CN106676150A - 一种褐黄袍链霉菌发酵生产纳他霉素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种褐黄袍链霉菌发酵生产纳他霉素的方法，包括：1)将褐黄袍链霉菌孢子液活化；2)将所述步骤1)活化后的褐黄袍链霉菌孢子液接种于种子培养基中进行种子培养，得到褐黄袍链霉菌；3)将所述步骤2)得到的褐黄袍链霉菌接种于发酵培养基中进行有氧发酵培养，得到纳他霉素。本发明采用适宜的培养基配比，并在基础料中添加增效剂，菌丝体在均衡的碳氮比和无机盐离子环境下生长活性大大提高，无需一味加大动力条件，菌丝体更加快速的适应培养液的环境，迟缓期缩短，从而发酵周期缩短。整个发酵周期为79～82h，最终褐黄袍链霉菌菌丝体浓度为44～45％，纳他霉素的含量为6.9～7g/L。

Description

一种褐黄袍链霉菌发酵生产纳他霉素的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种褐黄袍链霉菌纳他霉素的发酵生产方法。
背景技术
纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗生素，由链霉菌属的纳塔尔链霉菌、褐黄袍链霉菌等菌在好氧条件下发酵产生的次级代谢产物，可以抑制酵母菌和丝状真菌的生长以及真菌毒素的产生，已被广泛应用于食品防腐(食品级)以及真菌引起的疾病治疗(医用级)。目前国际上允许使用的生物防腐剂仅为乳酸链球菌素、纳他霉素和聚赖氨酸三种，其中纳他霉素作为一种高效、安全、无毒、低剂量的生物防腐剂，已被全球包括美国在内的50多个国家使用，成为全球性范围内广泛使用的食品添加剂，具有巨大的商业价值。
在目前的纳他霉素生产中，发酵周期较长以及发酵水平较低成为急需解决的两个问题，发酵周期过长，导致生产成本过高，发酵水平低导致最终产品量较少。针对这两个问题，通常采用的解决办法是提高发酵起始的动力条件，在发酵液中添加过量营养物质，尤其是碳氮源，从而在一定程度上缩短发酵周期，提高产品水平。
现有的解决方法中，加大发酵液中营养物质的量虽然会在一定程度上提高发酵水平，但是过量的营养物质会使碳氮比失衡，菌丝体在过量的营养物质中会影响其生长活性，从而影响发酵菌浓和产品含量；而加大发酵起始的动力条件，比如提高通气量，加大搅拌等，使生产成本大大提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种褐黄袍链霉菌发酵生产纳他霉素的方法，缩短发酵周期，并提高纳他霉素产量。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种褐黄袍链霉菌发酵生产纳他霉素的方法，包括以下步骤：
1)将褐黄袍链霉菌孢子液活化；
2)将所述步骤1)活化后的褐黄袍链霉菌孢子接种于种子培养基中进行种子培养，得到褐黄袍链霉菌；
3)将所述步骤2)得到的褐黄袍链霉菌接种于发酵培养基中进行有氧发酵培养，得到纳他霉素；
所述步骤3)中发酵培养基包括：葡萄糖60.0±1.0g/L、中温黄豆饼粉2.0±0.5g/L、棉籽饼粉2.0±0.5g/L、酵母粉10.0±1.0g/L、玉米浆15.0±1.0g/L、氯化钠0.5±0.1g/L、硫酸镁0.2±0.1g/L、豆油10.0±1.0g/L、SCH-1型增效剂5.0±0.5g/L、碳酸钙5.0±0.5g/L和余量的水。
优选的，所述步骤2)中的种子培养基包括：葡萄糖20.0±1.0g/L、酵母粉3.0±0.5g/L、蛋白胨5.0±0.5g/L、玉米浆5.0±0.5g/L、氯化钠10.0±1.0g/L、磷酸二氢钾0.5±0.1g/L、碳酸钙5.0±0.5g/L和余量的水。
优选的，所述步骤2)中的种子培养的条件为：摇床转速：210-230rpm，培养温度为25～30℃，培养时间为20～26h，初始pH值为6.9～7.0。
优选的，按体积百分比计，所述步骤3)中发酵培养的接种量为发酵培养基体积的7.5～8.5％。
优选的，按体积百分比计，所述步骤3)中发酵培养基的起始添加量为发酵罐体积的65～75％。
优选的，所述步骤3)中发酵培养的条件为：培养温度为25～30℃，起始通气量为0.25～0.35VVM，起始搅拌速度为140～160rpm，起始pH值为6.4～6.6，发酵全程维持发酵罐压力为0.04～0.06MPa。
优选的，所述步骤3)中发酵培养过程中发酵液的溶氧量在30％以上。
优选的，所述步骤3)中发酵培养过程中发酵液的pH值为6.9～7.1。
优选的，按重量百分比计，所述步骤3)中的发酵培养过程中糖的浓度为2.5～3.5％。
优选的，当发酵液中的褐黄袍链霉菌菌丝体浓度达到30％时补加SCH-1型增效剂。
