CN102796779A - 生物法制备γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物法制备γ-氨基丁酸的方法，包括菌体制备、生产γ-氨基丁酸、脱色、电渗析、制成γ-氨基丁酸粉剂产品或γ-氨基丁酸晶体产品等步骤。本发明利用游离乳酸菌细胞催化合成γ-氨基丁酸，并改进生产工艺，使γ-氨基丁酸产量提高，成本降低，而且还建立了制备高纯度γ-氨基丁酸的方法。本工艺中反应体系里不含有碳源、氮源等培养成分，相对于发酵液而言反应液成分简单，可大幅度提高产品纯度，同时具有后处理简单、生产周期短及环境污染小、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备γ-氨基丁酸的方法。
背景技术
γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA），又称氨酪酸，是一种天然存在的非蛋白质组成氨基酸，广泛分布于原核和真核生物中。γ-氨基丁酸是哺乳动物中枢神经***的抑制性传递物质，具有镇静神经、促进睡眠、降低血压、健脑益智、延缓衰老、健肝利肾等重要的生理功能。
至今为止，γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法和生物法两种。常见的化学合成方法是如以吡咯烷酮作为原料，经氢氧化钙、碳酸氢铵水解制得γ-氨基丁酸。化学合成法成本较高，得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是强腐蚀、有毒溶剂。因此，化学合成法制备的γ-氨基丁酸很难在食品工厂实现，制品也不能被认为是一种天然食品添加剂。生物法相比较来说是一种既安全、成本又低的方法。根据最新专利报道，生物法生产γ-氨基丁酸的菌种有（1）天然原始菌株，包括短乳杆菌（专利号 ZL 200510049187.5）、曲霉（公开号 CN 101302480 B）、植物乳杆菌（公开号 CN 101928679 A）、乳酸菌（公开号 CN 1243101 C）或天然食材富集（公开号 CN 1840672 A）；（2）重组菌：大肠杆菌（公开号 CN 1298860 C）、谷氨酸棒杆菌（公开号 CN 101945997 A）（3）诱变菌株： 短乳杆菌（公开号 CN 102174449 A）。现有方法中，γ-氨基丁酸多产生于发酵液中，由于发酵液成分复杂，下游分离纯化过程繁琐，目标产物的浓度也较低，这些因素限制了国内工业化生产，而关于制备高纯度γ-氨基丁酸更是鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法简便、易操作，效果好的生物法制备γ-氨基丁酸的方法。
本发明的技术解决方案是：
一种生物法制备γ-氨基丁酸的方法，其特征是：包括下列步骤：
（1）菌体制备：
在培养基中添加1-30g/L的谷氨酸钠作为诱导剂，进行诱导产酶，接入产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株进行培养；培养条件为：培养温度25～35℃，发酵过程中通过补加碱液进行pH控制，使发酵液pH维持在4.5-7.0范围内，培养时间8～24小时；培养结束后得到菌液；
（2）陶瓷膜过滤收集菌体：将步骤（1）得到的菌液经过陶瓷膜过滤收集菌体，膜孔径为0.05-1μm，得到菌体；
（3）生产γ-氨基丁酸：
配制0.01-0.5mol/L pH3-7的缓冲液，加入10-100g/L菌体细胞，分批加入底物谷氨酸钠，添加浓度为0-30g/L，在反应温度为28-40℃的条件下，通过再次发酵来生产γ-氨基丁酸，发酵时间为10-50h；发酵结束后，通过离心收集清液；
（4）将步骤（3）得到的清液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细胞，得到清液；
（5）脱色：先将步骤（4）得到的清液pH调至7.0-8.0，然后通过颗粒活性炭柱进行脱色处理，收集清液；
（6）电渗析：采用电渗析去除杂质，控制料液pH为7.0-8.0，在电导率下降至≤1000μs/cm时，停止循环，收集γ-氨基丁酸清液；
（7）将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，制成γ-氨基丁酸粉剂产品或γ-氨基丁酸晶体产品。
所述制成γ-氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤：
（a）真空浓缩：采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至γ-氨基丁酸含量为≥80g/L时，停止浓缩，收集浓缩液；
（b）喷雾干燥：在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为5-50%，进行喷雾干燥，制得质量含量为20-50%的γ-氨基丁酸粉剂产品。
所述制成γ-氨基丁酸晶体产品的方法是：将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，经过离子交换树脂处理；然后将料液pH调至γ-氨基丁酸等电点，通过降温结晶，得到γ-氨基丁酸晶体产品。
步骤（1）所述产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株为乳酸菌或希氏乳杆菌。
步骤（1）所使用的培养基的组成及以g/L计的含量为：
