m,1H),2.99-2.82(m,1H),2.38(s,3H),1.62-1.51(m,1H),1.41-1.28(m,1H),0.87(t,J=6.8Hz,3H).
第八步(反式)-1-(4-乙基吡咯烷-3-基)-6-对甲苯磺酰基-6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e] 吡嗪5h的制备
将化合物(反式)-3-乙基-4-(6-对甲苯磺酰基-6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪-1-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯5g(0.5g,0.9mmol)加入到氢溴酸醋酸溶液(10mL)中,室温下搅拌1小时。 TLC显示反应完毕,反应液用旋转蒸发仪减压干燥,加入乙酸乙酯(10mL)打浆,抽滤得到标题化合物5h(0.3g,0.7mmol),收率79.3%。LCMS(ESI)m/z:410[M+H]+。
第九步(反式)-3-乙基-4-(6-对甲苯磺酰基-6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪-1- 基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺5i的制备
将化合物三氟乙胺(48mg,0.48mmol)和三乙胺(0.24g,2.4mmol)加入到二氯甲烷(10 mL)中,0℃下加入三光气(50mg,0.17mmol)。将上述溶液在0℃下搅拌0.5小时,将化合物(反式)-1-(4-乙基吡咯烷-3-基)-6-对甲苯磺酰基-6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪5h(0.2 g,0.5mmol)加入到反应体系中。搅拌1小时,TLC显示反应完毕。加入200mL水,用二氯甲烷(30mL)萃取水相2次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,过柱纯化得到标题化合物5i(0.15g,0.28mmol),收率57.5%。1HNMR(400MHz,CDCl3,δppm):8.64(s,1H),8.07(d,J=8.4Hz,2H),7.82(s,1H),7.63(d, J=4.0Hz,1H),7.31(d,J=8.0Hz,2H),6.82(d,J=4.0Hz,1H),4.55-4.52(m,1H), 4.01-3.88(m,4H),3.68-3.61(m,2H),3.22(t,J=8.6Hz,1H),3.01-2.99(m,1H),2.39(s,3H), 1.59-1.54(m,1H),1.44-1.36(m,1H),0.89(t,J=11Hz,3H).
第十步(反式)-3-乙基-4-(6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪-1-基)-N-(2,2,2-三氟乙基) 吡咯烷-1-甲酰胺H05的制备
将化合物(反式)-3-乙基-4-(6-对甲苯磺酰基-6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪-1- 基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺5i(150mg,0.28mmol)和NaOH(56mg,1.4mmol) 加入到乙腈(10mL)中,反应体系在室温下搅拌5小时,TLC显示反应完毕。加入20mL水,用乙酸乙酯(30mL)萃取水相2次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,制备HPLC得到标题化合物H05(60mg,0.15mmol),收率56.6%。LCMS(ESI)m/z:381[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):12.14(s,1 H),8.59(s,1H),7.80(s,1H),7.25-7.24(m,1H),6.96(s,1H),6.87-6.84(m,1H),3.98-3.85 (m,2H),3.83-3.73(m,3H),3.50(t,J=8.6Hz,1H),3.17(t,J=9.4Hz,1H),2.69-2.66(m,1 H),1.47-1.41(m,2H),0.78(t,J=7.4Hz,3H).
实施例6
(顺式)-3-乙基-4-(6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪-1-基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷 -1-甲酰胺H06的制备
第一步(顺式)-3-乙基-4-{[(5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪-2-基)甲基]氨基甲酰基}吡咯烷-1-甲酸苄酯6a的制备
向反应瓶中加入乙腈(150mL),化合物(5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪-2-基)甲基胺5d(1g,3.3mmol),化合物(顺式)-1-苄氧基羰基-4-乙基-吡咯烷-3-甲酸I-2f(1g,3.6 mmol),HATU(1.9g,5.0mmol)和TEA(1.7g,16.8mmol),室温下搅拌过夜,TLC显示反应完毕。加入130mL水,用乙酸乙酯(100mL)萃取水相2次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,过柱纯化得到标题化合物 6a(1.4g,2.5mmol),收率75.7%。LCMS(ESI)m/z:562[M+H]+。
第二步(顺式)-3-乙基-4-{[(5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪-2-基)甲基]氨基硫代甲酰基}吡咯烷-1-甲酸苄酯6b的制备
向反应瓶中加入化合物(顺式)-3-乙基-4-{[(5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪-2-基) 甲基]氨基甲酰基}吡咯烷-1-甲酸苄酯6a(1.4g,2.5mmol),劳森试剂(1.0g,2.5mmol)和 1,4-二氧六环(30mL),90℃反应过夜。TLC显示反应完毕。加入50mL碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(30mL)萃取水相2次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,过柱纯化得到标题化合物6b(900mg,1.6mmol),收率62.5%。
第三步(顺式)-3-乙基-4-(6-对甲苯磺酰基-6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪-1-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯6c的制备
向反应瓶中加入化合物(顺式)-3-乙基-4-{[(5-对甲苯磺酰基-5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪-2-基) 甲基]氨基硫代甲酰基}吡咯烷-1-甲酸苄酯6b(900mg,1.6mmol),醋酸汞(347mg,1.1mmol) 和THF(20ml),室温反应1小时。补加醋酸汞(248g,0.78mmol),继续搅拌3小时。TLC 显示反应完毕,加入20mL碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(50mL)萃取水相2次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,过柱纯化得到标题化合物6c(200mg,0.37mmol),收率23.1%。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):8.63(s,1H),8.10-8.08(m,2H),7.81(s,1H),7.61(s,1H),7.38-7.26(m,7H),6.80-6.77(m,1 H),5.20-5.10(m,2H),4.19-3.06(m,2H),3.94-3.89(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.62-3.56(m, 1H),2.53-2.50(m,1H),2.39(s,3H),1.03-0.97(m,1H),0.89-0.80(m,1H),0.72-0.66(m,3 H).
