CN109486876B

CN109486876B - 一种发酵、提取和纯化苏氨酸的方法

Info

Publication number: CN109486876B
Application number: CN201811578836.4A
Authority: CN
Inventors: 唐永强; 马延和; 王健; 汲广习; 董力青; 李航
Original assignee: Qiqihar Longjiang Fufeng Biotechnology Co ltd; Jilin University; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Qiqihar Longjiang Fufeng Biotechnology Co ltd; Jilin University; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2018-12-24
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2038-12-24
Also published as: CN109486876A

Abstract

本发明属于苏氨酸生产技术领域，公开了一种发酵、提取和纯化苏氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2）发酵液分离，步骤3）浓缩结晶，步骤4）分离晶体，步骤5）干燥，步骤6）一次母液结晶和分离，步骤7）色谱分离，步骤8）结晶和分离。本发明提取纯化工艺对苏氨酸发酵液及废母液的综合利用，不仅提高了苏氨酸收率和纯度，带来了生产上的效益，还减轻了环保压力。

Description

一种发酵、提取和纯化苏氨酸的方法

技术领域

本发明属于苏氨酸生产技术领域，具体涉及一种发酵、提取和纯化苏氨酸的方法。

背景技术

L-苏氨酸（下面简称苏氨酸）为白色结晶或结晶粉末，是一种极性氨基酸，无臭，味微甜。253℃熔化并分解。高温下溶于水，25℃溶解度为20.5g/100ml，不溶于乙醇、***和氯仿。比旋光度为27.6°-29°，等电点PI5.64。

国外苏氨酸产业发展较早，美国、法国、德国、日本等国家对苏氨酸的合成、分离、应用等方面进行了一系列的研究，特别是日本在发酵法生产苏氨酸方面有一定的优势，味之素公司是世界上最大的苏氨酸生产企业，该公司生产的苏氨酸占据全球市场60%以上的份额，味之素欧洲公司苏氨酸生产能力为3.5万吨，味之素Heetleand公司生产能力1万吨，该公司为扩大市场占有率，计划将其苏氨酸产能提高到5万吨。德国德固赛公司也是苏氨酸生产大户，并且是世界唯一能够同时生产三大氨基酸产品(蛋、赖、苏)的企业，目前其在斯洛伐克的工厂苏氨酸产能在1万吨，并计划在未来几年内将苏氨酸产能提升至2-3万吨。日本协和发酵工业公司和美国ADM公司分别拥有1万吨和5000吨的苏氨酸生产规模，此外韩国希杰公司，Cheil三星印尼公司等也生产苏氨酸。

我国苏氨酸产业发展较晚，在上世纪90年代以前国内基本没有生产，在90年代以后才开始生产。经过十年的发展，到20世纪末产量也未能突破200吨，产品的主要市场也是医药行业，主要用于各种氨基酸输液(氨基酸输液常用于手术前后的身体恢复，营养不良及慢性消耗性疾病等的辅助治疗，是临床用量很大的品种。近几年，国内生产厂家苏氨酸大部分供应国内需求，而且部分公司有向国外出口氨基酸，苏氨酸的生产无论从技术指标、成本指标、产品质量上来讲，国内生产水平还是与国外存在一定差距，产品价格总体比国外价格略高。近两年，随着生产厂家的增多，苏氨酸生产日益趋于平稳增长，逐渐减小了与国外厂家的差距。伴随着国际市场苏氨酸的广泛应用，国内的一些知名饲料企业也开始大量在饲料中应用苏氨酸，以期提高饲料的品质，进一步满足饲料业的需要。

目前，苏氨酸的生产方法主要有发酵法、蛋白质水解法和化学合成法3种，微生物发酵法生产苏氨酸，因其工艺简单，成本低廉等优点已成为目前主流方法。L-苏氨酸的主要生产菌株有黄色短杆菌和大肠杆菌。苏氨酸发酵技术目前主要存在发酵效率低下以及纯度不达标的缺陷。人们一直通过各种方法改造菌株以提高氨基酸的产量，早期应用最广泛的为各种条件下的诱变育种，而随着氨基酸生物代谢途径的揭秘，有目的的在分子水平上对代谢途径进行改造也渐渐显露其优势，另外，中游的发酵条件优化过程以及下游的回收净化过程也是一个重点。

