CN103031265A - 谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产l-亮氨酸中的应用 - Google Patents

谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产l-亮氨酸中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103031265A
CN103031265A CN2013100104612A CN201310010461A CN103031265A CN 103031265 A CN103031265 A CN 103031265A CN 2013100104612 A CN2013100104612 A CN 2013100104612A CN 201310010461 A CN201310010461 A CN 201310010461A CN 103031265 A CN103031265 A CN 103031265A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leucine
corynebacterium glutamicum
fermentation
leu
mutant strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2013100104612A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103031265B (zh
Inventor
张炳荣
周群
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
XINTAI JIAHE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
XINTAI JIAHE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by XINTAI JIAHE BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical XINTAI JIAHE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority to CN201310010461.2A priority Critical patent/CN103031265B/zh
Publication of CN103031265A publication Critical patent/CN103031265A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103031265B publication Critical patent/CN103031265B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产L-亮氨酸中的应用。所述的谷氨酸棒杆菌突变株是从谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）CGMCC1.495（Leu-）出发，经DES一步诱变筛选得到的L--亮氨酸缺陷回复及α-氨基-β-羟基戊酸抗性突变株SL-0193（Leu+AHVr），保藏编号为CGMCCNo.7033 ，有效解除了目的产物L-亮氨酸对L-亮氨酸生物合成酶系的反馈调节，具有很高的L-亮氨酸生产能力，在适宜的培养条件下，摇瓶发酵48小时产L-亮氨酸32.0g/L，5L自控发酵罐发酵60小时产L-亮氨酸41.3g/L。