第四步(顺式)-1-(4-乙基吡咯烷-3-基)-6-对甲苯磺酰基-6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e] 吡嗪6d的制备
将化合物(顺式)-3-乙基-4-(6-对甲苯磺酰基-6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪-1-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯6c(100mg,0.18mmol)加入到氢溴酸醋酸溶液(10mL)中,室温下搅拌1 小时。TLC显示反应完毕,反应液用旋转蒸发仪减压干燥,加入乙酸乙酯(10mL)打浆,抽滤得到标题化合物6d(30mg,0.07mmol),收率38.9%。
第五步(顺式)-3-乙基-4-(6-对甲苯磺酰基-6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪-1- 基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺6e的制备
将化合物三氟乙胺(7mg,0.07mmol)和TEA(37mg,0.37mmol)加入到二氯甲烷(10mL) 中,0℃下加入三光气(8mg,0.027mmol)。将上述溶液在0℃下搅拌0.5小时,将化合物(顺式)-1-(4-乙基吡咯烷-3-基)-6-对甲苯磺酰基-6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪6d(30mg, 0.07mmol)加入到反应体系中。室温搅拌1小时,TLC显示反应完毕。加入200mL水,用二氯甲烷(30mL)萃取水相3次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,过柱纯化得到标题化合物6e(35mg,0.065mmol),收率89.7%。LCMS(ESI)m/z:535[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):8.64(s,1H),8.07 (d,J=8.4Hz,2H),7.79(s,1H),7.63(d,J=4.0Hz,1H),7.32(d,J=8.0Hz,2H),7.79(d,J=4.0Hz,1H),4.62(t,J=6.4Hz,1H),4.12-4.09(m,2H),3.97-3.85(m,3H),3.72-3.59(m,2H), 2.61-2.58(m,1H),2.39(s,3H),1.11-1.05(m,2H),0.71(t,J=7.4Hz,3H).
第六步(顺式)-3-乙基-4-(6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪-1-基)-N-(2,2,2-三氟乙基) 吡咯烷-1-甲酰胺H06的制备
将化合物(顺式)-3-乙基-4-(6-对甲苯磺酰基-6H-咪唑并[1,5-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪-1- 基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺6e(70mg,0.13mmol)和NaOH(15mg,0.65mmol) 加入到乙腈(10mL)中,反应体系在室温下搅拌5小时。TLC显示反应完毕,加入20mL水,用乙酸乙酯(30mL)萃取水相2次,有机相合并,用饱和食盐水洗一次,用无水硫酸钠干燥,用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品,制备HPLC得到化合物H06(30mg,0.079mmol),收率60.7%。LCMS(ESI)m/z:381[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):12.13(s,1H), 8.59(s,1H),7.77(s,1H),7.25-7.24(m,1H),6.94(s,1H),6.89-6.86(m,1H),4.39-4.37(m,2 H),3.93-3.75(m,4H),3.66(t,J=2.4Hz,1H),3.42-3.38(m,1H),2.58-2.57(m,1H), 1.07-1.01(m,1H),0.85-0.77(m,1H),0.62(t,J=7.2Hz,3H).
实施例7
(反式)-3-乙基-4-(咪唑并[4,5-d]吡唑并[3,4-b]吡啶-1(6H)-基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷 -1-甲酰胺H07的制备
第一步4-氯-1-苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶7b的制备
在反应瓶中加入化合物4-氯-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶7a(6.00g,39.2mmol)和DMF(60 mL),冰水浴冷却,然后在0℃-5℃分批加入氢化钠(2.34g,58.8mmol,60%),体系在冰浴下搅拌30分钟,然后在0℃-5℃缓慢滴加苯磺酰氯(7.71g,43.1mmol)。将上述溶液缓慢升到室温并搅拌1小时,TLC监测反应完成。将体系倒入冰水中,用乙酸乙酯萃取三次,合并有机相进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩,过柱纯化(v/v, PE/EA=50:1-10:1)得到粗品标题化合物7b(6.00g,20.5mmol),收率为52.2%。LCMS(ESI) m/z:294[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3,δppm):8.63-8.62(d,J=5.2Hz,1H),8.28(s,1 H),8.22-8.20(d,J=7.6Hz,2H),7.64-7.60(t,J=7.6Hz,1H),7.53-7.49(t,J=8.0Hz,2H), 7.32-7.31(d,J=5.2Hz,1H)。
第二步4-氯-5-硝基-1-苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶7c的制备
在反应瓶中加入化合物四正丁基硝酸铵(9.20g,30.3mmol)和二氯甲烷(50mL),冰水浴冷却,然后在0℃缓慢滴加三氟乙酸酐(14.3g,68.1mmol),体系在冰水浴下搅拌 2小时,然后在0℃-5℃将上述硝化体系缓慢滴加到化合物4-氯-1-苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b] 吡啶7b(2.00g,6.80mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中,搅拌过夜。TLC监测表明化合物7b有大量剩余,补加相同当量的硝化体系,继续搅拌12小时。LCMS监测反应基本完成,将体系倒入冰水中,用二氯甲烷萃取二次,合并有机相进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,低温浓缩后过柱纯化(v/v,二氯甲烷/甲醇=200:1-150:1)得到粗品标题化合物7c(0.90g,2.66mmol),收率为39.1%。LCMS(ESI)m/z:339[M+H]+。1H NMR (400MHz,CDCl3,δppm):9.29(s,1H),8.44(s,1H),8.24-8.20(m,2H),7.70-7.66(t,J=7.6 Hz,1H),7.58-7.54(t,J=7.6Hz,2H)。