葡萄糖10-30，酵母膏 5-30，蛋白胨.5-30，乙酸钠0.5-5，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾0.05-10，硫酸镁0.05-10，硫酸锰0.05-1，PPE聚醚消泡剂0.1-3。
所述离子交换树脂先选用阴离子交换树脂，以去除残留的底物谷氨酸钠，再经过酸性阳离子交换树脂，对γ-氨基丁酸进行吸附、洗脱处理。
所述阴离子交换树脂为D301、D296或201型强碱或弱碱性阴离子交换树脂；所述阳离子交换树脂是001或D113型强酸或弱酸性阳离子交换树脂。
结晶采用等电点降温结晶法，将经离子交换树脂处理后得到的料液进行结晶或添加乙醇进行结晶，添加比例为乙醇：料液=0～10：1V/V；结晶时调节溶液pH值至γ-氨基丁酸的等电点7.2，温度降温范围为90～5℃，晶种的添加量为0. 2-10g/L，搅拌速率为30-100r/min，降温速率为1-10℃/h。
本发明利用游离乳酸菌细胞催化合成γ-氨基丁酸，并改进生产工艺，使γ-氨基丁酸产量提高，成本降低，而且还建立了制备高纯度γ-氨基丁酸的方法。本工艺中反应体系里不含有碳源、氮源等培养成分，相对于发酵液而言反应液成分简单，可大幅度提高产品纯度，同时具有后处理简单、生产周期短及环境污染小、成本低等优点。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是本发明一个实施例工业化制备过程中γ-氨基丁酸生成曲线。
图2是用乳酸菌细胞转化生成γ-氨基丁酸的转化液的氨基酸检测结果。Glu：谷氨酸；GABA：γ-氨基丁酸。
具体实施方式
本发明的γ-氨基丁酸是指4-氨基丁酸，是哺乳动物中枢神经***抑制性递质。作为新资源食品，可添加到饮料、可可制品、巧克力和巧克力制品、糖果、焙烤食品、膨化食品中，开发新型产品。
实施例1：
一、菌体培养
乳酸菌菌种经活化后，进行一级种子培养，二级种子培养，最后进入发酵罐培养，接种量3%（V/V，种子液/发酵液）， 30℃静置培养16 h，发酵过程中通过补加碱液进行pH控制，使发酵液pH维持在4.5-7.0范围内，通过0.6μm陶瓷膜过滤收集菌体。
种子培养基原料以g/L计：葡萄糖10，酵母膏 5，蛋白胨5，乙酸钠0.5，磷酸氢二钠（或磷酸氢二钾）1，硫酸镁1，硫酸锰1，PPE聚醚消泡剂0.1（但不仅限于此消泡剂，可选用任何可用于发酵工业的消泡剂）。
发酵培养基配方以g/L计：葡萄糖10，酵母膏 5，蛋白胨5，乙酸钠0.5，谷氨酸钠1，磷酸氢二钠（或磷酸氢二钾）1，硫酸镁1，硫酸锰1，PPE聚醚消泡剂0.1（但不仅限于此消泡剂，可选用任何可用于发酵工业的消泡剂）。
二、生产γ-氨基丁酸
采用乳酸菌细胞转化法生产γ-氨基丁酸，反应条件为：配制0.01mol/L pH7的醋酸-醋酸钠缓冲液，加入20g/L菌体细胞，分批加入底物谷氨酸钠，初始底物浓度10g/L，每4h添加一次底物，添加浓度为5g/L，总反应底物浓度为25g/L，反应温度为28℃，发酵时间为17h。结束后，通过离心收集清液，得到含量达12g/L的γ-氨基丁酸转化液，见图1。
三、 γ-氨基丁酸含量的检测
将上述转化液离心后加入等体积100g/L的三氯乙酸，振荡均匀，再离心（10,000×g，5 min），清液稀释2-10倍，再经0.45 μm膜过滤，进行高效液相分析。采用ODS C18（φ4.6×250nm），40oC分析，γ-氨基丁酸用外标法定量。
四、产品制备：
过滤除菌：将得到的γ-氨基丁酸转化液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细胞，得到清液；
脱色：将过滤除菌后得到的清液pH调至7.0-8.0，然后通过颗粒活性炭柱进行脱色处理，收集清液；
电渗析：采用电渗析去除杂质，控制料液pH为7.0-8.0，在电导率下降至≤1000μs/cm时，停止循环，收集γ-氨基丁酸清液；
将步骤（4）得到的γ-氨基丁酸清液，制成γ-氨基丁酸粉剂产品或γ-氨基丁酸晶体产品。
所述制成γ-氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤：
（a）真空浓缩：采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至γ-氨基丁酸含量为≥50g/L时，停止浓缩；
（b）喷雾干燥：浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为5-50%，进行喷雾干燥，制得质量含量为20-50%的γ-氨基丁酸粉剂产品；
所述制成γ-氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤：
（a）真空浓缩：采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至γ-氨基丁酸含量为≥80g/L时，停止浓缩，收集浓缩液；
（b）喷雾干燥：在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为5-50%，进行喷雾干燥，制得质量含量为20-50%的γ-氨基丁酸粉剂产品。
所述制成γ-氨基丁酸晶体产品的方法是：将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，经过离子交换树脂处理；然后将料液pH调至γ-氨基丁酸等电点，通过降温结晶，得到纯度达到98%的γ-氨基丁酸晶体产品。
实施例2：
一种生物法制备γ-氨基丁酸的方法，包括下列步骤：
（1）菌体制备：
