CN112094873A - 一种提高l-异亮氨酸发酵产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高L‑异亮氨酸发酵产量的方法,采用在发酵培养基中添加氨基酸螯合微量元素的方法来提高异亮氨酸产生菌L‑异亮氨酸发酵过程糖酸转化率和产率,所述氨基酸螯合微量元素包括谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰,金属元素通过与氨基酸螯合反应,即增加了有效氨基酸的营养成分,又增强了微量元素的吸收效果,提高细胞生长速率和细胞活力,进而提高异亮氨酸产量和糖酸转化效率,在不增加额外设备和人力投入的情况下,实现了整个发酵周期的缩短和L‑异亮氨酸产量和转化率的大幅提高,适合于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及发酵法生产氨基酸技术领域,尤其是一种提高L-异亮氨酸发酵产量的方法。
背景技术
近年来,随着L-异亮氨酸在医药保健、食品加工和饲料工业中的应用研究不断深入,市场对L-异亮氨酸的需求在不断增长。2019年国内分支链市场的需求量约为5万吨,但异亮氨酸国内生产能力仅为0.4万吨,供需缺口较大,并且年需求量以10%的速率增加。L-异亮氨酸的生产方法主要有:蛋白质水解法、化学合成法、发酵法及酶法。目前,大规模工业化生产L-异亮氨酸只有微生物发酵法。因此,进一步优化L-异亮氨酸的生产工艺具有重要意义。
现阶段,我国L-异亮氨酸生产存在发酵产酸低、转化率低且副产物多等问题。我国L-异亮氨酸产酸水平为35-40 g/L,提取率为78-80%。近年来原材料价格的上涨和劳动力成本的提高对L-异亮氨酸发酵法生产带来了挑战,进而限制了L-异亮氨酸的应用。利用谷氨酸帮杆菌发酵异亮氨酸,糖酸转化率为12-15%,较理论值具有较大的提升空间。因此如何进一步提高微生物发酵法生产L-异亮氨酸的产率和糖酸转化率成为了推动L-异亮氨酸产业可持续发展的关键问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高L-异亮氨酸发酵产量的方法。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:
一种提高L-异亮氨酸发酵产量的方法,采用异亮氨酸生产菌经发酵获得L-异亮氨酸,在培养基中添加氨基酸螯合微量元素来提高异亮氨酸产生菌L-异亮氨酸发酵过程糖酸转化率和产率,所述氨基酸螯合微量元素由谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜和谷氨酸螯合锰组成,其中,谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜和谷氨酸螯合锰的重量比为:200-300:50-100:100-150:20-40:150-250。
优选的,上述提高L-异亮氨酸发酵产量的方法,在发酵培养过程,随葡萄糖流加氨基酸螯合微量元素:谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰在葡萄糖溶液中的含量分别为200-300mg/L、50-100mg/L、100-150mg/L、20-40mg/L、150-250mg/L,葡萄糖的用量为:发酵初始培养基为30g/L,发酵过程维持葡萄糖浓度为3-5g/L,流加糖浓度为600-700g/L。
优选的,上述提高L-异亮氨酸发酵产量的方法,谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜和谷氨酸螯合锰的重量比为: 240-260:70-80:120-140:25-30:180-210。
优选地,上述提高L-异亮氨酸发酵产量的方法,具体步骤如下:
(1)谷氨酸棒杆菌从甘油管中活化至培养斜面,培养基成分:葡萄糖1.0g/L,酵母浸粉10.0g/L,蛋白胨5.0g/L,磷酸二氢钾1.0g/L,硫酸镁0.2g/L,琼脂粉20.0g/L,32℃培养20-24h,在次转接培养斜面32℃培养16-20h,之后接入种子培养基中进行种子培养,得到种子液;
(2)种子液接入发酵培养基中进行培养,采用分阶段供氧模式控制溶氧:0-20 h为30-50%,20-45h为20-40%,控制pH在7.0-7.2,通过流加浓度为600-700 g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在0.3-0.5%,所述葡萄糖溶液中含有谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰的含量分别为200-300mg/L、50-100mg/L、100-150mg/L、20-40mg/L、150-250mg/L。
优选的,上述提高L-异亮氨酸发酵产量的方法,所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌CGMCC.12153(保藏于中国微生物菌种保藏管理管理委员会普通微生物中心)。
有益效果:
上述提高L-异亮氨酸发酵产量的方法,采用在发酵培养基中添加氨基酸螯合微量元素的方法来提高异亮氨酸产生菌L-异亮氨酸发酵过程糖酸转化率和产率,所述氨基酸螯合微量元素包括谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰,金属元素通过与氨基酸螯合反应,即增加了有效氨基酸的营养成分,又增强了微量元素的吸收效果,提高细胞生长速率和细胞活力,进而提高异亮氨酸产量和糖酸转化效率,在不增加额外设备和人力投入的情况下,实现了整个发酵周期的缩短和L-异亮氨酸产量和转化率的大幅提高,适合于工业化生产。
具体实施方式
实施例1
菌种采用谷氨酸棒杆菌CGMCC.12153;
培养基为在现有普遍采用的发酵培养基 [葡萄糖 30 g/L(分消,0.075 MPa湿热灭菌15 min),(NH4)2SO4 3 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,KH2PO4 2.5 g/L,VB1 0.2 mg/L,玉米浆干粉 20g/L(0.01 MPa湿热灭菌50 min)用NaOH和盐酸调pH至7.0。灭菌条件:0.1 MPa湿热灭菌20 min];
谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰均购买自国药集团;
培养方法:将菌种(谷氨酸棒杆菌CGMCC.12153)从甘油管中活化至培养斜面,培养基成分:葡萄糖1.0g/L,酵母浸粉10.0g/L,蛋白胨5.0g/L,磷酸二氢钾1.0g/L,硫酸镁0.2g/L,琼脂粉20.0g/L,32℃培养20-24h,在次转接培养斜面32℃培养16-20h,之后接入种子培养基[葡萄糖 30 g/L、酵母粉 5 g/L、硫酸铵 5 g/L、玉米浆干粉 15 g/L、KH2PO4 2 g/L、MgSO4 ·7H2O 0.8 g/L、VB1 0.2 mg/L],接种量为15%;在32℃、pH为7.0和溶氧为20-50%条件下于5 L自动控制发酵罐中培养15 h至对数中后期,按15%的接种量接入含有发酵培养基的5 L自动控制发酵罐中,通入空气,初始通风比为0.6,根据溶氧要求,最高通风比达到1.5,调节搅拌转速,采用分阶段供氧模式控制溶氧:0-20 h为30-50%,20-45 h为20-40%,通过自动流加25%的氨水控制pH在7.0-7.2,通过流加0.02%-0.05%泡敌消泡,并通过流加浓度为700 g/L的葡萄糖溶液(含有谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰分别为250mg/L、80mg/L、130mg/L、30mg/L、200mg/L)将残糖控制在0.3-0.5%,发酵45h结束。对照组发酵培养基成分与实验组成分相同,流加浓度为700 g/L的葡萄糖溶液(含有等摩尔量的谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、氯化亚铁、氯化锌、氯化钙、氯化铜、氯化锰,含量分别为417.3 mg/L、58.6 mg/L、116.6 mg/L、90.7 mg/L、44.8 mg/L、37.2 mg/L、7.6 mg/L、43.8 mg/L,各种氨基酸和金属离子均按照实验组中流加的等摩尔量添加),发酵45h结束。放罐时,菌体干重达到73.9g/L,L-异亮氨酸的产量为58.2g/L,糖酸转化率为18.6%,与对照组实验(菌体干重为62.6g/L,L-异亮氨酸产量为42.1 g/L,糖酸转化率为16.8%)相比分别提高了18.1%、38.2%和10.7%。
综上,实施例1采用氨基酸螯合微量元素随葡萄糖流加发酵技术,流加的螯物包括谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰,金属元素通过与氨基酸螯合反应,既增加了有效氨基酸的营养成分,又增强了微量元素的吸收效果,提高细胞生长速率和细胞活力,进而提高异亮氨酸产量和糖酸转化效率。发酵45h,菌体干重达到最高达到73.9g/L,L-异亮氨酸的产量为58.2g/L,糖酸转化率为18.6%,分别比对照实验分别提高了18.1%、38.2%和10.7%。
实施例2
采用谷氨酸棒杆菌;
培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1);
培养方法同实施例1。
发酵过程通过流加浓度为600 g/L的葡萄糖溶液(含有谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰分别为200mg/L、50mg/L、100mg/L、20mg/L、150mg/L),对照组流加浓度为600 g/L的葡萄糖溶液(含有等摩尔量的谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、氯化亚铁、氯化锌、氯化钙、氯化铜、氯化锰,含量分别为321.2mg/L、36.6 mg/L、89.7mg/L、72.6 mg/L、28.0mg/L、28.6mg/L、5.1mg/L、32.9 mg/L)。将残糖控制在0.3-0.5%,发酵45h结束。放罐时,菌体干重达到67.2g/L,L-异亮氨酸的产量为49.7g/L,糖酸转化率为17.2%,比对照实验(菌体干重为59.4g/L,L-异亮氨酸产量为40.1 g/L,糖酸转化率为16.3%)分别提高了13.1%、23.9%和5.5%。
实施例3
采用谷氨酸棒杆菌;
培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1);
培养方法同实施例1。
发酵过程通过流加浓度为600 g/L的葡萄糖溶液(含有谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰分别为260mg/L、75mg/L、130mg/L、30mg/L、200mg/L),对照组流加浓度为600 g/L的葡萄糖溶液(含有等摩尔量的谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、氯化亚铁、氯化锌、氯化钙、氯化铜、氯化锰,含量分别为425.7mg/L、54.9 mg/L、116.6mg/L、94.3 mg/L、42.1mg/L、37.2mg/L、7.6mg/L、43.8 mg/L)。将残糖控制在0.3-0.5%,发酵45h结束。放罐时,菌体干重达到76.2g/L,L-异亮氨酸的产量为56.7g/L,糖酸转化率为17.9%,比对照实验(菌体干重为61.4g/L,L-异亮氨酸产量为42.9 g/L,糖酸转化率为16.6%)分别提高了24.1%、32.2%和7.8%。
实施例4
采用谷氨酸棒杆菌;
培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1);
培养方法同实施例1。