Description

谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产L-亮氨酸中的应用
技术领域    
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种谷氨酸棒杆菌突变株，还涉及所述谷氨酸棒杆菌突变株在发酵法生产L-亮氨酸中的应用。
背景技术   
L-亮氨酸是人体八大必需氨基酸（EAA）之一，同时又属于三种支链氨基酸（BCAA）的一种，因其特殊的结构和功能而在人类生命代谢中具有特别重要的地位，广泛应用于医药、食品、饲料、化妆品等领域。
L-亮氨酸的生产方法有蛋白质水解提取法（目前国内的主要生产方法）和植物源发酵法（目前国外的主要生产方法）。国内主要采用水解提取法，即从毛发水解提取L-胱氨酸的废母液中以邻二甲苯-4-磺酸作沉淀剂提取L-亮氨酸，不但生产环境恶劣，污染严重，而且产品中残留有毒沉淀剂，安全性差，尤其是近年来因疯牛病及禽流感事件，国际上特别是欧美发达国家对动物源产品的抵制日趋严厉，由此推动了发酵法生产L-亮氨酸的开发。
T.Takayasu et.al从乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）ATCC 13869出发，经亚硝基胍诱变处理，选育获得了No.218菌（Ile-  Met-  2-TAr），摇瓶产酸达到28g/L（Agri. Biol. Chem.,39(15)，1149～1153，1975）。
张素珍等选育得到的钝齿棒状杆菌突变株L-421（Ile- ，2-TAr），在2000升罐上发酵40小时，产L-亮氨酸20g/L（微生物学通报，1990，6，264～267）。    
刘党生等从天津短杆菌T6－13出发经紫外诱变选育得到的AHVrRifr突变株L145，摇瓶产酸32.1g/L，16L罐发酵产酸达21.8g/L（沈阳药学院学报，1994，11(2)，119～123）。
天津科技大学选育获得的黄色短杆菌突变株TK0303（Met- + IleL+ 2-TAr + α-ABr+ β-HLr+ Rifr+ SGr）,在10L罐上发酵产酸达到30g/L（CN200610013399.2），在《L-亮氨酸的发酵中试生产》一文中记载了该菌在5M3发酵罐上中试产酸最高达到26.5g/L(现代食品科技，2010，26(12)，1367～1369)。
蔡立明等选育得到的谷氨酸棒杆菌突变株JH－27（Leuhxr + 2-TAr + α-ABr+ β-HLr+ SGr），是以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌种，分别经硫酸二乙酯、亚硝基胍和紫外诱变处理筛选得到的一株抗磺胺胍和支链氨基酸结构类似物的L-亮氨酸高产菌，摇瓶产酸30～32g/L，5L发酵罐产酸40g/L（CN200510040431.1）。     
 谢希贤等报道的谷氨酸棒杆菌突变株TG8207（Met- + IleL + 2-TAr + Leuhxr + NVr+ SGr），摇瓶产酸27.2g/L，10L罐补料发酵产酸达到44.5g/L（中国食品学报，2009,9（2），29-33）。
尽管目前国内报道的L-亮氨酸菌种小试产酸水平逐年提高，但实际上我国发酵法工业化生产L-亮氨酸产量甚少，市场上销售的L-亮氨酸绝大部分是水解法产品，原因就在于缺乏遗传标记简单、培养工艺粗放、适合大规模工业化生产的L-亮氨酸优良菌种。因此,加快选育适合中国国情的粗放型L-亮氨酸优良生产菌，对于早日实现我国发酵法L-亮氨酸生产的稳定化和规模化，意义十分重大。
发明内容   
为了解决以上适合大规模工业化的粗放型L-亮氨酸优良生产菌缺乏的问题，本发明提供了一种具有很高的L-亮氨酸生产能力，遗传标记为L-亮氨酸缺陷回复及α-氨基-β-羟基戊酸抗性的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）突变株SL-0193（Leu+AHVr）,保藏编号为CGMCC No.7033。
本发明还提供了所述的谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193在发酵法生产L-亮氨酸中的应用。
所述应用包括以下步骤：
（1）将谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193接种于摇瓶种子培养基中，在往复式摇床上，31℃，96rpm振荡培养18小时，得到摇瓶种子液；
（2）将摇瓶种子液以10%比例接入摇瓶发酵培养基中，在往复式摇床上，31℃，96rpm振荡培养48小时即得；或将摇瓶种子液以10%比例接入5L罐发酵培养基中，控制发酵温度30～32℃，pH7.0～7.2，搅拌500～700rpm，通风2～3L/min，当残糖≤2%时，流加55%葡萄糖溶液，发酵60小时即得。
所述的应用，摇瓶种子培养基中含有葡萄糖30g/L，硫酸铵5g/L，玉米浆40mL/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，VH 100μg/L，VB1 200μg/L，尿素2g/L，pH为7.0～7.2。
所述的应用，摇瓶发酵培养基中含有葡萄糖135g/L，硫酸铵35g/L，玉米浆25mL/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，VH 100μg/L，VB1 200μg/L，CaCO3 40g/L，pH为7.0～7.2。
所述的应用， 5L罐发酵培养基中含有葡萄糖120g/L，硫酸铵20g/L，玉米浆25mL/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，VH 100μg/L，VB1 200μg/L，泡敌0.05g/L。
本发明的有益效果：从谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC 1.495（Leu-）出发，经DES一步诱变筛选得到L--亮氨酸缺陷回复及α-氨基-β-羟基戊酸抗性突变株SL-0193（Leu+AHVr），有效解除了目的产物L-亮氨酸对L-亮氨酸生物合成酶系的反馈调节，从而大幅度提高了L-亮氨酸的生产能力。从L-亮氨酸缺陷型（Leu-）的回复突变株（Leu+）中选育L-亮氨酸生产菌至今尚未见报道。
生物材料样品保藏信息
谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）突变株SL-0193，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7033,保藏日期为2012年12月  24日。
具体实施方式
实施例1：谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193（Leu+ AHVr）的获得
以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC 1.495（Leu-）为出发菌株，经硫酸二乙酯（DES）一步诱变处理，定向筛选出一株L--亮氨酸缺陷回复及α-氨基-β-羟基戊酸抗性突变株SL-0193（Leu+AHVr）。
诱变处理和定向筛选培养基组成如下：
完全培养基（CM）：葡萄糖5g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，用纯水定容至1L，pH7.0～7.2。
基本培养基（MM）：葡萄糖20g，硫酸铵1.5g，尿素1.5g，KH2PO4·3H2O 1g，K2HPO4 3g，MgSO4·7H2O 0.1g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，VH 20μg，VB1 100μg，琼脂20g，用纯水定容至1L，pH7.0～7.2。
筛选培养基（SM）：在基本培养基（MM）中加入3mg/mLα-氨基-β-羟基戊酸（AHV）。
摇瓶发酵培养基：葡萄糖135g/L，硫酸铵35g/L，玉米浆25mL/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，VH 100μg/L，VB1 200μg/L，CaCO3 40g/L，pH7.0～7.2。
具体选育过程如下：
  (1)诱变初筛
  在出发菌株菌悬液中加入0.5%硫酸二乙酯（DES），31℃振荡处理30min，中止处理后涂布于筛选培养基SM平板上，31℃静止培养4～6天，挑选在SM上生长的突变株单菌落转接至CM平板上，31℃静止培养24小时后进入摇瓶复筛。
  (2)摇瓶复筛
  在CM平板上生长的突变株菌苔接一环于摇瓶发酵培养基中，31℃，96rpm振荡培养48小时，然后用常规纸层析法检测突变株发酵液中积累的L-亮氨酸。
在所有突变株中，产L-亮氨酸最高的菌株为SL-0193，48小时摇瓶产酸达到32.0g/L。
 
