CN111139273B - 一种制备、分离和提取l-色氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于L‑色氨酸生产技术领域,公开了一种制备、分离和提取L‑色氨酸的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:步骤1)发酵,步骤2)陶瓷膜过滤,步骤3)色谱分离,步骤4)脱色,步骤5)浓缩蒸发,步骤6)离心、烘干。本发明L‑色氨酸料液经陶瓷膜过滤、顺序式模拟移动床色谱分离、脱色罐脱色等工序等环节,极大的去除料液杂质,产品纯度与收率大幅上升。
Description
技术领域
本发明属于L-色氨酸生产技术领域,具体涉及一种制备、分离和提取L-色氨酸的方法。
背景技术
L-色氨酸的分子式为C11H12O2N2,分子量为204.21,含氮13.72%。L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸,呈绢丝光泽、六角片状自色晶体,无臭,有甜味,在水中溶解度1.14g/L(25℃),溶于稀酸或稀碱,在碱液中较稳定,强酸中分解,微溶于乙醇,不溶于氯仿、***。
L-色氨酸是人和动物生命活动中八大必需氨基酸之一,对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用,被称为第二必需氨基酸。在生物体内,从L-色氨酸出发可合成5一羟基色胺、吲哚乙酸、烟酸、色素、生物碱和辅酶等生物活性物质。在临床上主要用于医药,它在神经***中的含量与神经的兴奋和抑制状态有关,从而促进睡眠和精神安定,用做保健食品和安神药。L-色氨酸也是一些植物蛋白中比较缺乏的氨基酸,用它强化食品和饲料添加剂对提高植物蛋白的利用率具有重要作用。它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸。另外,L-色氨酸还有防霉、消毒以及阻止氧化的作用,可以作为鱼类保鲜剂。
近年来,L-色氨酸作为必需氨基酸,价格一直较高,在工业生产中常常会受到生产成本的制约,而在生产成本的构成中,生产、分离提取等成本占例权重最大。因此研究提高L-色氨酸生产和提取收率的方法具有重要的理论意义和实用价值。
发明内容
申请人之前的专利技术“一种提高L-色氨酸生产效率的方法”对发酵工艺进行了优化,提高了发酵效率。在此基础上,申请人进一步进行了分离和提取,以获得高纯度高收率的L-色氨酸产品。
为解决上述问题,本发明提供了一种制备、分离和提取L-色氨酸的方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
一种制备、分离和提取L-色氨酸的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:步骤1)发酵,步骤2)陶瓷膜过滤,步骤3)色谱分离,步骤4)脱色,步骤5)浓缩蒸发,步骤6)离心、烘干。
具体地,所述方法包括如下步骤:
步骤1)发酵:以5-12%的接种量将产L-色氨酸的大肠杆菌种子液接入到装有发酵培养基的发酵罐中,培养温度36-37℃,溶氧量为20-30%,通过数控自动流加氨水维持罐内***pH在6.8-7.2,流加消泡剂消泡;总发酵时间为40-42h,得到发酵液;
步骤2)陶瓷膜过滤:将发酵液加热升温至50℃后,通过陶瓷膜过滤,收集过滤液,截留物经板框压滤、烘干得饲料蛋白粉;
步骤3)色谱分离:将步骤2)所得过滤液经顺序式模拟移动床色谱分离得到提取液,色谱分离过程产生废液统一打往肥料车间进行处理;
步骤4)脱色:色谱分离得到的提取液进入脱色罐进行脱色;
步骤5)浓缩蒸发:将步骤4)所得脱色液进入双效蒸发器,得到浓缩液;
步骤6)离心、烘干:将浓缩液结晶离心、烘干得到高纯度的L-色氨酸。
优选地,所述步骤1)发酵,还包括如下步骤:
当发酵至12h时,将营养液A流加进发酵罐内,直至发酵结束;
当发酵至24h时,将营养液B流加进罐内,直至发酵结束;
所述营养液A的组分包括六水合氯化钴;
营养液B的组分包括葡萄糖,吲哚,肌醇,苯丙氨酸以及酪氨酸。
优选地,所述步骤2)中,陶瓷膜的截留分子量为1万Da,过滤温度50℃。
优选地,所述顺序式模拟移动床色谱的参数为:流量5m3/h,温度50℃,压差0.5MPa。
优选地,所述营养液A的组分包括六水合氯化钴和脲。
