CN110699314A - 一种发酵生产6-去甲基四环素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产6‑去甲基四环素的方法,其结构式为:
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵生产6-去甲基四环素的方法,属于工业微生物技术、发酵工程领域。
背景技术
6-去甲基四环素,四环素类抗生素,是金色链霉菌产生。6-去甲基金霉素与四环素相比,缺失了C-6位置的甲基。是6-去甲基金霉素化学合成法合成米诺环素的中间体。如直接使用发酵法生产的6-去甲基四环素作为其合成的起始原材料,不但能够提高产率,减少甲醇和钯碳等原料使用量,还能够降低副产物产生,有利于米诺环素的清洁生产。目前没有微生物发酵方法生产6-去甲基四环素的报道,无具体生产工艺。盐酸米诺环素为高效、速效、长效的半合成四环素新制剂,抗菌作用为该属中最强,抗菌谱与多西环素相似,具有高效广谱,有效剂量低,口服吸收迅速,体内分布广及长效等优点。近年来,对于其研究的深入,科学家发现了其除了有很好的抗菌作用外,还具有其它一些生物学的特征,其在抗炎症、免疫抑制、抑制皮脂分泌、抗胶原酶活性等方面也有很好的作用。而且米诺环素治疗其它疾病的新作用也被越来越多的发现以及研究,特别是在治疗类风湿关节炎上,不仅有效而且不良反应少。
米诺环素是半合成的四环素类抗生素。抗菌谱与四环素相近,具有高效和长效性质。在四环素类中该品抗菌作用最强。
鉴于此,开发了一种发酵法生产6-去甲基四环素的方法。
发明内容
本发明是为解决去6-甲基四环素发酵效价低,不适用于生产的缺陷,得到了一种新的培养基和补料配方,提高了6-去甲基四环素发酵水平的方法。
为实现提高6-去甲基四环素发酵效价,技术方法如下:
1、斜面培养基组成:
培养基组成为W/V:麸皮1.5-3%,琼脂1.5-2.5%,磷酸氢二钾0.005-0.015%,磷酸氢二铵0.005-0.015%,pH自然。
2、种子罐组成:
种子罐培养基为W/V:玉米粉1.0-2.5%,麦芽糊精1.0-2.0%,酱油豆粕粉1.5-3.5%,棉籽饼粉0.5-1.0%,玉米浆0.5-1.5%,硫酸铵0.5-1.0%,轻质碳酸钙0.5-1.0%,溴化镁0.15-0.25%,消泡剂0.01-0.03%,剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成:
发酵罐组成为W/V:玉米粉6.0-8.0%,麦芽糊精1.0-2.0%,酱油豆粕粉3.0-4.0%,棉籽饼粉0.5-1.5%,玉米浆0.5-1.5%,硫酸铵0.5-1.0%,轻质碳酸钙0.5-0.7%,溴化镁0.15-0.25%,M-促进剂0.0015-0.0025%,α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.01%,消泡剂0.01-0.03%,剩余配比均为水。pH自然。
4、补料配比:
补料配比W/V:玉米淀粉40-50%,玉米浆0.5-1.5%磷酸镁0-0.2%,溴化镁0.15-0.25%,M-促进剂0.002%,α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02%,消泡剂0.01-0.03%,pH自然。
5、使用以上培养基发酵生产去6-甲基四环素生产,通过补料进行工艺控制,其特征为:
5.1、将6-去甲基四环素产生菌金色链霉菌由沙土管接种到斜面培养基中,pH6.5-7.5,培养温度31.5℃-32.5℃,培养5-7天,至斜面孢子呈白色,孢子成熟。
5.2、将成熟孢子接入种子罐中,接种量为1个斜面/200L,培养温度31.5-32.5℃,通气量为0.6-1.2v/v/min,转速为150rpm-350rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%,培养28-36h,离心固形物含量达到20%以上即达到移种条件。
5.3、将以上合格种子转入灭后发酵罐中,种子体积/接种后的发酵罐体积=0.08,培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃,26-80h 29.5℃30.5℃,81h-放罐31.5℃-32.5℃;发酵过程使用氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1,26-80h 5.8-6.0,81h-放罐5.7-5.9,通气量0.6-1.2v/v/min,转速150rpm-550rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%。通过补加补料控制总糖浓度0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL,81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL,101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.4、0-80补加灭菌后的大豆油消泡,81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
采用上述技术方案本发明取得的技术进步是:
本发明提供的一种发酵生产6-去甲基四环素的方法,6-去甲基四环素发酵前期代谢较快,主要为菌丝生长,主要快速利用速效氮源和溶磷,同时消耗大量的氧气,需要通过提高通气比、提高搅拌转速来提高溶氧。伴随速效效氮源和溶磷的消耗完毕,温度的下调,耗氧量逐渐下降,菌体转入次级代谢,发酵液颜色转入深棕色、棕黑色,伴随氨水、补料的补入,溶氧、pH逐渐稳定,合成产物合成加速。
本发明根据6-去甲基四环素代谢特点,根据单罐产量最大化的理念,将配方中的关键物质进行调整;并通过补料添加磷酸镁,防止因玉米浆等原材料原因,造成发酵过程中溶磷浓度的变化,继续提高发酵单位。实验证明,优化后的发酵罐培养基和补料配方,能够有效提高6-去甲基四环素发酵单位,比原始发酵工艺提高774%,本发明提高6-去甲基四环素的方法比较简单,且容易实现,可以作为其他四环素类发酵的参考。
具体实施方式
附图说明
图1是本发明原发酵方法液相色谱图;
图2是6-去甲基四环素标准品液相色谱图;
图3是本发明方法6-去甲基四环素液相色谱图。
实例1:
1、斜面培养基组成:
培养基组成为W/V:麸皮1.5%,琼脂1.5%,磷酸氢二钾0.005%,磷酸氢二铵0.005%,pH自然。
2、种子罐组成:
种子罐培养基为W/V:玉米粉1.0%,麦芽糊精1.0%,酱油豆粕粉1.5%,棉籽饼粉0.5%,玉米浆0.5%,硫酸铵0.5%,轻质碳酸钙0.5%,溴化镁0.15%,消泡剂0.01%,剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成:
发酵罐组成为W/V:玉米粉6.0%,麦芽糊精1.0%,酱油豆粕粉3.0%,棉籽饼粉0.5%,玉米浆0.5%,硫酸铵0.5%,轻质碳酸钙0.5%,溴化镁0.15%,M-促进剂0.0015%,α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.01%,消泡剂0.01%,剩余配比均为水。pH自然。
4、补料配比:
补料配比W/V:玉米淀粉40%,玉米浆0.5%磷酸镁0%,溴化镁0.15%,M-促进剂0.002%,α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02%,消泡剂0.01%,pH自然。
5、使用以上培养基发酵生产6-去甲基四环素生产,通过补料进行工艺控制,其特征为:
5.1、将6-去甲基四环素产生菌金色链霉菌由沙土管接种到斜面培养基中,pH6.5-7.5,培养温度31.5℃-32.5℃,培养5-7天,至斜面孢子呈白色,孢子成熟。
5.2、将成熟孢子接入种子罐中,接种量为1个斜面/200L,培养温度31.5-32.5℃,通气量为0.6-1.2v/v/min,转速为150rpm-350rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%,培养28-36h,离心固形物含量达到20%以上即达到移种条件。
5.3、将以上合格种子转入灭后发酵罐中,种子体积/接种后的发酵罐体积=0.08,培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃,26-80h 29.5℃-30.5℃,81h-放罐31.5℃-32.5℃;发酵过程使用氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1,26-80h 5.8-6.0,81h-放罐5.7-5.9,通气量0.6-1.2v/v/min,转速150rpm-550rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%。通过补加补料控制总糖浓度0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL,81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL,101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.4、0-80补加灭菌后的大豆油消泡,81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
6、试验结果数据:
发酵周期小时 | 发酵单位微克/毫升 | |
实验例1 | 186 | 3832 |
对照例 | 186 | 623 |
实例2:
1、斜面培养基组成:
培养基组成为W/V:麸皮2.2%,琼脂2.0%,磷酸氢二钾0.01%,磷酸氢二铵0.01%,pH自然。
2、种子罐组成:
种子罐培养基为W/V:玉米粉1.7%,麦芽糊精1.5%,酱油豆粕粉2.0%,棉籽饼粉0.75%,玉米浆1.0%,硫酸铵0.75%,轻质碳酸钙0.75%,溴化镁0.20%,消泡剂0.02%,剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成:
发酵罐组成为W/V:玉米粉7.0%,麦芽糊精1.5%,酱油豆粕粉3.5%,棉籽饼粉1.0%,玉米浆1.0%,硫酸铵0.75%,轻质碳酸钙0.6%,溴化镁0.20%,M-促进剂0.0020%,α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.02%,消泡剂0.02%,剩余配比均为水。pH自然。
4、补料配比:
补料配比W/V:玉米淀粉45%,玉米浆1.0%磷酸镁0%,溴化镁0.20%,M-促进剂0.002%,α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02%,消泡剂0.02%,pH自然。
