CN105483014A - 发酵法高密度培养小球藻生产工艺 - Google Patents

发酵法高密度培养小球藻生产工艺 Download PDF

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CN105483014A CN201610024683.3A CN201610024683A CN105483014A CN 105483014 A CN105483014 A CN 105483014A CN 201610024683 A CN201610024683 A CN 201610024683A CN 105483014 A CN105483014 A CN 105483014A
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Abstract

本发明公开了一种发酵法高密度培养小球藻生产工艺，首先通过异样培养对小球藻藻种进行培养，在异样培养过程的第四的阶段，选用基础培养基和流加培养基共同培养，两种培养基结合利用发酵罐对蛋白核小球藻进行高密度异养培养，以及采用半连续流加的培养方式，通过测定小球藻的生长速率、干重、蛋白质含量等方面，确定能维持藻株稳定生长的最优培养条件。实验结果表明，pH：5.5-7.5，DO≥20％，补料最佳碳氮比为：C/N＝100，补料适宜碳浓度为40-60g/L，取料量为1/5，小球藻可实现高密度稳定生长，且发酵4-5天干重能达到100g/L以上，蛋白质含量达到58g/L以上。该工艺不仅可以实现纯种培养，还能较高程度的提高藻类品质，同时还含有其他多种维生素，符合人体营养需求。

Description

发酵法高密度培养小球藻生产工艺
技术领域
本发明涉及小球藻的大规模培养技术领域，具体涉及发酵法高密度培养小球藻生产工艺。
背景技术
小球藻为绿藻门小球藻属的普生性单细胞藻类，是一种简单的光合作用有机体，最常见的蛋白核小球藻以含有丰富的蛋白质而被应用于商业开发，同时还富含多种维生素、多糖、不饱和脂肪酸、氨基酸、膳食纤维、微量元素及其它活性物质，具有抗肿瘤、抗辐射、抗感染、抗动脉粥样硬化、降血压、降血脂、防治贫血等一系列生理保健作用，是目前保健食品应用中能进行商业化生产的微藻之一。
目前，小球藻的大规模培养主要采用户外开放池，存在藻细胞密度低、品质低、易污染等问题。
发明内容
针对上述小球藻大规模培养中存在的问题，本发明提出了一种发酵法高密度培养小球藻生产工艺，该工艺采用发酵罐内流加营养物质的方式对小球藻进行异养培养，不仅可以实现纯种培养，还能较高程度的提高藻类品质，蛋白质及干重含量较高，同时还含有其他多种维生素，符合人体营养需求。
其技术解决方案包括：
一种培养小球藻的生产工艺，依次包括以下步骤：
a选取优质小球藻藻种并将其活化，接种培养，使小球藻种子液的浓度在8～11g/L；
b异样培养，包括四个阶段：
b1第一阶段：将步骤a培养至生长对数期的小球藻种子液，接入150L的种子罐中进行异样培养，其中，150L的种子罐中培养基组成如下：
葡萄糖：30-60g/L，硫酸镁：0.5-1.6g/L，柠檬酸钙：0.1-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.3-0.8g/L，硫酸亚铁：0.05-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素和水；
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5；
b2第二阶段：待第一阶段小球藻种子液培养24～32h、碳源耗尽溶氧反弹且小球藻种子液干重在20～25g/L、pH在6～7培养正常时，将其接种至1.5方罐中异样培养；反之，重新进入第一阶段培养；
该阶段的培养基组成与第一阶段种子罐中的培养基成分相同，并且，培养控制条件也与第一阶段培养控制条件相同；
b3第三阶段：待二阶段小球藻种子液培养24～32h、碳源耗尽溶氧反弹且小球藻种子液干重在20～25g/L、pH在6～7培养正常时，将其接种至17方罐中异样培养；反之，重新进入第二阶段培养；
该阶段的培养基组成与第一阶段种子罐中的培养基成分相同，并且，培养控制条件也与第一阶段培养控制条件相同；
b4第四阶段：待待三阶段小球藻种子液培养24～32h、碳源耗尽溶氧反弹且小球藻种子液干重在20～25g/L、pH在6～7培养正常时，将其接种至50方罐中异样培养；反之，重新进入第三阶段培养；
所述50方罐中的培养基分为基础培养基和流加培养基，所述流加培养基分为四次加入；
基础培养基的组成如下：
葡萄糖：50-60g/L，硫酸镁：0.8-1.6g/L，柠檬酸钙：0.2-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.4-0.8g/L，硫酸亚铁：0.08-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素和水；
流加培养基的组成如下：
葡萄糖：200g/L，硫酸镁：4g/L，柠檬酸钙：1.5g/L，磷酸钠：5g/L，磷酸氢二钾：2g/L，硫酸亚铁：0.4g/L，乙二胺四乙酸二钠：2g/L，尿素：15g/L，微量元素和水；
c诱导培养，
待第四阶段培养至碳源耗尽、溶氧反弹时，进行诱导培养，诱导温度为30～35℃，罐压：0.04～0.06MPa，风量：1.5～2.0vvm，尿素含量≥4g/L。
上述技术方案中，在异样培养阶段，依次从第一阶段到第四阶段，前三阶段的培养利于藻种的稳定生长，在第四阶段，通过基础培养基和流加培养基的配合，利于对蛋白核小球藻进行高密度异养培养，分次添加流加培养基，利于小球藻的生长。
