CN109517857A

CN109517857A - 一种发酵和提取纯化l-亮氨酸的方法

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Publication number: CN109517857A
Application number: CN201811552933.6A
Authority: CN
Inventors: 包鑫; 张宗华; 米永花; 田辉; 李江雷; 韦树高
Original assignee: XINJIANG FUFENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: XINJIANG FUFENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2019-03-26
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: CN109517857B

Abstract

本发明属于氨基酸生产技术领域，公开了一种发酵和提取纯化L‑亮氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵产L‑亮氨酸，步骤2）除菌和微滤，步骤3）提取和纯化。本发明方法提高了亮氨酸的发酵产量，提取步骤简单可行，产品纯度高。

Description

一种发酵和提取纯化L-亮氨酸的方法

技术领域

本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及一种发酵和提取纯化L-亮氨酸的方法。

背景技术

L-亮氨酸（(2R)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid）化学名称为L-2-氨-4-甲基戊酸，白色结晶或结晶性粉末；无臭，味微苦。在甲酸中易溶，在水中略溶，在乙醇或***中极微溶解。密度为1.038g/cm³，熔点大于300℃。

L-亮氨酸，L-异亮氨酸和L-缬氨酸都是支链氨基酸，它们有助于促进训练后的肌肉恢复。其中L-亮氨酸是最有效的一种支链氨基酸，可以有效防止肌肉损失，因为它能够更快的分解转化为葡萄糖。

目前，L-亮氨酸生产方法主要是发酵法，发酵法生产的L-亮氨酸发酵液经过提取、蒸发浓缩、离心烘干等步骤才能制成成品。申请人之前的专利技术“一种利用顺序式模拟移动床色谱连续提取亮氨酸的方法”，公开了发酵亮氨酸的工艺，包括将谷氨酸棒杆菌种子液与枯草芽孢杆菌种子液按照一定的体积比混合，得到混合种子液，然后转入发酵培养基中培养，温度30℃，PH值7.2，培养时间60小时，得到亮氨酸发酵液；该方法较单一发酵方式相比，提高了发酵产亮氨酸的效率，但是存在混合发酵工艺繁琐，发酵参数难以精确控制等缺陷。

目前国内外L-亮氨酸的提取纯化参数存在一些缺陷，例如，蒸发技术基本都采用浓缩锅蒸发，采用浓缩锅蒸发虽然可以满足L-亮氨酸的蒸发浓缩，但此方法浓缩周期长，效率低，不利于L-亮氨酸的大规模生产。L-亮氨酸经过提取结晶后，需进行烘干后才能粉碎制成成品。目前国内外L-亮氨酸的烘干技术基本都采用双锥烘干干燥法，此法虽然可以满足L-亮氨酸的烘干，但是产品成本高，且效率较低，人员需求量大。

发明内容

为解决L-亮氨酸发酵和提取工艺存在的问题，本发明提供了一种发酵和提取纯化L-亮氨酸的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种发酵和提取纯化L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵产L-亮氨酸，步骤2）除菌和微滤，步骤3）提取和纯化。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

步骤1）发酵产L-亮氨酸：以8-10%的接种量将种子液接入发酵培养基中，培养温度36.8-37.0℃，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25%-30%；当发酵至12h时，将复合氨基酸溶液流加进罐内，维持罐内谷氨酸的浓度为30-50mg/L；当发酵至24h时，停止流加复合氨基酸溶液，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.6-0.9g/L，发酵结束前6小时停止流加营养液；发酵过程中，以泡敌消泡，总发酵时间为48h，得到亮氨酸发酵液；