在培养基中添加谷氨酸钠，添加量为1-30g/L（例1 g/L、15 g/L、30 g/L）的作为诱导剂，进行诱导产酶，接入产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株进行培养；培养条件为：培养温度25～35℃（例25℃、30℃、35℃），发酵过程中通过补加碱液进行pH控制，使发酵液pH维持在4.5-7.0范围内，培养时间8～24小时（例8h、16h、24h）；培养结束后得到菌液；
（2）陶瓷膜过滤收集菌体：将步骤（1）得到的菌液经过陶瓷膜过滤收集菌体，膜孔径为0.05-1μm（例0.05μm、0.5μm、1μm），得到菌体；
（3）生产γ-氨基丁酸：
配制0.01-0.5mol/L（例0.01 mol/L、0.2 mol/L、0.5 mol/L） pH3-7（例3、5、7）的缓冲液，加入菌体细胞，菌体细胞加入量为10-100g/L（例10 g/L、50 g/L、100 g/L），分批加入底物谷氨酸钠，添加浓度为1-30g/L（例1g/L、15 g/L、30 g/L），在反应温度为28-40℃（例28℃、32℃、40℃）的条件下，通过再次发酵来生产γ-氨基丁酸，发酵时间为10-50h（例10h、25h、50h）；发酵结束后，通过离心收集清液；
（4）将步骤（3）得到的清液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细胞，得到清液；
（5）脱色：先将步骤（4）得到的清液pH调至7.0-8.0，然后通过颗粒活性炭柱进行脱色处理，收集清液；
（6）电渗析：采用电渗析去除杂质，控制料液pH为7.0-8.0，在电导率下降至≤1000μs/cm时，停止循环，收集γ-氨基丁酸清液；
（7）将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，制成γ-氨基丁酸粉剂产品或γ-氨基丁酸晶体产品。
所述制成γ-氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤：
（a）真空浓缩：采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至γ-氨基丁酸含量为≥80g/L时，停止浓缩，收集浓缩液；
（b）喷雾干燥：在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为5-50%（例5%、30%、50%），进行喷雾干燥，制得质量含量为20-50%的γ-氨基丁酸粉剂产品。
所述制成γ-氨基丁酸晶体产品的方法是：将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，经过离子交换树脂处理；然后将料液pH调至γ-氨基丁酸等电点，通过降温结晶，得到γ-氨基丁酸晶体产品。
步骤（1）所述产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株为乳酸菌或希氏乳杆菌。
步骤（1）所使用的培养基的组成及以g/L计的含量为：
葡萄糖10-30（例10、20、30），酵母膏 5-30（例5、20、30），蛋白胨.5-30（例5、20、30），乙酸钠0.5-5（例0.5、3、5），磷酸氢二钠或磷酸氢二钾0.05-10（例0.05、5、10），硫酸镁0.05-10（例0.05、5、10），硫酸锰0.05-1（例0.05、0.5、1），PPE聚醚消泡剂0.1-3（例0.1、1、3）。
所述离子交换树脂先选用阴离子交换树脂，以去除残留的底物谷氨酸钠，再经过酸性阳离子交换树脂，对γ-氨基丁酸进行吸附、洗脱处理。
所述阴离子交换树脂为D301、D296或201型强碱或弱碱性阴离子交换树脂；所述阳离子交换树脂是001或D113型强酸或弱酸性阳离子交换树脂。
结晶采用等电点降温结晶法，将经离子交换树脂处理后得到的料液进行结晶或添加乙醇进行结晶，添加比例为乙醇：料液=0～10：1V/V（例1:1、5:1、10:1）；结晶时调节溶液pH值至γ-氨基丁酸的等电点7.2，温度降温范围为90～5℃（例90℃、40℃、5℃），晶种的添加量为0. 2-10g/L（例0.2 g/L、5 g/L、10 g/L），搅拌速率为30-100r/min，降温速率为1-10℃/h（例1℃/h、5℃/h、10℃/h）。
Claims (8)
1. 一种生物法制备γ-氨基丁酸的方法，其特征是：包括下列步骤：
（1）菌体制备：
在培养基中添加1-30g/L的谷氨酸钠作为诱导剂，进行诱导产酶，接入产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株进行培养；培养条件为：培养温度25～35℃，发酵过程中通过补加碱液进行pH控制，使发酵液pH维持在4.5-7.0范围内，培养时间8～24小时；培养结束后得到菌液；
（2）陶瓷膜过滤收集菌体：将步骤（1）得到的菌液经过陶瓷膜过滤收集菌体，膜孔径为0.05-1μm，得到菌体；
（3）生产γ-氨基丁酸：
配制0.01-0.5mol/L pH3-7的缓冲液，加入10-100g/L菌体细胞，分批加入底物谷氨酸钠，添加浓度为0-30g/L，在反应温度为28-40℃的条件下，通过再次发酵来生产γ-氨基丁酸，发酵时间为10-50h；发酵结束后，通过离心收集清液；
（4）将步骤（3）得到的清液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细胞，得到清液；
（5）脱色：先将步骤（4）得到的清液pH调至7.0-8.0，然后通过颗粒活性炭柱进行脱色处理，收集清液；
（6）电渗析：采用电渗析去除杂质，控制料液pH为7.0-8.0，在电导率下降至≤1000μs/cm时，停止循环，收集γ-氨基丁酸清液；