大肠杆菌工程菌株是微生物工业发酵生产苏氨酸的主要菌株，在发酵产生 L-苏氨酸的同时，还会生成乙酸、丙氨酸、缬氨酸和精氨酸等代谢副产物，在一定程度上影响菌体生长及 L-苏氨酸的合成与积累。其中，乙酸的抑制效果尤为明显，当乙酸积累到一定浓度时，菌体的比生长速率迅速下降，产物合成大大降低，并形成恶性循环，同时外源基因的表达也受到严重影响。乙酸积累对细胞代谢造成的不利影响，是利用大肠杆菌作为宿主菌表达外源蛋白的一个不可忽视的问题。如何降低乙酸的含量，从而提高生物量以及苏氨酸产量是我们研究的重点。文献“L-苏氨酸发酵过程中乙酸的控制，发酵科技通讯2012年”在大肠杆菌发酵制备苏氨酸过程中，通过选择合适的发酵条件来控制其副产物乙酸的生成，能够降低乙酸的生成，但是降低幅度降为不明显，不能大幅提高苏氨酸的产量，并没有工业化推广的价值。申请人之前的专利技术“一种超低水份苏氨酸生产方法”记载的培养基：葡萄糖80g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵2g/L，碳酸钙0.75g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，K₂HPO₄0.2g/L，NaCl0.2g/L，pH值6.5；发酵液中苏氨酸的含量最高可达到10g/100ml，但是菌株在发酵后期死亡率较高，而且葡萄糖消耗量较大，发酵液中苏氨酸产率也有待提升。申请人之前的专利技术“一种制取颗粒型苏氨酸的方法”，通过混合发酵工艺，提高了苏氨酸的产量，但是提取工艺中，没有对母液进行提取，造成了浪费。

发明内容

在之前研究成果的基础上，本发明提出了一种发酵、提取和纯化苏氨酸的方法。该方法开发了低碳环保的生产方案，充分发挥资源优势，有效的利用了废母液，使其得到了充分的资源节约利用。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种发酵、提取和纯化苏氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2）发酵液分离，步骤3）浓缩结晶，步骤4）分离晶体，步骤5）干燥，步骤6）一次母液结晶和分离，步骤7）色谱分离，步骤8）结晶和分离。

进一步地，所述步骤1）发酵，包括：将大肠杆菌工程菌种子液按照5-10%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵时间为36h，然后按照5-10%的接种量接入莱茵衣藻，继续发酵培养48h，停止发酵，收集发酵液。

优选地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L，甘油20g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 0.01g/L，一水硫酸锰0.01g/L，pH值6.5。

进一步地，所述步骤2）发酵液分离，包括：发酵液经过碟片离心机离心，收集上层液体和沉淀；上层液体经过陶瓷膜过滤，收集滤过液，将滤过液经卧螺离心机分离，离心速度为5000rpm，离心时间为3min，收集上清液；然后经过超滤膜过滤，收集透过液。

进一步地，所述步骤3）浓缩结晶，包括：将透过液用间歇式单效浓缩结晶锅结晶。

进一步地，所述步骤4）分离晶体：用离心机进行离心，收集晶体和一次母液。

进一步地，所述步骤5）干燥，包括：分离出的晶体进行干燥，得到苏氨酸产品。

进一步地，所述步骤6）一次母液结晶和分离，包括：将一次母液进行浓缩结晶，然后离心，收集晶体和二次母液。

进一步地，所述步骤7）色谱分离，包括：二次母液利用顺序式模拟移动床进行色谱分离，得到富含苏氨酸的分离液；

进一步地，所述步骤8）结晶和分离，包括：将步骤7）所得分离液进行结晶处理，离心分离晶体，然后与步骤6）所得晶体合并，返回步骤3）中的间歇式单效浓缩结晶锅中。

本发明研究的出发点以及取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明发酵碳源选择葡萄糖和甘油，发酵前期，菌体密度低，供氧量充足，大肠杆菌优先利用葡萄糖作为碳源，可以促进菌体增殖和苏氨酸的产生；发酵中后期，葡萄糖被耗尽，此时大肠杆菌利用甘油作为碳源，由于细胞吸收甘油的速率较低，进入糖酵解的碳流下降，从而降低了乙酸的积累量，同时提高了苏氨酸的产量；