作为本发明的一个优选方案，步骤b1中，微量元素配方为：硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L。
作为本发明的另一个优选方案，流加培养基的具体加入方式为：当发酵培养20～25h，且碳源耗尽、溶氧反弹、pH在6～7.5时，第一次加入流加培养基；当发酵培养32～38h，且碳源耗尽、溶氧反弹，pH在6～7.5时，第二次加入流加培养基；当发酵培养43～47h，且碳源耗尽、溶氧反弹，pH在6～7.5时，第三次加入流加培养基；当发酵培养53～57h，且碳源耗尽、溶氧反弹，pH在6～7.5时，第四次加入流加培养基。
优选的，步骤b4中流加培养基中微量元素的配方为：
硫酸锰：25mg/L，硫酸锌：2.5mg/L，钼酸：1.5mg/L，硫酸铜：2.5mg/L，硼酸：50mg/L。
本发明所带来的有益技术效果：
本发明发酵法高密度培养小球藻生产工艺，既能保持小球藻高密度状态，又能获得高含量的蛋白和叶绿素，为工业化生产蛋白核小球藻提供了高效的培养方法。
本发明通过流加碳源、氮源、无机盐、微量元素，能快速积累蛋白核小球藻藻体浓度，缩短异样培养周期，大幅降低生产成本。
本发明发酵法高密度培养小球藻，诱导工艺能大幅提高蛋白核小球藻蛋白含量，叶绿素含量。
附图说明
下面结合附图对本发明做进一步说明：
图1为本发明实施例1菌体干重和蛋白含量随时间变化图；
图2为本发明实施例2菌体干重和蛋白含量随时间变化图；
图3为本发明实施例3菌体干重和蛋白含量随时间变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细说明。
本发明所培养的小球藻，为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，直径3～8微米。
在上述生产工艺中的藻种是通过商业渠道购买获得的优质藻种，在配置培养基中所需的原料也可通过商业渠道购买获得。
实施例1：
本发明，小球藻的生产工艺，具体采用下述方法：
(1)将活化小球藻藻种，新接的摇瓶放入摇床中光照培养，正常培养3天后按照传代操作接入5L摇瓶培养3天为2代，继续传代，传至第3代时，在摇床中光照培养，正常培养3天后测藻液浓度达到10g/L；
(2)将步骤(1)培养生长对数期的小球藻种子液，按10％(v/v)接入150L种子罐中进行异样培养；
150L种子罐定容100L，
培养基配方为：
葡萄糖：30-60g/L，硫酸镁：0.5-1.6g/L，柠檬酸钙：0.1-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.3-0.8g/L，硫酸亚铁：0.05-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素，水；
其中微量元素配方为硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L；
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5。
(3)将步骤(2)小球藻培养24小时，碳源耗尽溶氧反弹，测定藻液干重21.5g/L，PH:7.0时，取无菌样镜检、无菌培养正常，接入1.5方罐中；
1.5方种子罐定容1方；
培养基配方：
葡萄糖：30-60g/L，硫酸镁：0.5-1.6g/L，柠檬酸钙：0.1-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.3-0.8g/L，硫酸亚铁：0.05-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素，水；
其中微量元素配方为硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L。
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5；
(4)步骤(3)小球藻培养24小时，碳源耗尽溶氧反弹时，藻液干重能达到22.5g/L，PH:6.9时，取无菌样镜检、无菌培养正常时，接入17方罐中；
17方种子定容9方；
培养基配方：
葡萄糖：30-60g/L，硫酸镁：0.5-1.6g/L，柠檬酸钙：0.1-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.3-0.8g/L，硫酸亚铁：0.05-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素，水。其中微量元素配方为硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L。
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5；
(5)步骤(4)小球藻培养24小时，碳源耗尽溶氧反弹时，藻液干重能达到21.6g/L，PH:6.8时，取无菌样镜检、无菌培养正常时，接入50方发酵罐中进行发酵培养；
50方发酵罐定容20方，培养基配方：
葡萄糖：50-60g/L，硫酸镁：0.8-1.6g/L，柠檬酸钙：0.2-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.4-0.8g/L，硫酸亚铁：0.08-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素，水；
其中微量元素配方为硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L；