第三步(反式)-3-乙基-4-[(5-硝基-1-苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺7d的制备
在反应瓶中加入DMF(5mL),然后分别加入化合物4-氯-5-硝基-1-苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶7c(500mg,1.48mmol),三乙胺(298mg,2.95mmol)和(反式)-3-氨基-4-乙基-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺I-3(353mg,1.48mmol),室温下搅拌30 分钟,TLC监测反应完成。在体系中加入水(15mL),用乙酸乙酯萃取三次,有机相合并后进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱纯化(v/v,二氯甲烷/甲醇=100:1-50:1)得到标题化合物7d(400mg,0.74mmol),收率为50%。LCMS(ESI)m/z: 542[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):9.40-9.38(d,J=7.2Hz,1H),9.32(s,1H), 8.22-8.21(m,3H),7.68-7.65(t,J=7.2Hz,1H),7.57-7.53(t,J=8.0Hz,2H),4.73-4.70(t,J= 6.4Hz,1H),4.28-4.25(m,1H),4.02-3.96(m,1H),3.94-3.87(m,2H),3.79-3.74(m,1H), 3.52-3.48(m,1H),3.33-3.29(m,1H),2.39-2.34(m,1H),1.74-1.67(m,1H),1.53-1.45(m,1 H),1.05-1.02(t,J=7.2Hz,3H)。
第四步(反式)-3-[(5-氨基-1-苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氨基]-4-乙基 -N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺7e的制备
在反应瓶中加入乙醇(8mL),然后分别加入化合物(反式)-3-乙基-4-[(5-硝基-1-苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺7d(400mg,0.74 mmol),饱和氯化铵溶液(2mL)和铁粉(166mg,2.96mmol),加热到90℃搅拌1小时,TLC监测反应完成。体系降到室温过滤,滤液浓缩,用水和乙酸乙酯萃取,有机相用饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,然后用旋转蒸发仪减压干燥得到粗品标题化合物7e(300 mg,0.59mmol),收率为79.4%,直接用于下一步反应。LCMS(ESI)m/z:512[M+H]+。
第五步(反式)-3-乙基-4-(6-苯磺酰基咪唑并[4,5-d]吡唑并[3,4-b]吡啶-1(6H)- 基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺7f的制备
在反应瓶中加入无水四氢呋喃(10mL),然后分别加入化合物(反式)-3-[(5-氨基-1-苯磺酰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氨基]-4-乙基-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺7e(300 mg,0.59mmol),原甲酸三乙酯(216mg,1.46mmol)和对甲苯磺酸(36.0mg,0.21mmol),加热回流搅拌1小时,LCMS监测反应完成。反应体系缓慢倒入水中,用氢氧化钠溶液(2 mol/L)调pH=8-9,用乙酸乙酯和水萃取三次,有机相合并进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后得到标题化合物7f(250mg,0.48mmol),收率为81.4%。LCMS(ESI) m/z:522[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):9.16(s,1H),8.38-8.33(m,1H),8.24-8.22(d,J=7.6Hz,2H),8.08-8.05(m,1H),7.62-7.58(d,J=7.6Hz,1H),7.52-7.48(d,J =7.6Hz,2H),4.98-4.85(m,2H),4.20-4.15(m,1H),3.96-3.88(m,4H),3.34-3.29(m,1H), 2.73-2.67(m,1H),1.64-1.55(m,1H),1.53-1.46(m,1H),0.93-0.89(t,J=7.6Hz,3H)。
第六步(反式)-3-乙基-4-(咪唑并[4,5-d]吡唑并[3,4-b]吡啶-1(6H)-基)-N-(2,2,2-三氟乙基) 吡咯烷-1-甲酰胺H07的制备
在反应瓶中加入二氧六环(6mL),然后分别加入化合物(反式)-3-乙基-4-(6-苯磺酰基咪唑并[4,5-d]吡唑并[3,4-b]吡啶-1(6H)-基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺7f(250mg, 0.48mmol)和氢氧化钠溶液(1mL,2mol/L),反应体系室温搅拌2小时,TLC监测反应完成。反应体系用乙酸乙酯和水萃取三次,有机相合并进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后得到的粗品,用制备TLC纯化得标题化合物H07(65.0mg,0.17mmol),收率为36.9%。LCMS(ESI)m/z:382[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):13.87(s, 1H),8.88(s,1H),8.55(s,1H),8.51(s,1H),7.04-7.01(t,J=6.4Hz,1H),5.25-5.18(q,J=8.8Hz,1H),4.08-4.04(m,1H),3.90-3.81(m,3H),3.75-3.71(t,J=9.2Hz,1H),3.23-3.18(t,J= 10.0Hz,1H),2.79-2.74(m,1H),1.47-1.37(m,1H),0.76-0.73(t,J=7.6Hz,3H)。