5、使用以上培养基发酵生产去6-甲基四环素生产,通过补料进行工艺控制,其特征为:
5.1、将6-去甲基四环素产生菌金色链霉菌由沙土管接种到斜面培养基中,pH6.5-7.5,培养温度31.5℃-32.5℃,培养5-7天,至斜面孢子呈白色,孢子成熟。
5.2、将成熟孢子接入种子罐中,接种量为1个斜面/200L,培养温度31.5-32.5℃,通气量为0.6-1.2v/v/min,转速为150rpm-350rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%,培养28-36h,离心固形物含量达到20%以上即达到移种条件。
5.3、将以上合格种子转入灭后发酵罐中,种子体积/接种后的发酵罐体积=0.08,培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃,26-80h 29.5℃-30.5℃,81h-放罐31.5℃-32.5℃;发酵过程使用氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1,26-80h 5.8-6.0,81h-放罐5.7-5.9,通气量0.6-1.2v/v/min,转速150rpm-550rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%。通过补加补料控制总糖浓度0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL,81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL,101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.4、0-80补加灭菌后的大豆油消泡,81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
6、试验结果数据:
发酵周期小时 | 发酵单位微克/毫升 | |
实验例2 | 186 | 4673 |
对照例 | 186 | 623 |
实例3:
1、斜面培养基组成:
培养基组成为W/V:麸皮3%,琼脂2.5%,磷酸氢二钾0.015%,磷酸氢二铵0.005-0.015%,pH自然。
2、种子罐组成:
种子罐培养基为W/V:玉米粉2.5%,麦芽糊精2.0%,酱油豆粕粉3.5%,棉籽饼粉1.0%,玉米浆1.5%,硫酸铵1.0%,轻质碳酸钙1.0%,溴化镁0.15-0.25%,消泡剂0.03%,剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成:
发酵罐组成为W/V:玉米粉8.0%,麦芽糊精2.0%,酱油豆粕粉4.0%,棉籽饼粉1.5%,玉米浆1.5%,硫酸铵1.0%,轻质碳酸钙0.7%,溴化镁0.25%,M-促进剂0.0025%,α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.01%,消泡剂0.01-0.03%,剩余配比均为水。pH自然。
4、补料配比:
补料配比W/V:玉米淀粉50%,玉米浆1.5%磷酸镁0%,溴化镁0.25%,M-促进剂0.002%,α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02%,消泡剂0.03%,pH自然。
5、使用以上培养基发酵生产去6-甲基四环素生产,通过补料进行工艺控制,其特征为:
5.1、将6-去甲基四环素产生菌金色链霉菌由沙土管接种到斜面培养基中,pH6.5-7.5,培养温度31.5℃-32.5℃,培养5-7天,至斜面孢子呈白色,孢子成熟。
5.2、将成熟孢子接入种子罐中,接种量为1个斜面/200L,培养温度31.5-32.5℃,通气量为0.6-1.2v/v/min,转速为150rpm-350rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%,培养28-36h,离心固形物含量达到20%以上即达到移种条件。
5.3、将以上合格种子转入灭后发酵罐中,种子体积/接种后的发酵罐体积=0.08,培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃,26-80h 29.5℃-30.5℃,81h-放罐31.5℃-32.5℃;发酵过程使用氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1,26-80h 5.8-6.0,81h-放罐5.7-5.9,通气量0.6-1.2v/v/min,转速150rpm-550rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%。通过补加补料控制总糖浓度0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL,81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL,101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.4、0-80补加灭菌后的大豆油消泡,81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
6、试验结果数据
发酵周期小时 | 发酵单位微克/毫升 | |