（7）将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，制成γ-氨基丁酸粉剂产品或γ-氨基丁酸晶体产品。
2. 根据权利要求1所述的生物法制备γ-氨基丁酸的方法，其特征是：所述制成γ-氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤：
（a）真空浓缩：采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至γ-氨基丁酸含量为≥80g/L时，停止浓缩，收集浓缩液；
（b）喷雾干燥：在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为5-50%，进行喷雾干燥，制得质量含量为20-50%的γ-氨基丁酸粉剂产品。
3. 根据权利要求1所述的生物法制备γ-氨基丁酸的方法，其特征是：所述制成γ-氨基丁酸晶体产品的方法是：将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，经过离子交换树脂处理；然后将料液pH调至γ-氨基丁酸等电点，通过降温结晶，得到γ-氨基丁酸晶体产品。
4. 根据权利要求1、2或3所述的生物法制备γ-氨基丁酸的方法，其特征是：步骤（1）所述产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株为乳酸菌或希氏乳杆菌。
5. 根据权利要求1、2或3所述的生物法制备γ-氨基丁酸的方法，其特征是：步骤（1）所使用的培养基的组成及以g/L计的含量为：
葡萄糖10-30，酵母膏 5-30，蛋白胨.5-30，乙酸钠0.5-5，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾0.05-10，硫酸镁0.05-10，硫酸锰0.05-1，PPE聚醚消泡剂0.1-3。
6. 根据权利要求3所述的生物法制备γ-氨基丁酸的方法，其特征是：所述离子交换树脂先选用阴离子交换树脂，以去除残留的底物谷氨酸钠，再经过酸性阳离子交换树脂，对γ-氨基丁酸进行吸附、洗脱处理。
7. 根据权利要求6所述的生物法制备γ-氨基丁酸的方法，其特征是：所述阴离子交换树脂为D301、D296或201型强碱或弱碱性阴离子交换树脂；所述阳离子交换树脂是001或D113型强酸或弱酸性阳离子交换树脂。
8. 根据权利要求3所述的生物法制备γ-氨基丁酸的方法，其特征是：结晶采用等电点降温结晶法，将经离子交换树脂处理后得到的料液进行结晶或添加乙醇进行结晶，添加比例为乙醇：料液=0～10：1V/V；结晶时调节溶液pH值至γ-氨基丁酸的等电点7.2，温度降温范围为90～5℃，晶种的添加量为0. 2-10g/L，搅拌速率为30-100r/min，降温速率为1-10℃/h。
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| CN (1) | CN102796779B (zh) |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102978250A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-03-20 | 江苏久吾高科技股份有限公司 | 一种利用谷氨酸离心母液生产γ-氨基丁酸的的方法 |
| CN104531795A (zh) * | 2015-01-13 | 2015-04-22 | 北京格力森生物工程技术有限公司 | 一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法 |
| CN104561160A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-29 | 南通励成生物工程有限公司 | 生物法制备茶氨酸的方法 |
| CN105671098A (zh) * | 2016-04-06 | 2016-06-15 | 河南巨龙生物工程股份有限公司 | 一种发酵法生产l-2-氨基丁酸的方法 |
| CN106417533A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-02-22 | 昆明理工大学 | 一种γ‑氨基丁酸饼干的制备方法 |
| CN106417480A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-02-22 | 昆明理工大学 | 一种富含γ‑氨基丁酸的面包的生产工艺 |
| CN106544372A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-03-29 | 广西多得乐生物科技有限公司 | 一种从发酵液中纯化γ‑氨基丁酸的方法 |
| CN107252021A (zh) * | 2017-07-10 | 2017-10-17 | 秦皇岛长胜营养健康科技有限公司 | 降低动脉内中膜厚度作用的芦笋饮品及其制备方法和应用 |
| CN107326052A (zh) * | 2017-06-28 | 2017-11-07 | 岭南师范学院 | 一种以d101大孔吸附树脂提高谷氨酸脱羧酶活性的方法 |
| CN107827765A (zh) * | 2016-12-05 | 2018-03-23 | 南通励成生物工程有限公司 | 一种γ‑氨基丁酸半水合物晶体及其制备方法 |
| CN108300742A (zh) * | 2017-07-26 | 2018-07-20 | 南通励成生物工程有限公司 | 一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法 |
