CN109371093A - 一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法 - Google Patents

一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法 Download PDF

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章惠霞
李学兵
张志�
陈惠琴
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Abstract

本发明涉及一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法，其工艺步骤为：将金色链霉菌原始菌株，用无菌水溶解稀释，然后接入孢子培养基中，摇匀，在33‑35℃温度条件下，培养17‑25小时，之后依次进行种子培养和发酵培养，即可。所述孢子培养基组成为：麸皮1.0‑1.5%，磷酸氢二钾0.003‑0.006%，淀粉1.0‑1.6%，硫酸镁0.01‑0.03%，玉米浆0.3‑0.8%，酵母粉0.03‑0.06%，碳酸钙0.01‑0.03%。本发明区别于现有技术采用斜面培养的方式采用孢子培养的方式发酵生产四环素，且采用配制培养基培养孢子，克服了斜面培养基中琼脂的影响因素，具有培养基不受原材料影响，材料易得，质量稳定的优势，用孢子液培养的菌种接入摇瓶种子，菌丝粗壮，舒展，对于各级培养液适应能力强，移入发酵罐代谢速度快，四环素分泌早，发酵周期短，发酵水平得到大幅度提高。

Description

一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法
技术领域
本发明属于生物与医药技术领域，特别是涉及一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法。
背景技术
四环素是一类大环内酯类抗生素，主要以金色链霉菌作为生产菌株。传统的发酵菌种是将冷冻管菌种制备成斜面孢子，然后再由孢子接种于种子培养基中，由生长良好的种子无菌接种于发酵培养基中。其中斜面培养基采用麸皮做主要的碳源及微量元素供给，琼脂作为凝固剂，以无机磷酸盐提供磷及少量氮源。按上述培养基配方制备的菌种存在以下缺陷：
(1)麸皮作为孢子发芽生长的唯一碳源提供者，其质量受小麦生产产地、加工方法影响非常不稳定，琼脂虽然作为凝固剂，但对四环素斜面孢子生长有特殊的影响，其成分复杂难易准确判定，所以斜面外观质量受其影响波动较大。
(2)因近些年，工业开发，环境污染日趋严重，麸皮及琼脂质量受生长条件及环境影响，越来越不稳定，造成制备的生产菌种质量不稳定；
(3)麸皮等原材料质量变化，造成新选育出的菌种发生变化，采用上述配方已与新菌种生产不适宜，制备的菌种从外观质量到内在孢子活力均受到影响。
发明内容
本发明目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种不受原材料影响，材料易得，质量稳定，所制得的孢子菌丝粗壮，各级培养液适应能力强，发酵水平明显提高的金色链霉菌发酵生产四环素方法。
为实现上述发明目的所采取的技术方案为：
一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法，其特征在于其工艺步骤为：将金色链霉菌原始菌株，用无菌水溶解稀释，然后接入孢子培养基中，摇匀，在33-35℃温度条件下，培养17-25小时，之后依次进行种子培养和发酵培养，即可。
所述孢子培养基组成为：麸皮1.0-1.5％，磷酸氢二钾0.003-0.006％，淀粉1.0-1.6％，硫酸镁0.01-0.03％，玉米浆0.3-0.8％，酵母粉0.03-0.06％，碳酸钙0.01-0.03％。
所述种子培养和发酵培养采用常规技术。
本发明区别于现有技术采用斜面培养的方式采用孢子培养的方式发酵生产四环素，且采用配制培养基培养孢子，克服了斜面培养基中琼脂的影响因素，具有培养基不受原材料影响，材料易得，质量稳定的优势，用孢子液培养的菌种接入摇瓶种子，菌丝粗壮，舒展，对于各级培养液适应能力强，移入发酵罐代谢速度快，四环素分泌早，发酵周期短，发酵水平得到大幅度提高。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例中摇瓶种子培养基组成为：
淀粉2.0-4.0％，豆粉1.5-2.5％，酵母粉0.3-1.0％，蛋白胨0.3-1.0％，硫酸铵0.1-0.5％，溴化钠0-0.5％，碳酸钙0.1-0.5％，硫酸镁0.01-0.04％，磷酸二氢钾0-0.03％。