实施例2：谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193在发酵法生产L-亮氨酸中的应用
  发酵法生产L-亮氨酸的培养基组成为：
  摇瓶种子培养基：葡萄糖30g/L，硫酸铵5g/L，玉米浆40mL/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，VH 100μg/L，VB1 200μg/L，尿素2g/L，pH7.0～7.2。
  5L罐发酵培养基：葡萄糖120g/L，硫酸铵20g/L，玉米浆25mL/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，VH 100μg/L，VB1 200μg/L，泡敌0.05g/L，pH7.0～7.2。
将谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193的CM斜面菌苔接一环于摇瓶种子培养基中，31℃，96rpm振荡培养18小时后，得到摇瓶种子液，以10%比例接入5L罐发酵培养基中通风培养，控制发酵温度30～32℃，pH7.0～7.2（流加氨水控制），转速500～700rpm，通风量2～3L/min，待残糖下降至2%以下时，流加55%葡萄糖液，发酵时间为60小时，产L-亮氨酸41.3g/L。
  所使用的摇瓶种子培养基、摇瓶发酵培养基、5L罐发酵培养基并不仅仅限于上述实施例中所提到的，只要是能够达到培养的目的，本领域普通技术人员根据菌种培养常识所能够进行的培养基成分的变换，都是可以用于上述实施例中的，都是在本发明所要保护的范围之内。

Claims (6)

1.一种谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）突变株SL-0193，其特征在于
其遗传标记为L-亮氨酸缺陷回复及α-氨基-β-羟基戊酸抗性（Leu+ AHVr）,保藏编号为CGMCC No.7033。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193在发酵法生产L-亮氨酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用包括以下步骤：
（1）将谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193接种于摇瓶种子培养基中，在往复式摇床上，31℃，96rpm振荡培养18小时，得到摇瓶种子液；
（2）将摇瓶种子液以10%比例接入摇瓶发酵培养基中，在往复式摇床上，31℃，96rpm振荡培养48小时即得；或将摇瓶种子液以10%比例接入5L罐发酵培养基中，控制发酵温度30～32℃，pH7.0～7.2，搅拌500～700rpm，通风2～3L/min，当残糖≤2%时，流加55%葡萄糖溶液，发酵60小时即得。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是摇瓶种子培养基中含有葡萄糖30g/L，硫酸铵5g/L，玉米浆40mL/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，VH 100μg/L，VB1 200μg/L，尿素2g/L，pH为7.0～7.2。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征是摇瓶发酵培养基中含有葡萄糖135g/L，硫酸铵35g/L，玉米浆25mL/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，VH 100μg/L，VB1 200μg/L，CaCO3 40g/L，pH为7.0～7.2。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征是5L罐发酵培养基中含有葡萄糖120g/L，硫酸铵20g/L，玉米浆25mL/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，VH 100μg/L，VB1 200μg/L，泡敌0.05g/L。
CN201310010461.2A 2013-01-11 2013-01-11 谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产l-亮氨酸中的应用 Expired - Fee Related CN103031265B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310010461.2A CN103031265B (zh) 2013-01-11 2013-01-11 谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产l-亮氨酸中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310010461.2A CN103031265B (zh) 2013-01-11 2013-01-11 谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产l-亮氨酸中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103031265A true CN103031265A (zh) 2013-04-10
CN103031265B CN103031265B (zh) 2014-04-16

Family

ID=48018667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310010461.2A Expired - Fee Related CN103031265B (zh) 2013-01-11 2013-01-11 谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产l-亮氨酸中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103031265B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105274180A (zh) * 2015-10-28 2016-01-27 新疆阜丰生物科技有限公司 一种利用顺序式模拟移动床色谱连续提取亮氨酸的方法
CN108138192A (zh) * 2015-08-25 2018-06-08 Cj第制糖株式会社 产生l-亮氨酸的微生物以及使用其产生l-亮氨酸的方法
CN108841758A (zh) * 2018-07-13 2018-11-20 大连医诺生物股份有限公司 谷氨酸棒杆菌突变株及其在l-亮氨酸生产中的应用
CN109486875A (zh) * 2018-12-19 2019-03-19 新疆阜丰生物科技有限公司 一种生产l-亮氨酸的发酵工艺
CN109517857A (zh) * 2018-12-19 2019-03-26 新疆阜丰生物科技有限公司 一种发酵和提取纯化l-亮氨酸的方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106754807B (zh) * 2016-12-29 2020-10-30 廊坊梅花生物技术开发有限公司 生产l-亮氨酸菌株和生产l-亮氨酸的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1702168A (zh) * 2005-06-06 2005-11-30 无锡晶海氨基酸有限公司 一种l－亮氨酸高产菌及用其发酵法生产l－亮氨酸
CN1834227A (zh) * 2006-03-30 2006-09-20 天津科技大学 黄色短杆菌突变株及用于发酵法生产l－亮氨酸的生产工艺