步骤2）除菌和微滤：将亮氨酸发酵液加热至100℃，保温5min进行灭菌，然后采用微滤膜过滤除去菌体，收集滤液；

步骤3）提取和纯化：将步骤2）所得滤液pH调至5.5-6.5，过弱碱性阴离子交换树脂，收集亮氨酸流出液，流出液经双效蒸发器浓缩3-4倍，然后注入顺序式模拟移动床色谱，并保持料液温度为60℃，收集色谱分离后的提取液，再将提取液浓缩4-5倍，离心，收集粗晶体，将粗晶体添加到20-30倍重量的50℃的纯化水进行重溶，然后经双效蒸发器浓缩10倍；再将浓缩后的亮氨酸料液经过降温水缓慢降温至20℃时，然后离心，收集沉淀物，经流化床干燥机进行干燥，获得亮氨酸成品。

进一步地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，(NH₄)₂SO₄ 10g/L，玉米浆10g/L，柠檬酸0.5g/L，KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L， MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O0.1g/L，V_B1 5mg/L，V_H 0.1mg/L。

进一步地，所述复合氨基酸溶液的组分包括谷氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。

进一步地，所述复合氨基酸溶液的组分为：谷氨酸10g/L，异亮氨酸5/L，缬氨酸5g/L。

进一步地，所述营养液的组分包括葡萄糖、甘油和甜菜碱。

进一步地，所述营养液的组分为：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L。

进一步地，所述微滤膜截留分子量为2000-10000Da，微滤温度为30-35℃，工作压力：进压为3-4bar，出压为1-2bar。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明通过对亮氨酸代谢途径进行分析，优化了发酵培养步骤；甜菜碱含有三个活性甲基，在L-亮氨酸合成方面有促进作用；甘油提供碳骨架，促进亮氨酸的合成；谷氨酸、异亮氨酸以及缬氨酸代谢途径会对亮氨酸途径进行分流，通过添加上述氨基酸会对相应的代谢途径产生反馈抑制，从而使得代谢流更多地流向亮氨酸，本研究发现，在发酵初期添加上述氨基酸，对亮氨酸的产量影响并不大，可能是因为发酵初期氨基酸合成途径较为微弱，并不会给带来较大的影响，因此，选择发酵12h进行添加；而前期碳源较为充足，菌株以生物量增加为主，因此，选择在24h进行添加营养液，从而促进亮氨酸的合成；发酵培养基、复合氨基酸溶液以及营养液等多种发酵因素相互协同，提高了亮氨酸的发酵产量，缩短了发酵时间。

与传统工艺相比，不需要经过超滤和活性炭脱色，可显著降低废污处理难度，减轻了废污处理负担，同时双效蒸发器浓缩工艺。

本发明分别采用陶瓷膜过滤***对L-异亮氨酸发酵液进行预处理，相对于传统的板框过滤除蛋白的工序，蛋白的回收率较高，可大幅提高生产效率。

本发明利用双效蒸发器浓缩L-亮氨酸溶液的方法浓缩周期短、效率高，减少了母液中亮氨酸的残留量，使得产品收率高、纯度高、质量稳定可靠，且二效蒸发利用余热蒸发，节约燃料；采用流化床烘干机烘干技术烘干L-亮氨酸，得到L-亮氨酸产品水分低于0.3%；本发明操作简单，成本较低，生产过程全自动化，劳动强度低，节约成本，整个工艺过程十分适用于工业化生产。

说明书附图

图1：营养液中甘油浓度对L-亮氨酸产量的影响；

图2：营养液中甜菜碱浓度对L-亮氨酸产量的影响。

具体实施例

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种发酵和提取纯化L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：

发酵培养基的组分：葡萄糖50g/L，(NH₄)₂SO₄ 10g/L，玉米浆10g/L， KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，柠檬酸0.5g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，V_B1 5mg/L，V_H 0.1mg/L。

复合氨基酸溶液的组分：谷氨酸10g/L，异亮氨酸5/L，缬氨酸5g/L，

营养液的组分：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L；

步骤1）以谷氨酸棒杆菌CGMCC No.7033为例，以10%的接种量将种子液（OD₆₀₀值为9.5）接入发酵培养基中，培养温度36.8℃，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25%；当发酵至12h时，将复合氨基酸溶液流加进罐内，维持罐内谷氨酸的浓度为40mg/L；当发酵至24h时，停止流加复合氨基酸溶液，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.8g/L，发酵结束前6小时停止流加；发酵过程中，以泡敌消泡，总发酵时间为48h，即得亮氨酸发酵液；