发酵培养基组成为：
淀粉4.0-10.0％，豆粉1.5-2.5％，酵母粉0.3-1.0％，硫酸铵0.3-1.0％，溴化钠0-0.5％，碳酸钙0.3-0.8％，糊精1.5-3.0％，玉米浆0.3-1.0％，M-促进剂0.001-0.003％
四环素原始菌株(金色链霉菌)：选择储存于-70±5℃的深冷冰箱的冷冻管菌株。
实施例1(重复三组)
1、孢子培养基制备：
孢子培养基配方：麸皮1.0％，磷酸氢二钾0.003％，淀粉1.0％，硫酸镁0.01％，玉米浆0.3％，酵母粉0.03％，碳酸钙0.01％。
制备方法：将以上物料(碳酸钙除外)溶解后盛装于固定容器中，将碳酸钙加入充分溶解，搅拌均匀后，控制pH在7.2左右，分装于500ml的三角瓶中,每瓶盛装120ml。进行灭菌控制灭菌温度117-121℃，压力0.08-0.12MPa，灭菌20-25min，灭菌后pH在6.4-6.7。
2、孢子培养：
取四环素原始菌株(金色链霉菌)1支，加入1ml无菌水摇匀吸取0.5ml，在无菌条件下接入上述孢子培养基中，摇匀，在33-35℃温度条件下，培养17-25小时。
3、摇瓶种子培养：
将过程2)所得孢子液，接种于已灭菌的摇瓶种子培养基(淀粉2.0％，豆粉1.5％，酵母粉0.3％，蛋白胨0.3％，硫酸铵0.1％，溴化钠0.1％，碳酸钙0.1％，硫酸镁0.01％)上，保持32-33℃温度，培养22-28小时，目测种子液外观稠黄挂壁。
4、发酵培养：
将已培养好的种子液无菌移入已灭菌好的摇瓶发酵培养基(淀粉4.0％，豆粉1.5％，酵母粉0.3％，硫酸铵0.3％，溴化钠0.1％，碳酸钙0.3％，糊精1.5％，玉米浆0.3％，M-促进剂0.001％)中，全程控制温度在31-33℃，无菌培养150-170小时。
5、对照批：
5.1传统的斜面配方：琼脂2.0-3.0％，麸皮3.0-5.0％，磷酸二氢钾0.005-0.008％、磷酸氢二铵0.008-0.02％。
5.2培养基配制：按上述比例将琼脂、麸皮分别称量盛放于茄形瓶中。
5.3将磷酸二氢钾、磷酸氢二铵按配制体积计算称量，分别用纯化水溶解后，盛装于量筒中，加水稀释至刻度，充分摇匀。
5.4将5.3配制好的溶液分装于5.2的装有琼脂和麸皮的茄形瓶中。
5.5无菌空白培养基制备：将5.4所得的茄形瓶培养基放于灭菌锅，保温(118-122℃)保压(0.008-0.012MPa)30min，结束后冷却至40-50℃，敷制成斜面备用。
5.6取冻干管菌种一支，加入无菌水溶解后制备成菌悬液，挑取适量菌悬液分别均匀涂抹于5.5所得空白斜面培养基上，在32-36℃环境下培养80-100小时后终止培养，冷藏备用。
5.7摇瓶种子培养：将5.6获得的斜面孢子，接入摇瓶种子培养，培养过程同实施例第三条。
5.8摇瓶发酵培养：同实施例第四条。
6、发酵结果：
第一组：
第二组：
第三组：
实施例2(重复三组)
1、孢子培养基制备：
孢子培养基配方：麸皮1.2％，磷酸氢二钾0.005％，淀粉1.2％，硫酸镁0.02％，玉米浆0.5％，酵母粉0.05％，碳酸钙0.02％。
制备方法：将以上物料(碳酸钙除外)溶解后盛装于固定容器中，将碳酸钙加入充分溶解，搅拌均匀后，控制pH在7.2左右，分装于500ml的三角瓶中,每瓶盛装120ml。进行灭菌控制灭菌温度117-121℃，压力0.08-0.12MPa，灭菌20-25min，灭菌后pH在6.4-6.7。
2、孢子制备：
取四环素原始菌株(金色链霉菌)1支，加入1ml无菌水摇匀吸取0.5ml，在无菌条件下接入上述孢子培养基中，摇匀，在33-35℃温度条件下，培养17-25小时。
3、摇瓶种子培养：
将过程2)所得孢子液，接种于已灭菌的摇瓶种子培养基(淀粉3.0％，豆粉2.0％，酵母粉0.6％，蛋白胨0.5％，硫酸铵0.2％，溴化钠0.3％，碳酸钙0.3％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.02％)上，保持32-33℃温度，培养22-28小时，目测种子液外观稠黄挂壁。
4、发酵培养：
将已培养好的种子液无菌移入已灭菌好的摇瓶发酵培养基(淀粉6.0％，豆粉2.0％，酵母粉0.6％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.25％，碳酸钙0.5％，糊精2.0％，玉米浆0.5％，M-促进剂0.002％)中，全程控制温度在31-33℃，无菌培养150-170小时。
5、对照批：(下面的过程最好细化下)