实施例8
(顺式)-3-乙基-4-(咪唑并[4,5-d]吡唑并[3,4-b]吡啶-1(6H)-基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷 -1-甲酰胺H08的制备
采用与实施例7相同的制备方法,将实施例7中的I-3替换为I-4,可得到化合物H08。 LCMS(ESI)m/z:382[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):13.87(s,1H),8.88(s,1H),8.62(s,1H),7.95(s,1H),7.11-7.08(t,J=6.0Hz,1H),5.58(s,1H),4.00-3.79(m,5H),3.22-3.17(t,J=10.0Hz,1H),2.75-2.74(m,1H),1.11-1.07(m,1H),0.71-0.68(m,4H)。
实施例9
(反式)-3-乙基-4-(咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-1(6H)-基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷 -1-甲酰胺H09的制备
采用与实施例7相同的制备方法,将实施例7中的7a替换为9a,可得到化合物H09。LCMS(ESI)m/z:381[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):11.89(s,1H),8.59(s,1 H),8.39(s,1H),7.48-7.47(d,J=2.8Hz,1H),7.03-7.00(t,J=6.0Hz,1H),6.81(s,1H),5.18-5.12(m,1H),4.04-3.99(t,J=10.0Hz,1H),3.89-3.80(m,3H),3.74-3.69(t,J=9.2Hz,1 H),3.22-3.17(t,J=9.2Hz,1H),2.80-2.74(m,1H),1.44-1.38(m,1H),0.77-0.73(t,J=7.2Hz, 3H)。
实施例10
(顺式)-3-乙基-4-(咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-1(6H)-基)-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷 -1-甲酰胺H10的制备
采用与实施例9相同的制备方法,将实施例9中的I-3替换为I-4,可得到化合物H10。 LCMS(ESI)m/z:381[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):11.89(s,1H),8.61(s,1H),7.84(s,1H),7.48(s,1H),7.10-7.08(t,J=5.6Hz,1H),6.96(s,1H),5.54(s,1H),4.01-3.78(m,5H),3.21-3.16(t,J=10.0Hz,1H),2.73(s,1H),1.16-1.12(m,1H),0.71-0.68 (m,4H)。
实施例11
(反式)-4-({4-乙基-1-[(2,2,2-三氟乙基)氨基甲酰基)]吡咯烷-3-基}氨基)-1H-吡咯并[2,3-b] 吡啶-5-甲酰胺H11的制备
第一步4-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺11b的制备
在反应瓶中加入化合物4-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸11a(1.00g,5.10mmol)和 DMF(10mL),加入CDI(0.91g,5.61mmol),室温搅拌1小时,冰水浴冷却,然后在0℃下加入NH3.H2O(1.12mL),体系在室温搅拌1小时。TLC监测反应完成,将体系倒入水中,用乙酸乙酯萃取三次,合并有机相进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩,二氯甲烷/石油醚=5ml/1ml打浆,抽滤,用旋转蒸发仪减压干燥得标题化合物11b(0.6 g,3.08mmol),收率为60.3%。LCMS(ESI)m/z:196[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6, δppm):8.29(s,1H),7.91(s,1H),7.65-7.59(m,2H),7.21(br s,1H),6.57-6.56(d,J=3.2Hz,1H)。
第二步4-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲腈11c的制备
在反应瓶中加入化合物4-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺11b(300mg,1.54mmol), 三乙胺(6mL)和二氯甲烷(6mL),室温滴加三氟乙酸酐(3mL),体系在室温下搅拌 6小时。TLC监测反应完成,将体系倒入冰水中,用二氯甲烷萃取三次,合并有机相进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,低温浓缩后过柱纯化(v/v,二氯甲烷/甲醇=100:1-50:1) 得到标题化合物11c(200mg,1.13mmol),收率为73.4%。LCMS(ESI)m/z:178[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):12.69(br s,1H),8.67(s,1H),7.834-7.825(d,J=3.6 Hz,1H),6.72-6.71(d,J=3.6Hz,1H)。
第三步4-氯-1-苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲腈11d的制备
在反应瓶中加入DMF(5mL),然后分别加入化合物4-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲腈11c(100mg,0.57mmol),三乙胺(114mg,1.13mmol)和苯磺酰氯(150mg,0.85 mmol),室温下搅拌过夜。TLC监测反应完成,反应体系倒入水中,用乙酸乙酯萃取三次,有机相合并后进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后过柱纯化(v/v,石油醚 /乙酸乙酯=20:1-5:1)得到标题化合物11d(120mg,0.38mmol),收率为67%。LCMS(ESI) m/z:318[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):8.88(s,1H),8.26-8.25(d,J=3.6Hz, 1H),8.17-8.15(d,J=7.6Hz,2H),7.81-7.77(t,J=7.6Hz,1H),7.69-7.65(t,J=8.0Hz,2H), 7.07-7.06(d,J=4.0Hz,1H).