更优选地,所述营养液A的组分为:六水合氯化钴10-30mg/L,脲5-20g/L,其余为水。
更优选地,所述营养液B的组分为:葡萄糖100g/L,吲哚1g/L,肌醇0.5g/L,苯丙氨酸0.3-0.8g/L,酪氨酸0.2-0.7g/L,其余为水。
最优选地,所述营养液A的组分为:六水合氯化钴20mg/L,脲10g/L,其余为水。
最优选地,所述营养液B的组分为:葡萄糖100g/L,吲哚1g/L,肌醇0.5g/L,苯丙氨酸0.5g/L,酪氨酸0.4g/L,其余为水。
本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性:
本发明从大肠杆菌合成芳香族氨基酸的通路出发,采用多种方式通过对代谢途径进行调节,相互协同,提高了色氨酸的产量和产酸速率;
本发明通过在发酵中期添加苯丙氨酸和酪氨酸,此时芳香族氨基酸的产量处于快速积累过程中,会对分枝酸向预苯酸转化产生反馈抑制作用,从而使得分枝酸更多地流向邻氨基苯甲酸途径,使得色氨酸产量提高;
与其他金属离子相比较,钴离子对DAHP合成酶构象的影响更大,可作为酶的激活剂来使用,本研究发现,发酵初期添加钴离子对DAHP合成酶的活性影响有限,并不能提高色氨酸的产量,可能是发酵初期,芳香族氨基酸合成途径并未启动,此时酶的分泌量也相对较少,选择在色氨酸大量合成的时间点来添加钴离子,能够有效色氨酸的产量。
在发酵初期添加脲,其主要作为无机氮源供菌株增殖使用,并不会对DAHP合成酶的活性造成影响,而发酵至12h时,菌株增殖放缓,此时以合成代谢物为主,通过添加脲,能够提高DAHP合成酶的活性,从而促进芳香族氨基酸合成途径的代谢流增大,进而促进色氨酸产量的增加。
本发明采用顺序式模拟移动床色谱技术提取L-色氨酸,与传统的三串联离子交换法相比,酸碱消耗与水耗大大降低,在生产的过程中交换介质树脂可以再生重复利用,生产过程节能环保,减少了环境的污染。
本发明在生产的过程中将产生的废液制成饲料蛋白粉和有机肥,整个生产过程没有污染物的排放,绿色环保。
本发明L-色氨酸料液经陶瓷膜过滤、顺序式模拟移动床色谱分离、脱色罐脱色等工序等环节,极大的去除了盐分和其它氨基酸,产品纯度与收率大幅上升。
附图说明
图1:苯丙氨酸和酪氨酸对色氨酸产量的影响;
图2:苯丙氨酸和酪氨酸对发酵产酸速率的影响;
图3:六水合氯化钴浓度对色氨酸产量的影响;
图4:脲浓度对色氨酸产量的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种提高L-色氨酸生产效率的方法,其包括如下步骤:
发酵培养基的组分为:葡萄糖20g/L,磷酸氢二钾9g/L,酵母膏5g/L,柠檬酸4.6g/L,硫酸铵1.8g/L,七水硫酸镁1.6g/L,氯化胆碱0.4g/L,七水硫酸亚铁65mg/L,生物素0.2mg/L;营养液A的组分为:六水合氯化钴20mg/L,脲10g/L;
营养液B的组分为:葡萄糖100g/L,吲哚1g/L,肌醇0.5g/L,苯丙氨酸0.5g/L,酪氨酸0.4g/L;
以大肠杆菌菌株E.coli TRTH为例,以8%的接种量将种子液(OD600值为11.2)接入到装有600L发酵培养基的1000L发酵罐中,培养温度36.8℃,溶氧量为20%,通过数控自动流加25%氨水维持罐内***pH在7.0-7.2,流加消泡剂消泡;总发酵时间为42h,得到L-色氨酸发酵液。
当发酵至12h时,将营养液A流加进发酵罐内,按每L发酵液计,流加速度为0.01ml/min,直至发酵结束;
当发酵至24h时,将营养液B流加进罐内,维持罐内糖浓度为1g/L,直至发酵结束。
实施例2
一种提高L-色氨酸生产效率的方法,其包括如下步骤:
发酵培养基的组分为:葡萄糖20g/L,磷酸氢二钾9g/L,酵母膏5g/L,柠檬酸4.6g/L,硫酸铵1.8g/L,七水硫酸镁1.6g/L,氯化胆碱0.4g/L,七水硫酸亚铁65mg/L,生物素0.2mg/L;
营养液A的组分为:六水合氯化钴30mg/L,脲15g/L;
营养液B的组分为:葡萄糖100g/L,吲哚1g/L,肌醇0.5g/L,苯丙氨酸0.4g/L,酪氨酸0.3g/L;
以大肠杆菌菌株E.coli TRTH为例,以8%的接种量将种子液(OD600值为11.8)接入到装有600L发酵培养基的1000L发酵罐中,培养温度36.8℃,溶氧量为20%,通过数控自动流加25%氨水维持罐内***pH在7.0-7.2,流加消泡剂消泡;总发酵时间为40h,得到L-色氨酸发酵液。