本发明提供了一种褐黄袍链霉菌发酵生产纳他霉素的方法，采用适宜配比的发酵培养基，并在基础料中添加SCH-1型增效剂，菌丝体在均衡的碳氮比和无机盐离子环境下生长活性大大提高，纳他霉素产量相应提高，同时无需一味加大动力条件，菌丝体更加快速的适应培养液的环境，迟缓期缩短，从而发酵周期缩短。整个发酵周期为79～82h，最终褐黄袍链霉菌菌丝体浓度为44～45％，较对照组的30％的菌丝体浓度提高了50％，纳他霉素的含量由对照组的5g/L提高到6.9～7g/L。
具体实施方式
本发明提供了一种褐黄袍链霉菌发酵生产纳他霉素的方法，包括以下步骤：
1)将褐黄袍链霉菌孢子液活化；
2)将所述步骤1)活化后的褐黄袍链霉菌孢子液接种于种子培养基中进行种子培养，得到褐黄袍链霉菌；
3)将所述步骤2)得到的褐黄袍链霉菌接种于发酵培养基中进行有氧发酵培养，得到纳他霉素；
所述步骤3)中发酵培养基包括：葡萄糖60.0±1.0g/L、中温黄豆饼粉2.0±0.5g/L、棉籽饼粉2.0±0.5g/L、酵母粉10.0±1.0g/L、玉米浆15.0±1.0g/L、氯化钠0.5±0.1g/L、硫酸镁0.2±0.1g/L、豆油10.0±1.0g/L、SCH-1型增效剂5.0±0.5g/L、碳酸钙5.0±0.5g/L和余量的水。
在本发明中，将褐黄袍链霉菌孢子液进行活化。优选的，所述褐黄袍链霉菌孢子液使用前在-82～-78℃条件下冻存。本发明对所述褐黄袍链霉菌孢子液的菌株和来源没有特殊限定，采用市售商品即可，优选的，采用保藏于中国微生物菌种保藏中心，菌种编号为CGMCC NO.4628的菌株。
优选的，在活化前先对孢子液进行稀释，更优选的，稀释后的浓度为10-5；优选的采用ddH2O进行稀释。优选的，所述活化为将稀释后的孢子液在斜面培养基中培养。优选的，所述斜面培养基包括：葡萄糖10.0±1.0g/L、麦芽浸出粉3.0±0.5g/L、酵母浸出粉3.0±0.5g/L、蛋白胨5.0±0.5g/L、琼脂15.0±1.0g/L和余量的水，更优选为葡萄糖10.0g/L、麦芽浸出粉3.0g/L、酵母浸出粉3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、琼脂15.0和余量的水。
在本发明中，所述活化的条件优选为：活化温度：26～30℃，活化时间为6～8天，初始pH值为6.9～7.1；更优选为：活化温度：28℃，活化时间为7天，初始pH值为7.0。活化结束后，斜面完全被孢子覆盖且孢子颜色由白色转为灰色。
本发明对上述斜面培养基的组分的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规配制培养基的药品即可。
在本发明中，所述斜面培养基优选经120～130℃灭菌25～35min后使用。在本发明中，所述灭菌温度更优选为121℃；所述灭菌时间更优选为30min。本发明对培养基灭菌的设备没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的灭菌设备即可。
在本发明中，将活化后的褐黄袍链霉菌孢子接种于种子培养基中进行种子培养，得到褐黄袍链霉菌。优选的，所述种子培养的接种量为1.9～2.1％，更优选为2％。优选的，所述种子培养基包括：葡萄糖20.0±1.0g/L、酵母粉3.0±0.5g/L、蛋白胨5.0±0.5g/L、玉米浆5.0±0.5g/L、氯化钠10.0±1.0g/L、磷酸二氢钾0.5±0.1g/L、碳酸钙5.0±0.5g/L和余量的水，更优选的为：葡萄糖20.0g/L、酵母粉3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、玉米浆5.0g/L、氯化钠10.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、碳酸钙5.0g/L和余量的水。
在本发明中，所述种子培养优选采用摇瓶培养；优选的，所述种子培养基的起始添加量为培养容器体积的9～11％，更优选为10％。优选的，所述种子培养的条件为：摇床转速：210～230rpm，培养温度：25～30℃，培养时间：20～26h，初始pH值为6.9～7.0，更优选为：摇床转速：220rpm，培养温度：28℃，培养时间：24h。培养至褐黄袍链霉菌浓度大于10％。
本发明对上述种子培养基的组分的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规配制培养基的药品即可。
在本发明中，所述种子培养基优选经120～130℃灭菌25～35min后使用。在本发明中，所述灭菌温度更优选为121℃；所述灭菌时间更优选为30min。本发明对培养基灭菌的设备没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的灭菌设备即可。