步骤2）将发酵液加热至100℃，保温5min进行灭菌，然后采用微滤膜过滤除去菌体，收集滤液；所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为30℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar；

步骤3）将滤液pH调至5.9，过弱碱性阴离子交换树脂（D301型，过30倍床体积的滤液），除去色素及蛋白，得到亮氨酸流出液，流出液经双效蒸发器浓缩，并将料液浓缩3倍，然后以平均6m³/h的流速注入顺序式模拟移动床色谱，并保持料液温度为60℃，收集色谱分离后的提取液，并将提取液浓缩5倍，离心，收集粗晶体，将粗晶体添加到30倍重量的50℃的纯化水进行重溶，然后经双效蒸发器浓缩10倍，再将浓缩后的亮氨酸料液经过降温水缓慢降温至20℃，之后离心，并经流化床干燥机进行干燥，获得亮氨酸成品，亮氨酸纯度达99.5%，总收率为82.6%。

注意，本发明利用双效蒸发器浓缩L-亮氨酸溶液，正常工作情况下一效加热器温度与一效分离器温差不超过15℃，一效分离器与二效加热器温度差1-5℃左右，二效加热器温度与二效分离器温差10-25℃；开蒸汽前必须先排空蒸汽管道内的积水，以防管道裂口。

实施例2

一种发酵和提取纯化L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：

发酵培养基的组分：葡萄糖50g/L，(NH₄)₂SO₄ 10g/L，玉米浆10g/L，柠檬酸0.5g/L，KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，V_B1 5mg/L，V_H0.1mg/L。

营养液的组分：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L；

步骤1）以8%的接种量将种子液（OD₆₀₀值为9.5）接入发酵培养基中，培养温度37.0 ℃，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为7.1，通过搅拌和通风控制溶氧在30%；当发酵至12h时，将复合氨基酸溶液流加进罐内，维持罐内谷氨酸的浓度为30mg/L；当发酵至24h时，停止流加复合氨基酸溶液，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.7g/L，发酵结束前6小时停止流加；发酵过程中，以泡敌消泡，总发酵时间为48h，即得亮氨酸发酵液；

步骤3）将滤液pH调至6.0，过弱碱性阴离子交换树脂（D301型，过25倍床体积的滤液），除去色素及蛋白，得到亮氨酸流出液，流出液经双效蒸发器浓缩，并将料液浓缩4倍，然后以平均7m³/h的流速注入顺序式模拟移动床色谱，并保持料液温度为60℃，收集色谱分离后的提取液，并将提取液浓缩5倍，离心，收集粗晶体，将粗晶体添加到25倍重量的50℃的纯化水进行重溶，然后经双效蒸发器浓缩8倍；再将浓缩后的亮氨酸料液经过降温水缓慢降温至20℃时，之后离心，并经流化床干燥机进行干燥，获得亮氨酸成品，亮氨酸纯度达99.3%，总收率为83.1%。

实施例3

发酵因素对发酵液中L-亮氨酸产量和菌体生物量的影响。

OD值测定：发酵液稀释一定倍数后，在波长620 nm处用752分光光度计测定。

发酵液中氨基酸含量测定：采用氨基酸分析仪测定。

1、复合氨基酸溶液中氨基酸组分对L-亮氨酸产量和菌体生物量的影响，发酵方式参照实施例1，具体结果见表1：

表1

组别	菌体OD<sub>620nm</sub>	L-亮氨酸产量g/100ml
			谷氨酸+异亮氨酸+缬氨酸	45.7	4.38
谷氨酸+异亮氨酸	45.3	4.12
			异亮氨酸+缬氨酸	45.6	3.99
谷氨酸+缬氨酸	45.8	4.04