实验例3 | 186 | 4562 |
对照例 | 186 | 623 |
实例4:
1、斜面培养基组成:
培养基组成为W/V:麸皮2.2%,琼脂2.0%,磷酸氢二钾0.010%,磷酸氢二铵0.010%,pH自然。
2、种子罐组成:
种子罐培养基为W/V:玉米粉1.7%,麦芽糊精1.5%,酱油豆粕粉2.0%,棉籽饼粉0.75%,玉米浆1.0%,硫酸铵0.75%,轻质碳酸钙0.75%,溴化镁0.20%,消泡剂0.02%,剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成:
发酵罐组成为W/V:玉米粉7.0%,麦芽糊精1.5%,酱油豆粕粉3.5%,棉籽饼粉1.0%,玉米浆1.0%,硫酸铵0.75%,轻质碳酸钙0.6%,溴化镁0.20%,M-促进剂0.0020%,α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.02%,消泡剂0.02%,剩余配比均为水。pH自然。
4、补料配比:
补料配比W/V:玉米淀粉40-50%,玉米浆0.5-1.5%,磷酸镁0.10%,溴化镁0.15-0.25%,M-促进剂0.002%,α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02%,消泡剂0.01-0.03%,pH自然。
5、使用以上培养基发酵生产去6-甲基四环素生产,通过补料进行工艺控制,其特征为:
5.1、将6-去甲基四环素产生菌金色链霉菌由沙土管接种到斜面培养基中,pH6.5-7.5,培养温度31.5℃-32.5℃,培养5-7天,至斜面孢子呈白色,孢子成熟。
5.2、将成熟孢子接入种子罐中,接种量为1个斜面/200L,培养温度31.5-32.5℃,通气量为0.6-1.2v/v/min,转速为150rpm-350rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%,培养28-36h,离心固形物含量达到20%以上即达到移种条件。
5.3、将以上合格种子转入灭后发酵罐中,种子体积/接种后的发酵罐体积=0.08,培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃,26-80h 29.5℃-30.5℃,81h-放罐31.5℃-32.5℃;发酵过程使用氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1,26-80h 5.8-6.0,81h-放罐5.7-5.9,通气量0.6-1.2v/v/min,转速150rpm-550rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%。通过补加补料控制总糖浓度0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL,81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL,101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.4、0-80补加灭菌后的大豆油消泡,81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
6、试验结果数据
发酵周期小时 | 发酵单位微克/毫升 | |
实验例4 | 186 | 4825 |
对照例 | 186 | 623 |
实例5:
1、斜面培养基组成:
培养基组成为W/V:麸皮2.2%,琼脂2.0%,磷酸氢二钾0.010%,磷酸氢二铵0.010%,pH自然。
2、种子罐组成:
种子罐培养基为W/V:玉米粉1.7%,麦芽糊精1.5%,酱油豆粕粉2.0%,棉籽饼粉0.75%,玉米浆1.0%,硫酸铵0.75%,轻质碳酸钙0.75%,溴化镁0.20%,消泡剂0.02%,剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成:
发酵罐组成为W/V:玉米粉7.0%,麦芽糊精1.5%,酱油豆粕粉3.5%,棉籽饼粉1.0%,玉米浆1.0%,硫酸铵0.75%,轻质碳酸钙0.6%,溴化镁0.20%,M-促进剂0.0020%,α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.02%,消泡剂0.02%,剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成:
发酵罐组成为W/V:玉米粉7.0%,麦芽糊精1.5%,酱油豆粕粉3.5%,棉籽饼粉1.0%,玉米浆1.0%,硫酸铵0.75%,轻质碳酸钙0.6%,溴化镁0.20%,M-促进剂0.0020%,α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.02%,消泡剂0.02%,剩余配比均为水。pH自然。
4、补料配比:
补料配比W/V:玉米淀粉40-50%,玉米浆0.5-1.5%磷酸镁0.20%,溴化镁0.15-0.25%,M-促进剂0.002%,α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02%,消泡剂0.01-0.03%,pH自然。
5、使用以上培养基发酵生产去6-甲基四环素生产,通过补料进行工艺控制,其特征为:
5.1、将6-去甲基四环素产生菌金色链霉菌由沙土管接种到斜面培养基中,pH6.5-7.5,培养温度31.5℃-32.5℃,培养5-7天,至斜面孢子呈白色,孢子成熟。
5.2、将成熟孢子接入种子罐中,接种量为1个斜面/200L,培养温度31.5-32.5℃,通气量为0.6-1.2v/v/min,转速为150rpm-350rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%,培养28-36h,离心固形物含量达到20%以上即达到移种条件。
5.3、将以上合格种子转入灭后发酵罐中,种子体积/接种后的发酵罐体积=0.08,培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃,26-80h 29.5℃-30.5℃,81h-放罐31.5℃-32.5℃;发酵过程使用氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1,26-80h 5.8-6.0,81h-放罐5.7-5.9,通气量0.6-1.2v/v/min,转速150rpm-550rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%。通过补加补料控制总糖浓度0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL,81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL,101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.4、0-80补加灭菌后的大豆油消泡,81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
6、试验结果数据:
发酵周期小时 | 发酵单位微克/毫升 | |
实验例5 | 186 | 4803 |
对照例 | 186 | 623 |
Claims (5)
1.一种发酵生产6-去甲基四环素的方法,其特征在于所述生产方法如下:首先将金色链霉菌接种在斜面培养基上,待孢子成熟,转入种子培养基中培养,种子培养完成后转入发酵罐培养基中,补料培养至放罐;
所述种子罐培养基配比W/V为:玉米粉1.0-2.5%,麦芽糊精1.0-2.0%,酱油豆粕粉1.5-3.5%,棉籽饼粉0.5-1.0%,玉米浆0.5-1.5%,硫酸铵0.5-1.0%轻质碳酸钙0.5-1.0%,溴化镁0.15-0.25%,消泡剂0.01-0.03%,剩余配比均为水;
所述发酵培养基配比W/V为:玉米粉6.0-8.0%,麦芽糊精1.0-2.0%,酱油豆粕粉3.0-4.0%,棉籽饼粉0.5-1.5%,玉米浆0.5-1.5%,硫酸铵0.5-1.0%,轻质碳酸钙0.5-1.0%,溴化镁0.15-0.25%,M-促进剂0.0015-0.0025%,α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.01%,消泡剂0.01-0.03%,剩余配比为水;
所述补料配比W/V为:玉米淀粉40-50%,玉米浆0.5-1.5%,磷酸镁0.0-0.20%,溴化镁0.15-0.25%,M-促进剂0.002%,α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02%,消泡剂0.01-0.03%,剩余配比均为水。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产6-去甲基四环素的方法,其特征在于:所述种子培养条件,特征为:培养温度31.5℃-32.5℃,通气量为0.6-1.0v/v/min,搅拌转速150rpm-350rpm,罐压0.04Mpa,控制溶氧高于20%,培养28-36h。
3.根据权利要求1所述的一种发酵生产6-去甲基四环素的方法,其特征在于:所述发酵培养条件,特征为:培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃,26-80h 29.5℃-30.5℃,81h-放罐31.5℃-32.5℃;发酵过程补加氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1,26-80h 5.8-6.0,81h-放罐5.7-5.9,通气量0.6-1.2v/v/min,转速为150rpm-550rpm,罐压为0.04Mpa,控制溶氧高于20%。
4.根据权利要求1所述的一种发酵生产6-去甲基四环素的方法,其特征在于:所述补料方法,特征为:补加补料控制发酵培养基中总糖,当总糖下降到4.5g/100mL以下,补加补料,0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL,81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL,101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.根据权利要求1所述的一种发酵生产6-去甲基四环素的方法,其特征在于:所述发酵培养过程中,0-80补加灭菌后的大豆油消泡,81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
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