| CN109369431A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-02-22 | 沧州信联化工有限公司 | 一种γ-氨基丁酸的结晶方法 |
| CN109761832A (zh) * | 2019-03-05 | 2019-05-17 | 内蒙古精晶生物科技有限公司 | 一种4-氨基丁酸的纯化方法 |
| CN115322450A (zh) * | 2022-08-25 | 2022-11-11 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种组合物及其制备方法和用途 |
| CN116655485A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-08-29 | 山东福瑞达生物科技有限公司 | 一种γ-氨基丁酸转化提取的工艺 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1683544A (zh) * | 2005-03-07 | 2005-10-19 | 浙江大学 | 一种生物合成γ－氨基丁酸的方法 |
| CN101333548A (zh) * | 2008-06-26 | 2008-12-31 | 南昌大学 | 利用短乳杆菌制备γ-氨基丁酸的方法 |
| CN101838672A (zh) * | 2010-05-10 | 2010-09-22 | 江南大学 | 固定化植物乳杆菌生产γ-氨基丁酸的方法 |
| CN102108370A (zh) * | 2010-12-02 | 2011-06-29 | 中国农业大学 | 利用乳酸菌生产γ-氨基丁酸的半连续发酵方法 |
| CN102174449A (zh) * | 2011-03-04 | 2011-09-07 | 天津科技大学 | 一种高产γ-氨基丁酸的生产方法及应用 |
| CN102199636A (zh) * | 2011-04-13 | 2011-09-28 | 王健 | γ-氨基丁酸的高效制备工艺 |
-
2012
- 2012-08-24 CN CN2012103045965A patent/CN102796779B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1683544A (zh) * | 2005-03-07 | 2005-10-19 | 浙江大学 | 一种生物合成γ－氨基丁酸的方法 |
| CN101333548A (zh) * | 2008-06-26 | 2008-12-31 | 南昌大学 | 利用短乳杆菌制备γ-氨基丁酸的方法 |
| CN101838672A (zh) * | 2010-05-10 | 2010-09-22 | 江南大学 | 固定化植物乳杆菌生产γ-氨基丁酸的方法 |
| CN102108370A (zh) * | 2010-12-02 | 2011-06-29 | 中国农业大学 | 利用乳酸菌生产γ-氨基丁酸的半连续发酵方法 |
| CN102174449A (zh) * | 2011-03-04 | 2011-09-07 | 天津科技大学 | 一种高产γ-氨基丁酸的生产方法及应用 |
| CN102199636A (zh) * | 2011-04-13 | 2011-09-28 | 王健 | γ-氨基丁酸的高效制备工艺 |
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102978250A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-03-20 | 江苏久吾高科技股份有限公司 | 一种利用谷氨酸离心母液生产γ-氨基丁酸的的方法 |
| CN102978250B (zh) * | 2012-12-20 | 2014-07-30 | 江苏久吾高科技股份有限公司 | 一种利用谷氨酸离心母液生产γ-氨基丁酸的方法 |
| CN104561160A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-29 | 南通励成生物工程有限公司 | 生物法制备茶氨酸的方法 |
| CN104531795A (zh) * | 2015-01-13 | 2015-04-22 | 北京格力森生物工程技术有限公司 | 一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法 |
| CN105671098A (zh) * | 2016-04-06 | 2016-06-15 | 河南巨龙生物工程股份有限公司 | 一种发酵法生产l-2-氨基丁酸的方法 |
| CN106544372A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-03-29 | 广西多得乐生物科技有限公司 | 一种从发酵液中纯化γ‑氨基丁酸的方法 |
| CN106417533A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-02-22 | 昆明理工大学 | 一种γ‑氨基丁酸饼干的制备方法 |
| CN106417480A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-02-22 | 昆明理工大学 | 一种富含γ‑氨基丁酸的面包的生产工艺 |