当发酵至12h时,将营养液A流加进发酵罐内,按每L发酵液计,流加速度为0.008ml/min,直至发酵结束;
当发酵至24h时,将营养液B流加进罐内,维持罐内糖浓度为1g/L,直至发酵结束。
对比例1
一种提高L-色氨酸生产效率的方法,其包括如下步骤:
发酵培养基的组分为:葡萄糖20g/L,磷酸氢二钾9g/L,酵母膏5g/L,柠檬酸4.6g/L,硫酸铵1.8g/L,七水硫酸镁1.6g/L,氯化胆碱0.4g/L,七水硫酸亚铁65mg/L,生物素0.2mg/L;
营养液的组分为:葡萄糖100g/L,吲哚1g/L,肌醇0.5g/L;
以大肠杆菌菌株E.coli TRTH为例,以8%的接种量将种子液(OD600值为11.2)接入到装有600L发酵培养基的1000L发酵罐中,培养温度36.8℃,溶氧量为20%,通过数控自动流加25%氨水维持罐内***pH在7.0-7.2,流加消泡剂消泡;总发酵时间为42h,得到L-色氨酸发酵液。
当发酵至24h时,将营养液流加进罐内,维持罐内糖浓度为1g/L,直至发酵结束。
实施例3
一种分离和提取L-色氨酸的方法,其包括如下步骤:
1)以实施例1制备的发酵液为例;
2)将发酵液加热升温至50℃后,通过陶瓷膜过滤,截留分子量为1万Da,过滤温度50℃,压力1.5Mpa,过滤液进入提取工序,截留物经板框压滤、烘干得饲料蛋白粉。
3)将步骤2)所得过滤液经顺序式模拟移动床色谱分离得到提取液,顺序式模拟移动床色谱控制参数:流量5m3/h,温度50℃,压差0.5MPa;经色谱分离过程进入脱色工序中,色谱分离过程产生废液统一打往肥料车间进行处理。
4)色谱分离后的提取液进入脱色工序,开始用脱色罐回流脱色液至清晰为止,待滤液透光率达到50%后,清液入清液暂存罐待用。
5)将步骤4)所得清液进入双效蒸发器,浓缩3倍,得到浓缩液。
6)将浓缩液结晶离心、烘干后的得到高纯度的L-色氨酸。
经测定L-色氨酸指标:
L-色氨酸含量:99.4% 比旋度[α]:-31.3
pH值:6.5 干燥失重:0.3
粗灰分:0.4
实施例4
验证苯丙氨酸和酪氨酸对色氨酸产量和发酵产酸速率的影响,方式1:在发酵培养基中添加苯丙氨酸0.5g/L,酪氨酸0.4g/L;方式2:在营养液中添加苯丙氨酸0.5g/L,酪氨酸0.4g/L;如图1所示,方式2选择在营养液中添加苯丙氨酸和酪氨酸,色氨酸产量和发酵产酸速率均高于方式1,该营养液是在发酵中期添加,此时,芳香族氨基酸的产量处于快速积累过程中,此时添加苯丙氨酸和酪氨酸,会对分枝酸向预苯酸转化产生反馈抑制作用,从而使得分枝酸更多地流向邻氨基苯甲酸途径,使得色氨酸产量提高;而方式1在发酵培养基中添加,发酵初期芳香族氨基酸的积累较少,苯丙氨酸和酪氨酸对分枝酸向预苯酸转化的反馈抑制并未启动,此时添加苯丙氨酸和酪氨酸会被菌体细胞吸收利用,对色氨酸合成的正向调节效果并不佳。
在上述研究的基础上,选择在营养液B中添加苯丙氨酸和酪氨酸;进一步探讨六水合氯化钴对色氨酸产量的影响;钴离子能够影响DAHP合成酶的构象,作为酶的激活剂来使用,本研究发现,发酵初期添加钴离子对DAHP合成酶的活性影响有限,并不能提高色氨酸的产量,可能是发酵初期,芳香族氨基酸合成途径并未启动,此时酶的分泌量也相对较少;因此,我们选择在色氨酸大量合成的时间点来添加钴离子,考虑到过大量营养液的添加会对发酵液造成稀释作用,设定每L发酵液计,流加速度为0.01ml/min较为合适,在该流速下,设置浓度分别为1,2.5,5,10,20,30,40,60,80(mg/L);如图3所示,随着六水合氯化钴浓度的增加,色氨酸产量也所有提高,20-30mg/L时对色氨酸影响最大,继续增大浓度并没有明显改变,当浓度为60mg/L以上后,色氨酸产量反而有所下降,过大量的钴离子可能对菌株生长造成抑制。