发酵过程通过流加浓度为650 g/L的葡萄糖溶液(含有谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰分别为240mg/L、100mg/L、140mg/L、25mg/L、180mg/L),对照组流加浓度为650 g/L的葡萄糖溶液(含有等摩尔量的谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、氯化亚铁、氯化锌、氯化钙、氯化铜、氯化锰,含量分别为386.4mg/L、73.3 mg/L、125.6mg/L、87.1 mg/L、55.9mg/L、40.1mg/L、6.3mg/L、39.4 mg/L)。将残糖控制在0.3-0.5%,发酵45h结束。放罐时,菌体干重达到72.7g/L,L-异亮氨酸的产量为53.1g/L,糖酸转化率为17.7%,比对照实验(菌体干重为60.3g/L,L-异亮氨酸产量为41.1 g/L,糖酸转化率为16.6%)分别提高了20.6%、29.2%和6.6%。
实施例5
采用谷氨酸棒杆菌;
培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1);
培养方法同实施例1。
发酵过程通过流加浓度为700 g/L的葡萄糖溶液(含有谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰分别为260mg/L、70mg/L、120mg/L、28mg/L、210mg/L),对照组流加浓度为700 g/L的葡萄糖溶液(含有等摩尔量的谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、氯化亚铁、氯化锌、氯化钙、氯化铜、氯化锰,含量分别为433.0mg/L、51.3mg/L、107.6mg/L、94.3 mg/L、39.1mg/L、34.4 mg/L、7.2 mg/L、45.9 mg/L)。将残糖控制在0.3-0.5%,发酵45h结束。放罐时,菌体干重达到69.9g/L,L-异亮氨酸的产量为54.2g/L,糖酸转化率为17.3%,比对照实验(菌体干重为57.1g/L,L-异亮氨酸产量为42.2 g/L,糖酸转化率为16.4%)分别提高了22.4%、28.4%和5.5%。
实施例6
采用谷氨酸棒杆菌;
培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1);
培养方法同实施例1。
发酵过程通过流加浓度为700 g/L的葡萄糖溶液(含有谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰分别为300mg/L、100mg/L、150mg/L、40mg/L、250mg/L),对照组流加浓度为700 g/L的葡萄糖溶液(含有等摩尔量的谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、氯化亚铁、氯化锌、氯化钙、氯化铜、氯化锰,含量分别为513.3mg/L、73.3mg/L、134.5mg/L、108.8mg/L、55.9mg/L、32.4 mg/L、10.2 mg/L、54.8 mg/L)。将残糖控制在0.3-0.5%,发酵45h结束。放罐时,菌体干重达到77.4g/L,L-异亮氨酸的产量为56.2g/L,糖酸转化率为17.4%,比对照实验(菌体干重为63.5g/L,L-异亮氨酸产量为44.1 g/L,糖酸转化率为16.6%)分别提高了21.9%、27.4%和4.8%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种提高L-异亮氨酸发酵产量的方法,其特征在于:采用异亮氨酸生产菌经发酵获得L-异亮氨酸,在培养基中添加氨基酸螯合微量元素,所述氨基酸螯合微量元素由谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜和谷氨酸螯合锰组成,其中,谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜和谷氨酸螯合锰的重量比为:200-300:50-100:100-150:20-40:150-250。
2.根据权利要求1所述的提高L-异亮氨酸发酵产量的方法,其特征在于:在发酵培养过程,随葡萄糖流加氨基酸螯合微量元素:谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰在葡萄糖溶液中的含量分别为200-300mg/L、50-100mg/L、100-150mg/L、20-40mg/L、150-250mg/L,葡萄糖的用量为:发酵初始培养基为30g/L,发酵过程维持葡萄糖浓度为3-5g/L,流加糖浓度为600-700g/L。
3.根据权利要求1所述的提高L-异亮氨酸发酵产量的方法,其特征在于:谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜和谷氨酸螯合锰的重量比为: 240-260:70-80:120-140:25-30:180-210。
4.根据权利要求2所述的提高L-异亮氨酸发酵产量的方法,其特征在于:具体步骤如下:
(1)谷氨酸棒杆菌从甘油管中活化至培养斜面,之后接入种子培养基中进行种子培养,得到种子液;
(2)种子液接入发酵培养基中进行培养,采用分阶段供氧模式控制溶氧:0-20 h为30-50%,20-45h为20-40%,控制pH在7.0-7.2,通过流加浓度为600-700 g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在0.3-0.5%,所述葡萄糖溶液中含有谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰的含量分别为200-300mg/L、50-100mg/L、100-150mg/L、20-40mg/L、150-250mg/L。
5.根据权利要求4所述的提高L-异亮氨酸发酵产量的方法,其特征在于:所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌CGMCC.12153。
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CN112094873B (zh) | 2021-02-02 |
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