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5；
(6)50方发酵罐培养24小时时，碳源耗尽，溶氧反弹，这时向其第一批次补入碳源、氮源、无机盐、微量元素；培养38小时时，碳源耗尽，溶氧反弹，这时向其第二批次补入碳源、氮源、无机盐、微量元素；培养47小时时，碳源耗尽，溶氧反弹，这时向其第三批次补入碳源、氮源、无机盐、微量元素；培养57小时时，碳源耗尽，溶氧反弹，这时向其第四批次补入碳源、氮源、无机盐、微量元素；
流加培养基：
葡萄糖：200g/L，硫酸镁：4g/L，柠檬酸钙：1.5g/L，磷酸钠：5g/L，磷酸氢二钾：2g/L，硫酸亚铁：0.4g/L，乙二胺四乙酸二钠：2g/L尿素：15g/L，微量元素，水。其中微量元素配方为硫酸锰：25mg/L，硫酸锌：2.5mg/L，钼酸：1.5mg/L，硫酸铜：2.5mg/L，硼酸：50mg/L。配制的流加培养基，平均分四次补加入50方发酵罐中；
(7)50方发酵罐第四次流加补料后，培养66小时左右时，碳源耗尽，溶氧反弹，进行诱导培养，提蛋白核小球藻蛋白、叶绿素；
诱导工艺：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，尿素含量≥8g/L；
(8)50方小球藻诱导结束后测小球藻干重，蛋白含量，叶绿素含量，如图1所示。
实施例2：
本发明，小球藻的生产工艺，具体采用下述方法：
(1)将活化小球藻藻种，新接的摇瓶放入摇床中光照培养，正常培养3天后按照传代操作接入5L摇瓶培养3天为2代，继续传代，传至第3代时，在摇床中光照培养，正常培养3天后测藻液浓度达到8g/L；
(2)将步骤(1)培养至生长对数期的小球藻种子液，按10％(v/v)接入150L种子罐中进行异样培养；
150L种子罐定容100L；
培养基配方如下：
葡萄糖：30-60g/L，硫酸镁：0.5-1.6g/L，柠檬酸钙：0.1-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.3-0.8g/L，硫酸亚铁：0.05-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素，水；
其中，微量元素配方为硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L；
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5；
(3)将步骤(2)小球藻培养32小时，碳源耗尽溶氧反弹时，藻液干重能达到20.5g/L，PH:6.7时，取无菌样镜检、无菌培养正常时，接入1.5方罐中；
1.5方种子罐定容1方；
培养基配方：
葡萄糖：30-60g/L，硫酸镁：0.5-1.6g/L，柠檬酸钙：0.1-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.3-0.8g/L，硫酸亚铁：0.05-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素，水。其中微量元素配方为硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L；
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5；
(4)步骤(3)小球藻培养32小时，碳源耗尽溶氧反弹时，藻液干重能达到22g/L，PH:6.9时，取无菌样镜检、无菌培养正常时，接入17方罐中；
17方种子定容9方；
培养基配方如下：
葡萄糖：30-60g/L，硫酸镁：0.5-1.6g/L，柠檬酸钙：0.1-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.3-0.8g/L，硫酸亚铁：0.05-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素，水；
其中，微量元素配方为硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L；
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5；
(5)步骤(4)小球藻培养24小时，碳源耗尽溶氧反弹时，藻液干重能达到22.5g/L，PH:7.0时，取无菌样镜检、无菌培养正常时，接入50方发酵罐中进行发酵培养；
50方发酵罐定容20方，培养基配方：
葡萄糖：50-60g/L，硫酸镁：0.8-1.6g/L，柠檬酸钙：0.2-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.4-0.8g/L，硫酸亚铁：0.08-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素，水；
其中微量元素配方为硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L；
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5；
(6)50方发酵罐培养20小时时，碳源耗尽，溶氧反弹，这时向其第一批次补入碳源、氮源、无机盐、微量元素；培养32小时时，碳源耗尽，溶氧反弹，这时向其第二批次补入碳源、氮源、无机盐、微量元素；培养43小时时，碳源耗尽，溶氧反弹，这时向其第三批次补入碳源、氮源、无机盐、微量元素；培养53小时时，碳源耗尽，溶氧反弹，这时向其第四批次补入碳源、氮源、无机盐、微量元素.