| CN106417480B (zh) * | 2016-11-21 | 2019-11-08 | 昆明理工大学 | 一种富含γ-氨基丁酸的面包的生产工艺 |
| CN107827765A (zh) * | 2016-12-05 | 2018-03-23 | 南通励成生物工程有限公司 | 一种γ‑氨基丁酸半水合物晶体及其制备方法 |
| CN107326052A (zh) * | 2017-06-28 | 2017-11-07 | 岭南师范学院 | 一种以d101大孔吸附树脂提高谷氨酸脱羧酶活性的方法 |
| CN107326052B (zh) * | 2017-06-28 | 2020-12-22 | 岭南师范学院 | 一种以d101大孔吸附树脂提高谷氨酸脱羧酶活性的方法 |
| CN107252021A (zh) * | 2017-07-10 | 2017-10-17 | 秦皇岛长胜营养健康科技有限公司 | 降低动脉内中膜厚度作用的芦笋饮品及其制备方法和应用 |
| CN108300742A (zh) * | 2017-07-26 | 2018-07-20 | 南通励成生物工程有限公司 | 一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法 |
| CN109369431A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-02-22 | 沧州信联化工有限公司 | 一种γ-氨基丁酸的结晶方法 |
| CN109369431B (zh) * | 2018-11-30 | 2021-06-18 | 沧州信联化工有限公司 | 一种γ-氨基丁酸的结晶方法 |
| CN109761832A (zh) * | 2019-03-05 | 2019-05-17 | 内蒙古精晶生物科技有限公司 | 一种4-氨基丁酸的纯化方法 |
| CN115322450A (zh) * | 2022-08-25 | 2022-11-11 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种组合物及其制备方法和用途 |
| CN115322450B (zh) * | 2022-08-25 | 2023-12-08 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种组合物及其制备方法和用途 |
| CN116655485A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-08-29 | 山东福瑞达生物科技有限公司 | 一种γ-氨基丁酸转化提取的工艺 |
| CN116655485B (zh) * | 2023-06-14 | 2024-01-23 | 山东福瑞达生物科技有限公司 | 一种γ-氨基丁酸转化提取的工艺 |
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Effective date of registration: 20220325 Address after: 226010 No. 333, Xinxing East Road, development zone, Nantong City, Jiangsu Province Patentee after: Nantong Licheng Biotechnology Co.,Ltd. Address before: No. 333, Xinxing East Road, development zone, Nantong City, Jiangsu Province, 226000 Patentee before: NANTONG LICHENG BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. |
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Denomination of invention: Method for preparing g-aminobutyric acid by biological method Effective date of registration: 20220831 Granted publication date: 20131120 Pledgee: Industrial Bank Co.,Ltd. Shanghai Putuo sub branch Pledgor: Nantong Licheng Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2022310000220 |
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Date of cancellation: 20231023 Granted publication date: 20131120 Pledgee: Industrial Bank Co.,Ltd. Shanghai Putuo sub branch Pledgor: NANTONG LICHENG BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd.|Nantong Licheng Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2022310000220 |