结论：各组别菌体生物量没有明显差异，而L-亮氨酸产量差异较大，其中，谷氨酸+异亮氨酸+缬氨酸组较异亮氨酸+缬氨酸组，L-亮氨酸产量提高0.39g/100ml，提高了9.8个百分点，较谷氨酸+异亮氨酸组提高6.3个百分点，较谷氨酸+缬氨酸组提高8.4个百分点。

2、营养液中甘油和甜菜碱对L-亮氨酸产量和菌体生物量的影响，发酵方式参照实施例1，具体结果见表2：

表2

组别	菌体OD<sub>620nm</sub>	L-亮氨酸产量g/100ml
			甘油+甜菜碱	45.7	4.38
甘油	42.5	3.97
			甜菜碱	45.1	4.13
不添加甘油和甜菜碱	41.3	3.81

结论：通过表2可知，甘油对菌体生物量和L-亮氨酸产量均有促进作用，而甜菜碱对菌体生物量没有明显影响，但是能够提高L-亮氨酸产量；与不添加甘油和甜菜碱的组别相比，本发明的菌体生物量提高了10.6个百分点，L-亮氨酸产量提高了14.9个百分点。

3、甘油和甜菜碱添加量对发酵液中L-亮氨酸产量的影响。

1）营养液中甘油浓度对L-亮氨酸产量的影响，设置浓度为0,1,2,3,4,5,6,7,8（g/L），如图1所示，随着甘油浓度的增加，L-亮氨酸产量逐渐增加，当增加到4g/L后，增幅放缓，增加到5g/L后，L-亮氨酸没有明显的增加，考虑到成本，选择甘油浓度为5g/L最为合适。

2）营养液中甜菜碱浓度对L-亮氨酸产量的影响，设置浓度为0,0.2,0.4,0.6,0.8,

1.0,1.2,1.4,1.6（g/L），如图1所示，随着甜菜碱浓度的增加，L-亮氨酸产量逐渐增加，当营养液中甜菜碱的浓度增加到1g/L后，发酵液中L-亮氨酸含量没有增加。

以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种发酵和提取纯化L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵产L-亮氨酸，步骤2）除菌和微滤，步骤3）提取和纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1）发酵产L-亮氨酸：以8-10%的接种量将谷氨酸棒杆菌种子液接入发酵培养基中，培养温度36.8-37.0℃，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25%-30%；当发酵至12h时，将复合氨基酸溶液流加进罐内，维持罐内谷氨酸的浓度为30-50mg/L；当发酵至24h时，停止流加复合氨基酸溶液，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.6-0.9g/L，发酵结束前6小时停止流加营养液；发酵过程中，以泡敌消泡，总发酵时间为48h，得到亮氨酸发酵液；

步骤3）提取和纯化：将步骤2）所得滤液pH调至5.5-6.5，过弱碱性阴离子交换树脂，收集亮氨酸流出液，流出液经双效蒸发器浓缩3-4倍，然后注入顺序式模拟移动床色谱，并保持料液温度为60℃，收集色谱分离后的提取液，再将提取液浓缩4-5倍，离心，收集粗晶体，将粗晶体添加到20-30倍重量的50℃的纯化水进行重溶，然后经双效蒸发器浓缩10倍；再将浓缩后的亮氨酸料液缓慢降温至20℃时，然后离心，收集沉淀物，经流化床干燥机进行干燥，获得亮氨酸成品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，(NH₄)₂SO₄ 10g/L，玉米浆10g/L， KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，柠檬酸0.5g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，V_B1 5mg/L，V_H 0.1mg/L。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述复合氨基酸溶液的组分包括谷氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述复合氨基酸溶液的组分为：谷氨酸10g/L，异亮氨酸5/L，缬氨酸5g/L。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述营养液的组分包括葡萄糖、甘油和甜菜碱。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述营养液的组分为：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微滤膜截留分子量为2000-10000Da，微滤温度为30-35℃，工作压力：进压为3-4bar，出压为1-2bar。