流加培养基：
葡萄糖：200g/L，硫酸镁：4g/L，柠檬酸钙：1.5g/L，磷酸钠：5g/L，磷酸氢二钾：2g/L，硫酸亚铁：0.4g/L，乙二胺四乙酸二钠：2g/L尿素：15g/L，微量元素，水。其中微量元素配方为硫酸锰：25mg/L，硫酸锌：2.5mg/L，钼酸：1.5mg/L，硫酸铜：2.5mg/L，硼酸：50mg/L。配制的流加培养基，平均分四次补加入50方发酵罐中；
(7)50方发酵罐第四次流加补料后，培养62小时左右时，碳源耗尽，溶氧反弹，进行诱导培养，提蛋白核小球藻蛋白、叶绿素；
诱导工艺：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，尿素含量≥8g/L；
(8)50方小球藻诱导结束后测小球藻干重，蛋白含量，叶绿素含量，如图2所示。
实施例3：
本发明，小球藻的生产工艺，具体采用下述方法：
(1)将活化小球藻藻种，新接的摇瓶放入摇床中光照培养，正常培养3天后按照传代操作接入5L摇瓶培养3天为2代，继续传代，传至第3代时，在摇床中光照培养，正常培养3天后测藻液浓度达到11g/L；
(2)将步骤(1)培养生长对数期的小球藻种子液，按10％(v/v)接入150L种子罐中进行异样培养；
150L种子罐定容100L；
培养基配方如下：
葡萄糖：30-60g/L，硫酸镁：0.5-1.6g/L，柠檬酸钙：0.1-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.3-0.8g/L，硫酸亚铁：0.05-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素，水；
其中，微量元素配方为硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L；
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5；
(3)将步骤(2)小球藻培养24小时，碳源耗尽溶氧反弹时，藻液干重能达到20.5g/L，PH:6.5时，取无菌样镜检、无菌培养正常时，接入1.5方罐中；
1.5方种子罐定容1方；
培养基配方：
葡萄糖：30-60g/L，硫酸镁：0.5-1.6g/L，柠檬酸钙：0.1-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.3-0.8g/L，硫酸亚铁：0.05-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素，水。其中微量元素配方为硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L；
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5；
(4)步骤(3)小球藻培养24小时，碳源耗尽溶氧反弹时，藻液干重能达到20.5g/L，PH:6.5时，取无菌样镜检、无菌培养正常时，接入17方罐中；
17方种子定容9方；
培养基配方：
葡萄糖：30-60g/L，硫酸镁：0.5-1.6g/L，柠檬酸钙：0.1-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.3-0.8g/L，硫酸亚铁：0.05-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素，水。其中微量元素配方为硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L；
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5；
(5)步骤(4)小球藻培养25小时，碳源耗尽溶氧反弹时，藻液干重能达到20.5g/L，PH:6.9时，取无菌样镜检、无菌培养正常时，接入50方发酵罐中进行发酵培养；
50方发酵罐定容20方，培养基配方：
葡萄糖：50-60g/L，硫酸镁：0.8-1.6g/L，柠檬酸钙：0.2-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.4-0.8g/L，硫酸亚铁：0.08-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素，水；
其中微量元素配方为硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L；
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5。
(6)50方发酵罐培养25小时时，碳源耗尽，溶氧反弹，这时向其第一批次补入碳源、氮源、无机盐、微量元素；培养35小时时，碳源耗尽，溶氧反弹，这时向其第二批次补入碳源、氮源、无机盐、微量元素；培养45小时时，碳源耗尽，溶氧反弹，这时向其第三批次补入碳源、氮源、无机盐、微量元素；培养55小时时，碳源耗尽，溶氧反弹，这时向其第四批次补入碳源、氮源、无机盐、微量元素；