第四步(反式)-3-[(5-氰基-1-苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氨基]-4-乙基 -N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺11e的制备
在反应瓶中加入二氧六环(12mL),然后分别加入化合物4-氯-1-苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲腈11d(240mg,0.76mmol),(反式)-3-氨基-4-乙基-N-(2,2,2-三氟乙基) 吡咯烷-1-甲酰胺I-3(199mg,0.83mmol),碳酸铯(740mg,2.27mmol),Xantphos(175mg,0.30mmol)和Pd(OAc)2(33.9mg,0.15mmol),加热到100℃搅拌6小时,TLC监测反应完成。体系降到室温过滤,反应体系倒入水中,用二氯甲烷和水萃取三次,有机相合并进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后得到粗品,用制备TLC纯化得粗品标题化合物11e(100mg,0.19mmol),收率为25.4%。LCMS(ESI)m/z:521[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):8.29(s,1H),8.19-8.17(d,J=8.0Hz,2H),7.67-7.61(m,2H), 7.54-7.50(t,J=8.0Hz,2H),6.64-6.63(d,J=4.4Hz,1H),5.11-5.09(d,J=8.4Hz,1H), 4.59-4.56(t,J=6.4Hz,1H),4.34-4.30(m,1H),3.96-3.86(m,3H),3.76-3.71(m,1H), 3.36-3.32(m,1H),3.23-3.19(m,1H),2.23-2.18(m,1H),1.75-1.68(m,1H),1.45-1.38(m,1 H),1.02-0.98(t,J=7.2Hz,3H)。
第五步(反式)-4-({4-乙基-1-[(2,2,2-三氟乙基)氨基甲酰基)]吡咯烷-3-基}氨基)-1-苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺11f的制备
在反应瓶中加入无水DMSO(3mL),然后分别加入化合物(反式)-3-[(5-氰基-1-苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氨基]-4-乙基-N-(2,2,2-三氟乙基)吡咯烷-1-甲酰胺11e(80.0 mg,0.15mmol),碳酸钾(21.3mg,0.15mmol)和双氧水(34.9mg,0.31mmol,30%),反应体系室温搅拌12小时。TLC监测反应完成,反应体系倒入水中,用乙酸乙酯和水萃取三次,有机相合并进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后得到粗品,用制备TLC纯化得标题化合物11f(40mg,0.074mmol),收率为48.3%。LCMS(ESI)m/z:539 [M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3,δppm):9.44-9.43(d,J=7.6Hz,1H),8.39(s,1H), 8.18-8.15(m,2H),7.62-7.48(m,4H),6.66-6.65(d,J=4.4Hz,1H),5.84(br s,2H),4.66-4.63 (t,J=6.4Hz,1H),4.22-4.18(m,1H),3.94-3.87(m,3H),3.76-3.75(m,1H),3.34-3.30(m,1 H),3.21-3.17(m,1H),2.24-2.18(m,1H),1.71-1.65(m,1H),1.42-1.34(m,1H),1.00-0.96(t,J =7.2Hz,3H)。
第六步(反式)-4-({4-乙基-1-[(2,2,2-三氟乙基)氨基甲酰基)]吡咯烷-3-基}氨基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺H11的制备
在反应瓶中加入甲醇(1mL),然后分别加入化合物(反式)-4-({4-乙基-1-[(2,2,2-三氟乙基)氨基甲酰基)]吡咯烷-3-基}氨基)-1-苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺11f(40.0 mg,0.074mmol)和氢氧化钠溶液(0.15mL,0.15mmol,1mol/L),反应体系在室温搅拌12小时。TLC监测反应完成,反应体系用乙酸乙酯和水萃取三次,有机相合并进行水洗,饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩后得到粗品,用制备TLC纯化得标题化合物H11(26mg,0.063mmol),收率为83.3%。LCMS(ESI)m/z:399[M+H]+。1H NMR(400MHz, DMSO-d6,δppm):11.54(s,1H),9.80-9.78(d,J=8.0Hz,1H),8.39(s,1H),7.81(br s,1H), 7.19-7.17(m,1H),7.02(br s,1H),6.88-6.85(t,J=6.0Hz,1H),6.64-6.63(m,1H),4.39-4.36 (m,1H),3.84-3.75(m,3H),3.62-3.58(m,1H),3.17-3.13(m,2H),2.06-2.03(m,1H), 1.63-1.56(m,1H),1.38-1.30(m,1H),0.94-0.90(t,J=7.6Hz,3H)。
实施例12
(顺式)-4-({4-乙基-1-[(2,2,2-三氟乙基)氨基甲酰基)]吡咯烷-3-基}氨基)-1H-吡咯并[2,3-b] 吡啶-5-甲酰胺H12的制备