选择六水合氯化钴的浓度为20mg/L,添加时机为发酵至12h时,按每L发酵液计,流加速度为0.01ml/min;验证脲添加时机和添加浓度对色氨酸产量的影响,申请人尝试在发酵培养基中添加脲,对色氨酸产量没有影响,发酵初期添加脲,其主要作为无机氮源供菌株增殖使用,并不会对DAHP合成酶的活性造成影响,而发酵至12h时,菌株增殖放缓,此时以合成代谢物为主,通过添加脲,能够提高DAHP合成酶的活性,从而促进芳香族氨基酸合成途径的代谢流增大,进而促进色氨酸产量的增加,设置脲的浓度分别为1,5,10,15,20,25,30(g/L);如图4所示,随着脲浓度的增加,色氨酸产量也所有提高,当增大10g/L后,增幅放缓,然后趋于平稳。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍,但并非对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员应该明白,这对本领域技术人员而言应该很明确,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明保护的范围。
Claims (5)
1.一种制备、分离和提取L-色氨酸的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:步骤1)发酵,步骤2)陶瓷膜过滤,步骤3)色谱分离,步骤4)脱色,步骤5)浓缩蒸发,步骤6)离心、烘干;
所述方法包括如下步骤:
步骤1)发酵:以5-12%的接种量将产L-色氨酸的大肠杆菌种子液接入到装有发酵培养基的发酵罐中,培养温度36-37℃,溶氧量为20-30%,通过流加氨水维持罐内***pH在6.8-7.2,流加消泡剂消泡;总发酵时间为40-42h,得到发酵液;
步骤2)陶瓷膜过滤:将发酵液加热升温至50℃后,通过陶瓷膜过滤,收集过滤液,截留物经板框压滤、烘干得饲料蛋白粉;
步骤3)色谱分离:将步骤2)所得过滤液经顺序式模拟移动床色谱分离得到提取液,色谱分离过程产生废液统一打往肥料车间进行处理;
步骤4)脱色:色谱分离得到的提取液进入脱色罐进行脱色;
步骤5)浓缩蒸发:将步骤4)所得脱色液进入双效蒸发器进行蒸发浓缩,得到浓缩液;
步骤6)离心、烘干:将浓缩液经过结晶、离心、烘干得到高纯度的L-色氨酸;
所述步骤1)发酵,还包括如下步骤:
当发酵至12h时,将营养液A流加进发酵罐内,按每L发酵液计,流加速度为0.01ml/min,直至发酵结束;
当发酵至24h时,将营养液B流加进罐内,维持罐内糖浓度为1g/L,直至发酵结束;
所述营养液A的组分包括六水合氯化钴和脲,组分为:六水合氯化钴10-30mg/L,脲5-20g/L,其余为水;
营养液B的组分包括葡萄糖,吲哚,肌醇,苯丙氨酸以及酪氨酸,组分为:葡萄糖100g/L,吲哚1g/L,肌醇0.5g/L,苯丙氨酸0.3-0.8g/L,酪氨酸0.2-0.7g/L,其余为水。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤2)中,陶瓷膜的截留分子量为1万Da,过滤温度50℃。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述顺序式模拟移动床色谱的参数为:流量5m3/h,温度50℃,压差0.5MPa。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述营养液A的组分为:六水合氯化钴20mg/L,脲10g/L,其余为水。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述营养液B的组分为:葡萄糖100g/L,吲哚1g/L,肌醇0.5g/L,苯丙氨酸0.5g/L,酪氨酸0.4g/L,其余为水。
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Application publication date: 20200512 Assignee: QIQIHAR LONGJIANG FUFENG BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Assignor: XINJIANG FUFENG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Contract record no.: X2023980054726 Denomination of invention: A method for preparing, separating, and extracting L-tryptophan Granted publication date: 20211207 License type: Common License Record date: 20231229 |