本发明通过在发酵接种莱茵衣藻，能够利用发酵液中的乙酸作为碳源进行非光和作用，而较难利用甘油作为碳源，从而解除了对大肠杆菌产苏氨酸的抑制作用，还能够进行微量的光合作用释放氧气，供大肠杆菌发酵产苏氨酸来使用。通过添加莱茵衣藻，不但能够提高苏氨酸的产量，并且菌体蛋白产量也相应提高。

本发明提取纯化工艺对苏氨酸发酵液及废母液的综合利用，不仅提高了苏氨酸收率，还减轻了环保压力，带来了生产上的效益。

说明书附图

图1：各组别在不同时间点的乙酸产量。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种发酵、提取和纯化苏氨酸的方法，其包括如下步骤：

步骤1）发酵：将大肠杆菌工程菌K12△dapA种子液（种子液的浓度为1×10⁸cfu/mL）按照10%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度30℃，罐压为0.04MPa，通气量为0.5vvm，转速为100rpm，发酵时间为36h，然后按照10%的接种量接入莱茵衣藻（莱茵衣藻的浓度为1×10⁵cfu/mL），继续发酵培养48h，停止发酵，收集发酵液；

所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L，甘油20g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 0.01g/L，一水硫酸锰0.01g/L，pH值6.5；

步骤2）发酵液分离：发酵液首先经过碟片离心机以4000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀；上层液体经过陶瓷膜（1万Da截留分子量）过滤，收集滤过液，将滤过液经卧螺离心机分离，离心速度为5000rpm，离心时间为3min，收集上清液；然后经过超滤膜过滤，收集透过液，超滤膜截留分子量为300Da；

步骤3）浓缩结晶：将透过液经过蒸发器浓缩至原液体积的1/3，用间歇式单效浓缩结晶锅结晶，当锅内料液浓缩至波美度27-30时开始加晶种，结晶过程控制温度65℃左右，真空度0.08MPa左右；当锅内晶体大小在0.7-1.8mm间时；

步骤4）分离晶体：用离心机进行离心，离心机转速由400-500r/min以10r/s的速率升至900-980r/min，然后维持900-980r/min的转速离心150s左右，最后收集晶体和一次母液；

步骤5）干燥：分离出的晶体进行干燥，得到苏氨酸产品；

步骤6）一次母液结晶和分离：将一次母液进行浓缩结晶，然后离心，收集晶体和二次母液；

步骤7）色谱分离：二次母液利用顺序式模拟移动床进行色谱分离，去除糖、盐以及色素等杂质，得到富含苏氨酸的分离液；

步骤8）结晶和分离：将步骤7）所得分离液进行结晶处理，离心分离晶体，然后与步骤6）所得晶体合并，打入步骤3）中的间歇式单效浓缩结晶锅中，进行结晶。

实施例2

一种发酵、提取和纯化苏氨酸的方法，其包括如下步骤：

步骤1）发酵：将大肠杆菌工程菌K12△dapA种子液（种子液的浓度为1×10⁸cfu/mL）按照6%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度32℃，罐压为0.04MPa，通气量为0.4vvm，转速为100rpm，发酵时间培养为48h，然后按照8%的接种量接入莱茵衣藻（莱茵衣藻的浓度为1×10⁵cfu/mL），继续发酵培养48h，停止发酵，收集发酵液；

所述发酵培养基的组分为：葡萄糖30g/L，甘油30g/L，玉米浆30g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L，一水硫酸锰0.02g/L，pH值6.8；