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1702168A (zh) * 2005-06-06 2005-11-30 无锡晶海氨基酸有限公司 一种l－亮氨酸高产菌及用其发酵法生产l－亮氨酸
CN1834227A (zh) * 2006-03-30 2006-09-20 天津科技大学 黄色短杆菌突变株及用于发酵法生产l－亮氨酸的生产工艺

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
谢希贤，等: "L-亮氨酸高产菌TGL8207的定向选育及其发酵过程研究", 《中国食品学报》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108138192A (zh) * 2015-08-25 2018-06-08 Cj第制糖株式会社 产生l-亮氨酸的微生物以及使用其产生l-亮氨酸的方法
US10351859B2 (en) 2015-08-25 2019-07-16 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing L-leucine and method for producing L-leucine using the same
CN105274180A (zh) * 2015-10-28 2016-01-27 新疆阜丰生物科技有限公司 一种利用顺序式模拟移动床色谱连续提取亮氨酸的方法
CN105274180B (zh) * 2015-10-28 2019-02-05 新疆阜丰生物科技有限公司 一种利用顺序式模拟移动床色谱连续提取亮氨酸的方法
CN108841758A (zh) * 2018-07-13 2018-11-20 大连医诺生物股份有限公司 谷氨酸棒杆菌突变株及其在l-亮氨酸生产中的应用
CN109486875A (zh) * 2018-12-19 2019-03-19 新疆阜丰生物科技有限公司 一种生产l-亮氨酸的发酵工艺
CN109517857A (zh) * 2018-12-19 2019-03-26 新疆阜丰生物科技有限公司 一种发酵和提取纯化l-亮氨酸的方法
CN109486875B (zh) * 2018-12-19 2021-06-29 新疆阜丰生物科技有限公司 一种生产l-亮氨酸的发酵工艺
CN109517857B (zh) * 2018-12-19 2021-06-29 新疆阜丰生物科技有限公司 一种发酵和提取纯化l-亮氨酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103031265B (zh) 2014-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103031265B (zh) 谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产l-亮氨酸中的应用
CN102517239B (zh) 具有提高的l-缬氨酸生产能力的微生物及利用该微生物生产l-缬氨酸的方法
CN107267427B (zh) 一种苏氨酸母液回收利用方法
KR960016135B1 (ko) L-이소로이신(l-isoleucine)의 제조법
CN104480058B (zh) 一株高产l‑亮氨酸工程菌及其应用
CN1261627A (zh) L－谷氨酸产生菌和生产l－谷氨酸的方法
CN104230004A (zh) 一种处理谷氨酸发酵废水的生物制剂
CN108138192A (zh) 产生l-亮氨酸的微生物以及使用其产生l-亮氨酸的方法
CN104261631A (zh) 一种处理谷氨酸发酵废水的环保工艺
JPH03232497A (ja) 発酵法によるｌ―グルタミンの製造方法
CN101245362B (zh) 发酵法生产多肽类抗生素安来霉素的方法
CN104276732A (zh) 利用生物制剂处理苏氨酸发酵废水的环保工艺
CN102154160A (zh) 一种产l-精氨酸的菌株和利用该菌株生产l-精氨酸的方法
CN110373359A (zh) 一种白色链霉菌X-18及利用该菌生产ε-聚赖氨酸的方法
CN104388341B (zh) 一种胶质芽孢杆菌菌株及其在海藻降解中的应用
CN105950529B (zh) 产3-羟基丙酸的重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及应用
CN1049689C (zh) 通过发酵制备ｌ－谷氨酸的方法
CN104232552A (zh) 一种清洁生产谷氨酸钠的环保工艺
CN103535525A (zh) 一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法
CN113817635A (zh) 一种利用大豆乳清废水培养芽孢杆菌的方法
CN110656065B (zh) 一株生产ε-聚赖氨酸的链霉菌及其应用
CN109161507B (zh) 一种高产l-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌及其应用
CN103060244A (zh) 一种海洋芽孢杆菌及利用该菌生产过氧化氢酶的方法
CN101186934A (zh) 基于根霉菌的l-乳酸铵的连续生产方法
CN109136096B (zh) 一种苏氨酸废母液的分离和使用工艺

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20140416

Termination date: 20160111

EXPY Termination of patent right or utility model