采用与实施例11相同的制备方法,以11d和I-4为原料,可得到化合物H12。LCMS(ESI)m/z:399[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):13.59(s,1H),10.08-10.06(d, J=6.4Hz,1H),8.40(s,2H),7.86(br s,1H),7.18(s,1H),7.04(br s,1H),6.87-6.85(m,1H),6.59(s,1H),4.65(s,1H),3.75-3.60(m,4H),3.48-3.45(m,1H),3.11-3.06(t,J=10.4Hz,1H), 2.45-2.40(m,1H),1.57-1.49(m,2H),0.91-0.87(t,J=7.2Hz,3H)。
生物学实验实施例:
实施例一、本发明的化合物对JAK激酶的抑制测试
1.实验目的
通过以下方法进行体外JAK1-3激酶活性的抑制测试。
1.1试剂盒和检测液体
分别使用PerkinElmer开发的JAK1
Ultra assay、JAK2
Ultraassay、 JAK3
Ultra assay方法进行测试。
JAK1
Ultra assay酶反应体系包括2nM JAK1(Invitrogen,PV4775)、50nM ULight TM-JAK-1肽(底物,PerkinElmer,TRF0121-M)和38uM ATP(Sigma,A7699)。JAK2
Ultra assay酶反应体系包括0.03nM JAK2(Invitrogen,PV4288)、50nMULight TM-JAK-1肽(底物,PerkinElmer,TRF0121-M)和12uM ATP(Sigma,A7699)。JAK3
Ultra assay酶反应体系包括0.08nM JAK3(Invitrogen,PV4080)、50nM ULightTM-JAK-1肽(底物,PerkinElmer,TRF0121-M)和4uM ATP(Sigma,A7699)。以上反应体系还包括:检测液,2nM Eu-W1024抗磷酸酪氨酸(PerkinElmer,AD0069);终止液,10mM EDTA(Invitrogen,1842C505)。
酶促反应缓冲液包含50mM HEPES(pH7.5)(Invitrogen,15630130)、10mM MgCl2(Sigma,63020)、1mM EDTA(Invitrogen,1842C505)、2mMDTT(Sigma,43815)、 0.01%BRIJ-35(Sigma,B4184)。JAK1激酶、JAK2激酶、JAK3激酶、ATP、底物均使用缓冲液溶解稀释。
1.2化合物的配置
将测试化合物H01-H12分别溶解于DMSO中。在针对每种化合物的实验中,化合物 3倍稀释,使得测试化合物的终浓度为从0.017nM到1uM,共11个梯度浓度。
1.3实验过程
在384孔板中分别加入2.5ul 8倍于终浓度的化合物溶液,5ul 4倍浓度的JAK1或JAK2 或JAK3激酶溶液,室温反应10min。加入2.5ul 8倍浓度的ULight TM-JAK-1肽/ATP溶液,室温反应90min。最后加入5ul 4倍浓度的EDTA终止液和5ul 4倍浓度的Eu-W1024 抗磷酸酪氨酸检测液,继续孵育60min,在Envision多模式读板仪(PE,2105-0010)中读取发光值。
1.4实验结果
根据公式:抑制率百分比=(最大值-转换值)/(最大值-最小值)×100计算每个化合物不同浓度的抑制率。其中最大值为孔板中加入DMSO的对照值,最小值为空白所得值,转换值为每个化合物孔所获得的值。再通过excel中XLFit拟合工具进行拟合,得出相应化合物的半抑制浓度(IC50)。
2.实验结果及结论
本发明的化合物对JAK1-3激酶的活性抑制的IC50见下表。
表1.本发明的化合物对JAK1-3激酶的活性抑制的IC50
由上表可见,本发明的化合物对JAK1-3激酶具有不同的抑制作用,与JAK2和JAK3相比,JAK1的IC50值更低,对JAK1表现出更好的抑制活性,因此本发明的化合物对JAK1 具有较好的选择性,由于JAK激酶参与体内各种重要的生理过程,对不同亚型的广泛抑制有可能在治疗获益之外带来不良反应,因此本发明所提供的JAK1选择性抑制剂,将会具有安全性更好的优势。
实施例二、本发明化合物对细胞增殖的抑制测试
1.实验目的和方法
通过下列方法进行本发明的化合物对Blast T细胞和TF-1细胞增殖的抑制测试。
1.1化合物的配置
将所测试化合物H01、H04、H8、H9、H11、H12溶解于DMSO中。以4倍梯度稀释化合物溶液,以使得化合物溶液的终浓度为从0.0006-10uM。DMSO对照溶液为相应地稀释的DMSO溶液。
1.2 IL-2Blast T细胞增值实验
使用的培养基包括:RPMI培养基1640(GibcoTM,11875093)、10%FBS(Ausbina,0986180)、55uM 2-硫基乙醇、1%青霉素-链霉素(Gibco,1902422)。使用NuncTM Edge 2.096孔平底平板(目录号167425)。
分离健康人源(抽取健康人的血液)的PBMC细胞,用EasySep
TMHuman CD4T细胞分离试剂盒(Stemcell,19052)分离出CD4
+T细胞。加入10ug/ml PHA(Sigma L8902) 刺激获得密度为2x10
6/mL的细胞,继续培养3天。使用PBS洗涤3次,加入IL-2(Thermo fisher,PHC0023)(100u/ml)刺激1周。使用培养基重悬细胞,以5x10
4密度细胞/孔接种到96孔板,加入不同浓度的待测化合物溶液或DMSO对照溶液孵育1小时。加入20u/ml 的IL-2(50ul/孔,未加入IL-2的对照孔不加),孵育72小时,加入Celltiter
试剂(Promega, G7571)混匀5min,室温孵育30min,在SpectraMax L(Molecular Device)上读取发光值。根据公式:抑制率=1-(Value-Min)/(Max-Min)计算每个浓度的抑制率,其中Value是每孔的发光值,Max为DMSO对照孔数值,Min为未加IL-2刺激的孔的数值,再通过excel 中XLFit拟合工具进行拟合,得出相应化合物的IC
50。
1.3 TF‐1细胞增值实验
使用的培养基包含:RPM1640(GibcoTM‐11875093)、10%FBS(Ausbina,0986180)、1%青霉素‐链霉素(Gibco,1902422)。