步骤5）干燥：分离出的晶体进行干燥，得到苏氨酸产品；

实施例3

本发明工艺中不同因素对苏氨酸产量和乙酸产量的影响：

设置组别：

实验组：实施例1；

对照组1：不添加莱茵衣藻，其余同实施例1；

对照组2：将甘油替换为同等质量的葡萄糖，其余同实施例1；

对照组3：不添加莱茵衣藻，同时将甘油替换为同等质量的葡萄糖，其余同实施例1。

各组别最终发酵液中苏氨酸和乙酸的含量见表1所示：

表1

组别	苏氨酸g/L	乙酸g/L
			实验组	137.1	0.6
对照组1	102.5	13.9
			对照组2	118.2	4.7
对照组3	96.4	15.6

结论：实验组通过对莱茵衣藻进行辅助发酵处理，能够在利用苏氨酸发酵液中的乙酸作为碳源进行非光和作用，从而解除了对大肠杆菌产苏氨酸的抑制作用，还能够进行微量的光合作用释放氧气，供大肠杆菌发酵产苏氨酸来使用；同时通过甘油替代部分葡萄糖，随着葡萄糖的消耗，大肠杆菌利用甘油作为碳源，由于细胞吸收甘油的速率较低，降低了乙酸的积累量，同时提高了苏氨酸的产量，通过各组别比较试验发现，与对照组1-3相比，本发明实验组的苏氨酸产量分别提高33.76%、15.99%、42.22%；而实验组乙酸含量仅为0.6g/L，相当于对照组1的3.85%。

本发明还检测了各组别在不同时间点的乙酸产量，以实施例1为例，分别选取发酵后，第36h，第48h，第60h，第72h，第84h，共5个时间点进行检测，具体结果见图1。实验组中，随着发酵时间的增加，乙酸含量迅速降低，解除了对苏氨酸的合成抑制，从而提高了苏氨酸的分泌量；而对照组1和3中，由于没有不添加莱茵衣藻，导致乙酸含量继续增加；对照组2中，由于添加了莱茵衣藻，使得乙酸含量逐步下降，但是下降幅度低于实验组，可能是因为实验组添加了甘油作为碳源，进入乙酸途径的碳源降低，而且莱茵衣藻较难利用甘油作为碳源，仅能利用乙酸，进而导致实验组乙酸的下降幅度更加明显。

实施例4

本发明采用新工艺流程生产的苏氨酸产品质量稳定，主要指标明显优于《饲料级L-苏氨酸》（GB/T21979-2008）的要求。经第三方测试产品性能指标如下表2：

表2

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种发酵、提取和纯化苏氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2）发酵液分离，步骤3）浓缩结晶，步骤4）分离晶体，步骤5）干燥，步骤6）一次母液结晶和分离，步骤7）色谱分离，步骤8）结晶和分离；

所述步骤1）发酵，包括：将大肠杆菌工程菌种子液按照5-10%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵时间为36h，然后按照5-10%的接种量接入莱茵衣藻，继续发酵培养48h，停止发酵，收集发酵液；所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L，甘油20g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 0.01g/L，一水硫酸锰0.01g/L，pH值6.5；

所述步骤2）发酵液分离，包括：发酵液经过碟片离心机离心，收集上层液体和沉淀；上层液体经过陶瓷膜过滤，收集滤过液，将滤过液经卧螺离心机分离，离心速度为5000rpm，离心时间为3min，收集上清液；然后经过超滤膜过滤，收集透过液；

所述步骤3）浓缩结晶，包括：将透过液用间歇式单效浓缩结晶锅结晶；

所述步骤4）分离晶体，包括：用离心机进行离心，收集晶体和一次母液；

所述步骤5）干燥，包括：将晶体进行干燥，得到苏氨酸产品；

所述步骤6）一次母液结晶和分离，包括：将一次母液进行浓缩结晶，然后离心，收集晶体和二次母液；

所述步骤7）色谱分离，包括：二次母液利用顺序式模拟移动床进行色谱分离，得到富含苏氨酸的分离液；

所述步骤8）结晶和分离，包括：将步骤7）所得分离液进行结晶处理，离心分离晶体，然后与步骤6）所得晶体合并，返回步骤3）中的间歇式单效浓缩结晶锅中。