流加培养基：
葡萄糖：200g/L，硫酸镁：4g/L，柠檬酸钙：1.5g/L，磷酸钠：5g/L，磷酸氢二钾：2g/L，硫酸亚铁：0.4g/L，乙二胺四乙酸二钠：2g/L尿素：15g/L，微量元素，水；
其中微量元素配方为硫酸锰：25mg/L，硫酸锌：2.5mg/L，钼酸：1.5mg/L，硫酸铜：2.5mg/L，硼酸：50mg/L，配制的流加培养基，平均分四次补加入50方发酵罐中；
(7)50方发酵罐第四次流加补料，培养65小时左右时，碳源耗尽，溶氧反弹，进行诱导培养，提蛋白核小球藻蛋白、叶绿素；
诱导工艺：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，尿素含量≥8g/L；
(8)50方小球藻诱导结束后测小球藻干重，蛋白含量，如图3所示。
本发明生产的蛋白核小球藻采用发酵罐进行异养培养，生产出的小球藻不仅蛋白质及干重含量较高，藻类品质也较高，具有广阔的市场应用前景。

Claims (4)

1.一种培养小球藻的生产工艺，其特征在于，依次包括以下步骤：
a选取优质小球藻藻种并将其活化，接种培养，使小球藻种子液的浓度在8～11g/L；
b异样培养，包括四个阶段：
b1第一阶段：将步骤a培养至生长对数期的小球藻种子液，接入150L的种子罐中进行异样培养，其中，150L的种子罐中培养基组成如下：
葡萄糖：30-60g/L，硫酸镁：0.5-1.6g/L，柠檬酸钙：0.1-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.3-0.8g/L，硫酸亚铁：0.05-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素和水；
培养控制条件：
温度：30-35℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，pH：5.5-7.5；
b2第二阶段：待第一阶段小球藻种子液培养24～32h、碳源耗尽溶氧反弹且小球藻种子液干重在20～25g/L、pH在6～7培养正常时，将其接种至1.5方罐中异样培养；反之，重新进入第一阶段培养；
该阶段的培养基组成与第一阶段种子罐中的培养基成分相同，并且，培养控制条件也与第一阶段培养控制条件相同；
b3第三阶段：待二阶段小球藻种子液培养24～32h、碳源耗尽溶氧反弹且小球藻种子液干重在20～25g/L、pH在6～7培养正常时，将其接种至17方罐中异样培养；反之，重新进入第二阶段培养；
该阶段的培养基组成与第一阶段种子罐中的培养基成分相同，并且，培养控制条件也与第一阶段培养控制条件相同；
b4第四阶段：待待三阶段小球藻种子液培养24～32h、碳源耗尽溶氧反弹且小球藻种子液干重在20～25g/L、pH在6～7培养正常时，将其接种至50方罐中异样培养；反之，重新进入第三阶段培养；
所述50方罐中的培养基分为基础培养基和流加培养基，所述流加培养基分为四次加入；
基础培养基的组成如下：
葡萄糖：50-60g/L，硫酸镁：0.8-1.6g/L，柠檬酸钙：0.2-0.5g/L，磷酸钠：1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾：0.4-0.8g/L，硫酸亚铁：0.08-0.1g/L，乙二胺四乙酸二钠：0.3-0.6g/L，尿素：3-8g/L，微量元素和水；
流加培养基的组成如下：
葡萄糖：200g/L，硫酸镁：4g/L，柠檬酸钙：1.5g/L，磷酸钠：5g/L，磷酸氢二钾：2g/L，硫酸亚铁：0.4g/L，乙二胺四乙酸二钠：2g/L，尿素：15g/L，微量元素和水；
c诱导培养，
待第四阶段培养至碳源耗尽、溶氧反弹时，进行诱导培养，诱导温度为30～35℃，罐压：0.04～0.06MPa，风量：1.5～2.0vvm，尿素含量≥4g/L。
2.根据权利要求1所述的培养小球藻的生产工艺，其特征在于：步骤b1中，微量元素配方为：硫酸锰：4.0-8mg/L，硫酸锌：0.5-0.8mg/L，钼酸：0.1-0.5mg/L，硫酸铜：0.1-0.8mg/L，硼酸：10-15mg/L。
3.根据权利要求1所述的培养小球藻的生产工艺，其特征在于：流加培养基的具体加入方式为：当发酵培养20～25h，且碳源耗尽、溶氧反弹、pH在6～7.5时，第一次加入流加培养基；当发酵培养32～38h，且碳源耗尽、溶氧反弹，pH在6～7.5时，第二次加入流加培养基；当发酵培养43～47h，且碳源耗尽、溶氧反弹，pH在6～7.5时，第三次加入流加培养基；当发酵培养53～57h，且碳源耗尽、溶氧反弹，pH在6～7.5时，第四次加入流加培养基。
4.根据权利要求1所述的培养小球藻的生产工艺，其特征在于，步骤b4中流加培养基中微量元素的配方为：硫酸锰：25mg/L，硫酸锌：2.5mg/L，钼酸：1.5mg/L，硫酸铜：2.5mg/L，硼酸：50mg/L。
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