用含2ng/mL GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,又称沙格司亭,美国Biosource, F3039)的培养基培养人红系白血病细胞TF-1细胞(ATCC,货号:CC-Y1652),达到密度为4.0x10
5cells/mL后用不含GM-CSF的培养基饥饿24小时,再用含2ng/mL GM-CSF的培养基重悬细胞,并以5,000个细胞/孔的密度接种于96孔板,加入不同浓度的待测化合物或DMSO对照溶液孵育72小时,加入Celltiter
试剂(Promega,G7571),在SpectraMax L(Molecular Device)上读取发光值。根据公式:抑制率=1-(Value-Min) /(Max-Min)计算每个浓度的抑制率,其中Value是每个化合物孔的发光值,Max为DMSO 对照孔数值,Min为未加IL-2刺激的孔的数值,再通过excel中XLFit拟合工具进行拟合,得出相应化合物的IC
50。
2.实验结果及结论
本发明的化合物对Blast T细胞和TF-1细胞的增殖抑制的IC50如下表所示。
表2本发明的化合物对T细胞和TF-1细胞的增殖抑制的IC50
由上表可知,本发明的化合物对T细胞增殖的IC50值为13-50nM,对TF-1细胞增殖的IC50值为70-250nM。可见,本发明的化合物对T细胞具有较好的抑制增殖的作用,对TF-1 细胞的增殖抑制作用较弱。该结果表明本发明的化合物动物药效更好,不良反应更少。
实施例三、本发明化合物对小鼠足肿胀的药效学测试
1.摘要
以8周龄、体重22-24g的雄性ICR小鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)为实验动物,测定H01化合物、H04化合物、H09化合物、H11化合物、H12化合物灌胃给予后对小鼠足肿胀的效果。探讨发明化合物的抗炎药效学特征。
2.实验方案
2.1实验用化合物
H01化合物、H04化合物、H09化合物、H11化合物、H12化合物。
2.2化合物的配置
称取一定量的化合物,溶于4%吐温80/0.5%羟丙基甲基纤维素的水溶液。小鼠灌胃体积为10ml/kg。
2.3操作
按下表所示剂量对小鼠灌胃给予10mg/kg H01化合物、H04化合物、H09化合物、H11化合物、H12化合物或药效常用剂量的甲氨蝶呤,半小时后足底皮下注射40mg/kg的角叉菜胶(sigma,C1013)。在造模前,和造模后的不同时间点(0.5小时、1小时、2小时)通过足趾肿胀仪测定足体积,根据公式:足肿胀率=(给药后的足体积-基础足体积) /基础足体积×100计算化合物的效果。基础足体积表示给药前的足体积。
3.实验结果及结论
由下表所示数据可知,10mg/kg的本发明化合物能缓解角叉菜胶造成的小鼠足肿胀率,尤其在给药后1-2小时内,说明本发明化合物具有一定的抗急性炎症效果,且2小时时的足肿胀率优于甲氨蝶呤。
表3本发明的化合物对小鼠足肿胀的药效
实施例四、本发明化合物对大鼠足肿胀的效果测试
1.摘要
以6-7周龄,体重160-180g的雄性SD大鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)为实验动物,测定H01化合物、H04化合物、H09化合物、H11化合物、实施例H12化合物灌胃给予后对大鼠足肿胀的效果。探讨发明化合物的抗炎药效学特征。
2.实验方案
2.1实验用化合物
H01化合物、H04化合物、H09化合物、H11化合物、H12化合物。
2.2化合物的配置
称取一定量的化合物,溶于4%吐温80/0.5%羟丙基甲基纤维素的水溶液。
2.3操作
按下表所示剂量,对大鼠灌胃给予H01化合物、H04化合物、H09化合物、H11化合物、H12化合物或药效常用剂量的甲氨蝶呤,半小时后足底皮下注射0.1ml的0.03%(W/V) 的刀豆蛋白(sigma,C2010)。在造模前,及造模后1h、2h、4h、6h分别通过足趾肿胀仪测定足体积,根据以下公式计算化合物的效果:足肿胀率=(给药后的足体积-基础足体积) /基础足体积×100。基础足体积表示给药前的足体积。
3.实验结果及结论
由下表数据可知,10mg/kg的本发明化合物能缓解刀豆蛋白诱导的大鼠足肿胀,表明本发明化合物具有一定抗急性炎症的效果,部分化合物2小时或4小时后的抗急性炎症的药效优于甲氨蝶呤。
实施例五、本发明化合物对大鼠类风湿性关节炎的效果测试
1.摘要
以5-6周龄、体重160g(实验时)的lewis雌性大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)为实验动物,测定H01、H09、H11、H12化合物长期给药后对大鼠类风湿性关节炎的效果。探讨发明化合物的抗炎药效学特征。
2.实验方案
2.1实验用化合物
H01化合物、H09化合物、H11化合物、H12化合物。
2.2化合物的配置
称取一定量的化合物,溶于4%吐温80/0.5%羟丙基甲基纤维素的水溶液(溶媒)。大鼠灌胃体积为10ml/kg。
2.3操作
将II型胶原(Sigma,C7806)溶解于0.1M乙酸中,4℃冰箱过夜,胶原浓度为4mg/mL。实验注射前向胶原溶液中加入等体积不完全氟氏佐剂(IFA),用高速匀浆机(30,000rpm)乳化胶原,制成胶原乳剂,此过程在冰上操作。
在第1天和第7天分两次对大鼠免疫注射胶原乳剂造模,使用如上制备的胶原乳剂于尾根部皮内单点注射0.1ml,于背部皮内两点注射,每点注射0.2ml。造模后第10天-14天对动物进行临床评分和足体积测试。造模成功(按如下评分标准临床评分平均≥3分/动物)的动物随机分配到各个给药组,每组动物10只,以10mg/kg的剂量每天2次灌胃给予上述化合物或甲氨蝶呤(以4mg/kg的剂量),模型对照组仅灌胃给予溶媒,直至第27天。实验期间每周评分2次,足体积测量2次,体重称量2次。
根据病变的不同程度(红肿,关节变形)按照0-4分的标准进行评分,每个肢体的最高评分为4分,每只动物最高评分为16分。评分标准如下:0,无红肿现象;1,中足(跗骨)或者踝关节轻微的红肿;2,从踝关节到中足(跗骨)轻微红胀;3,从踝关节到跖骨关节中等程度红胀;4,从脚趾或手指到踝关节或腕关节严重红肿。
3.实验结果及结论
由下表数据可知,10mg/kg剂量的本发明化合物能减轻大鼠关节炎临床评分,减轻足趾肿胀体积,缓解关节炎的进展。