5.1传统的斜面配方：琼脂2.0-3.0％，麸皮3.0-5.0％，磷酸二氢钾0.005-0.008％、磷酸氢二铵0.008-0.02％
5.2培养基配制：按上述比例将琼脂、麸皮分别称量盛放于茄形瓶中
5.3将磷酸二氢钾、磷酸氢二铵按配制体积计算称量，分别用纯化水溶解后，盛装于量筒中，加水稀释至刻度，充分摇匀。
5.4将5.3配制好的溶液分装于5.2的装有琼脂和麸皮的茄形瓶中。
5.5无菌空白培养基制备：将5.4所得的茄形瓶培养基放于灭菌锅，保温(118-122℃)保压(0.008-0.012MPa)30min，结束后冷却至40-50℃，敷制成斜面备用。
5.6取冻干管菌种一支，加入无菌水溶解后制备成菌悬液，挑取适量菌悬液分别均匀涂抹于5.5所得空白斜面培养基上，在32-36℃环境下培养80-100小时后终止培养，冷藏备用。
5.7摇瓶种子培养：将5.6获得的斜面孢子，接入摇瓶种子培养，培养过程同实施例第三条。
5.8摇瓶发酵培养：同实施例第四条。
6、发酵结果：
第一组：
第二组：
第三组：
实施例3(重复三组)
1、孢子培养基制备：
孢子培养基配方：麸皮1.5％，磷酸氢二钾0.006％，淀粉1.6％，硫酸镁0.03％，玉米浆0.8％，酵母粉0.06％，碳酸钙0.03％。
制备方法：将以上物料(碳酸钙除外)溶解后盛装于固定容器中，将碳酸钙加入充分溶解，搅拌均匀后，控制pH在7.2左右，分装于500ml的三角瓶中,每瓶盛装120ml。进行灭菌控制灭菌温度117-121℃，压力0.08-0.12MPa，灭菌20-25min，灭菌后pH在6.4-6.7。
2、孢子培养：
取四环素原始菌株(金色链霉菌)1支，加入1ml无菌水摇匀吸取0.5ml，在无菌条件下接入上述孢子培养基中，摇匀，在33-35℃温度条件下，培养17-25小时。
3、摇瓶种子培养：
将过程2)所得孢子液，接种于已灭菌的摇瓶种子培养基(淀粉4.0％，豆粉2.5％，酵母粉1.0％，蛋白胨1.0％，硫酸铵0.5％，溴化钠0.5％，碳酸钙0.5％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.03％)上，保持32-33℃温度，培养22-28小时，目测种子液外观稠黄挂壁。
4、发酵培养：
将已培养好的种子液无菌移入已灭菌好的摇瓶发酵培养基(淀粉10.0％，豆粉2.5％，酵母粉1.0％，硫酸铵1.0％，溴化钠0.5％，碳酸钙0.8％，糊精3.0％，玉米浆1.0％，M-促进剂0.003％)中，全程控制温度在31-33℃，无菌培养150-170小时。
5、对照批：(下面的过程最好细化下)
5.1传统的斜面配方：琼脂2.0-3.0％，麸皮3.0-5.0％，磷酸二氢钾0.005-0.008％、磷酸氢二铵0.008-0.02％。
5.2培养基配制：按上述比例将琼脂、麸皮分别称量盛放于茄形瓶中
5.3将磷酸二氢钾、磷酸氢二铵按配制体积计算称量，分别用纯化水溶解后，盛装于量筒中，加水稀释至刻度，充分摇匀。
5.4将5.3配制好的溶液分装于5.2的装有琼脂和麸皮的茄形瓶中。
5.5无菌空白培养基制备：将5.4所得的茄形瓶培养基放于灭菌锅，保温(118-122℃)保压(0.008-0.012MPa)30min，结束后冷却至40-50℃，敷制成斜面备用。
5.6取冻干管菌种一支，加入无菌水溶解后制备成菌悬液，挑取适量菌悬液分别均匀涂抹于5.5所得空白斜面培养基上，在32-36℃环境下培养80-100小时后终止培养，冷藏备用。
5.7摇瓶种子培养：将5.6获得的斜面孢子，接入摇瓶种子培养，培养过程同实施例第三条。
5.8摇瓶发酵培养：同实施例第四条。
6、发酵结果：
第一组：
第二组：
第三组：

Claims (3)

1.一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法，其特征在于其工艺步骤为：将金色链霉菌原始菌株，用无菌水溶解稀释，然后接入孢子培养基中，摇匀，在33-35℃温度条件下，培养17-25小时，之后依次进行种子培养和发酵培养，即可。
2.按照权利要求1所述的金色链霉菌发酵生产四环素的方法，其特征在于所述孢子培养基组成为：麸皮1.0-1.5%，磷酸氢二钾0.003-0.006%，淀粉1.0-1.6%，硫酸镁0.01-0.03%，玉米浆0.3-0.8%，酵母粉0.03-0.06%，碳酸钙0.01-0.03%。
3.按照权利要求1所述的金色链霉菌发酵生产四环素的方法，其特征在于所述种子培养和发酵培养采用常规技术。
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