实施例六、本发明化合物的药代动力学测试
1.摘要
以7-8周龄、体重180-220g雄性SD大鼠为实验动物,应用LC/MS/MS法测定灌胃给予测定H01、H04、H08、H09、H11、H12后不同时间点血浆中的药物浓度。研究本发明化合物在大鼠体内的药代动力学行为,评价其药动学特征。
2.实验方案
2.1实验用化合物
H01、H04、H08、H09、H11、H12。
2.2化合物的配置
称取一定量的化合物,溶于50%PEG400/水,配置成均一的溶液。
2.3操作
以5mg/kg的剂量对大鼠灌胃上述化合物,在给药前和给药后0.083、0.25、0.5、1.0、 2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0小时由眼眶采血0.2ml,至于抗凝管中,4℃、6000转/分钟离心10分钟分离血浆,-80℃保存。
取50μL上述不同时刻的血浆,加入150μL含内标甲苯磺丁脲(阿拉丁,T129578) 的乙腈溶液(200ng/mL)混合、振摇5分钟,12,000rpm,离心5分钟后,取出100μL上清,再与200μL水混合后进样分析。
2.4液相色谱条件和分析软件
液相色谱***为LC‐20AD UFLC高效液相色谱***(岛津,LC‐20AD)。质谱***为AB Sciex API4000三级四级杆质谱配备电喷雾电离源(ESI)(Applied Biosystems,加拿大)。用于控制液质联用仪和定量分析的软件为Analyst 1.6(Applied Biosystems,加拿大),药动学参数采用WinNonlin(version 5.2,Pharsight,Mountain View,CA)非房室模型进行分析。
液相色谱分离采用Synergi Fusion-RP C18色谱柱(50×2.0mm,内径4μm)。柱温维持在室温。流动相的组成和梯度分别见下表。
化合物的液相条件
待测化合物及内标的质谱条件见下表
2.5标准和质控溶液的准备
将待测化合物溶解在DMSO中配制成浓度为1mg/mL的储备液,用50%乙腈稀释得到一系列的标准工作溶液,浓度为10、3、1、0.3、0.1、0.03和0.01μg/mL,和一系列的标准质控溶液(8、0.5和0.03μg/mL)。将5μL标准溶液和45μL空白血浆基质混合均匀,得到标准曲线的各浓度点的标准溶液(1000、500、200、100、10、5、2和1ng/mL)和质控标准溶液(血浆样品800、50和3ng/mL)。
将内标甲苯磺丁脲固体粉末溶解在DMSO中配制成1mg/mL的储备液。储备液用100%乙腈稀释得到200ng/mL的溶液作为蛋白沉淀剂。
3.实验结果
本发明化合物的药代动力学参数如下:
由上表数据可知,本发明化合物药代吸收较好,具有较好的药动学特征。
实施例七、化合物对hERG钾通道电流的抑制效果测试
1.摘要
应用电生理手动膜片钳检测H01、H04、H08、H09、H11、H12化合物对hERG钾通道的作用,研究本发明化合物初步的心脏安全性。
2.实验方案
2.1化合物的配置
测试化合物溶解于DMSO中,配置成10mM、3.3mM、1.1mM、0.37mM的母液。接下来使用细胞外液进行次级稀释,最终测试溶液的浓度为30uM、10uM、3.3uM、1.1uM、 0.37uM。
2.2试剂准备
细胞外液包含:130mM NaCl、4mM KCl、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM葡萄糖、10mMHEPES(pH 7.4)。
细胞内液包含:130mM KCl、1mM MgCl2、5mM EGTA、5mM MgATP和10MgATP HEPES(pH7.2)。
细胞培养基组成:DMEM(Gibco,11330032)、15%胎牛血清(PAA,A15-101)、 1%青霉素-链霉素(Biowest,L0022-100)。
2.3电生理手动膜片钳***实验方案
将过表达hERG钾离子通道的HEK293细胞(来自于纽约大学医学院MohamedBoutjdir博士实验室-南通科瑞斯)使用DMEM/15%胎牛血清/1%青霉素-链霉素组成的培养基培养于37℃、5%CO2培养箱中。实验时,将细胞转移到嵌入倒置显微镜平台的细胞浴槽中,灌流细胞外液,稳定5分钟待细胞沉淀后即可开始实验。采用HEKA EPC-10膜片钳放大器和PATCHMASTER采集***(HEKA仪器公司,D-67466,Lambrcht,Pfalz,德国)记录膜电流。所有实验均在室温(22-24℃)下完成。实验中使用P-97微电极拉制仪(Sutter InstrumentCompany,One Digital Drive,Novato,CA 94949)拉直电极 (BF150-110-10)。电极内径为1-1.5mm,充满细胞内液后的入水电阻为2-4MΩ。
实验采用全细胞记录模式进行,按照下方的电生理刺激方案记录电流值。首先将膜电压钳制在-80mV,给予细胞持续2s,+20mV电压刺激,激活hERG钾通道,再复极化至 -50mV,持续5s,产生外向尾电流,刺激频率每15s一次。电流值为尾电流的峰值。实验中采用全细胞记录模式记录通道电流。首先灌流细胞外液(大约每分钟2ml)并持续记录,等待电流稳定(5分钟内电流衰减(Run-Down)小于5%),此时尾电流峰值即为对照电流值。接着灌流含待测药物的细胞外液并持续记录直到药物对hERG电流的抑制作用到达稳定状态,此时尾电流峰值即为加药后电流值。达到稳定态势以后如果以细胞外液灌流冲洗后hERG电流回复则可以继续灌流测试其它浓度或药物。使用含待测药物的溶液,按浓度由低到高的顺序进行灌流及记录电流值。使用PATCHMASTER V2X60(HEKA仪器公司,D-67466Lambrecht,Pfalz,德国)进行数据采集,采用Origin 8.5(OriginLab公司, Northampton,MA)软件进行分析和统计。
3.结果
本发明化合物对hERG的电流抑制的IC50如下表所示。由下表数据可知,本发明化合物对hERG的电流抑制作用较弱,安全性好。
化合物 |
IC50(uM) |
H01 |
>30 |
H04 |
>30 |
H08 |
>30 |
H09 |
>30 |
H11 |
>30 |
H12 |
>30 |