所述种子培养得到褐黄袍链霉菌后，本发明将得到的褐黄袍链霉菌接种于发酵培养基中进行有氧发酵培养，得到纳他霉素。优选的，按体积百分比计，所述发酵培养的接种量为发酵培养基体积的7.5～8.5％，更优选为8.0％。
优选的，所述发酵培养基的起始添加量为发酵罐体积的65～75％，更优选为70％。在本发明中，所述发酵培养基优选包括：葡萄糖60.0±1.0g/L、中温黄豆饼粉2.0±0.5g/L、棉籽饼粉2.0±0.5g/L、酵母粉10.0±1.0g/L、玉米浆15.0±1.0g/L、氯化钠0.5±0.1g/L、硫酸镁0.2±0.1g/L、豆油10.0±1.0g/L、SCH-1型增效剂5.0±0.5g/L、碳酸钙5.0±0.5g/L和余量的水，更优选为葡萄糖60.0g/L、中温黄豆饼粉2.0g/L、棉籽饼粉2.0g/L、酵母粉10.0g/L、玉米浆15.0g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸镁0.2g/L、豆油10.0g/L、SCH-1型增效剂5.0g/L、碳酸钙5.0g/L和余量的水。
优选的，所述发酵培养的条件为：培养温度为25～30℃，起始通气量为0.25～0.35VVM，起始搅拌速度为140～160rpm，起始pH值为6.4～6.6，发酵全程维持发酵罐压力为0.04～0.06MPa，更优选为，培养温度为28℃，起始通气量为0.3VVM，起始搅拌速度为150rpm，起始pH值为6.5，发酵全程维持发酵罐压力为0.05MPa。
在本发明中，在发酵培养开始后，随着菌体适应培养基和发酵环境条件，溶氧量会逐渐下降。优选的，通过搅拌和/或通气量来控制溶氧量；优选的，在发酵培养过程中发酵液的溶氧量在30％以上；优选的，所述溶氧量采用发酵罐自带的溶氧电极测定。在本发明中，在发酵培养过程中，pH值会先上升7.0以上，然后逐渐下降，当下降到7.0时调节pH值，使pH值为6.9～7.1。优选的所述调节pH值为选用氨水调节，更优选的，采用质量分数为30％的氨水。优选的，所述pH采用发酵罐自带的pH电极测定。在本发明中，在发酵培养过程中，随着营养物质的消耗，糖浓度会逐渐下降，当下降到2.5％时补充葡萄糖。优选的，所述葡萄糖的浓度为200±2g/L，更优选为200g/L。优选的，按重量百分比计，发酵培养过程中糖的浓度为2.5～3.5％。优选的，所述糖浓度采用菲林试剂法测定。
在本发明中，优选的，在发酵培养过程中每3～5h对发酵液中的褐黄袍链霉菌菌丝体浓度进行一次检查，更优选为4h。优选的，当所述褐黄袍链霉菌菌丝体浓度达到30％时补加SCH-1型增效剂。在本发明中，所述SCH-1型增效剂的浓度优选为20.0±1g/L，更优选为20.0g/L；优选的所述增效剂采用ddH2O稀释。优选的，所述SCH-1型增效剂的添加量为0.25～0.35ml/(h.L)，即每1L发酵液每小时补入0.25～0.35ml，更优选为0.3ml/(h.L)。
在本发明中，随着发酵的进行，纳他霉素的增加量开始变缓，加入纳他霉素前体正丁醇，可以促进纳他霉素继续产生。优选的，当发酵进行到58～62h时，在发酵培养基中加入正丙醇，更优选为60h。优选的，所述正丙醇在加入前进行除菌；优选的，所述除菌方式为过滤法，优选的，所述过滤法采用孔径为0.22um的滤菌器。优选的，所述正丙醇的添加量为4.5～5.5ml/L，更优选为5ml/L。当菌浓度不再增加时，结束发酵，整个发酵周期大约为80h。
本发明对上述培养基的组分的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规配制培养基的药品即可，优选的，所述SCH-1型增效剂为四川乐山市五通桥生物化工厂生产。
在本发明中，所述发酵培养基、补充葡萄糖和补充SCH-1型增效剂均优选经120～130℃灭菌25～35min后使用。在本发明中，所述灭菌温度更优选为121℃；所述灭菌时间更优选为30min。本发明对培养基灭菌的设备没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的灭菌设备即可。
在本发明中，所述发酵培养基中各营养元素比适宜，并在基础料中添加增效剂，菌丝体在均衡的碳氮比和无机盐离子环境下生长活性大大提高，无需一味加大动力条件，菌丝体更加快速的适应培养液的环境，迟缓期缩短，从而发酵周期缩短；随着基础料中的营养物质尤其是氮源的消耗，菌丝体的生长变得缓慢，此时补入SCH-1型发酵增效剂，菌体进一步得到繁殖生长；当发酵进行到一定程度时，加入已过滤除菌的正丙醇，从而在发酵中后期纳他霉素的产量得到了进一步的提高。整个发酵周期约80h，最终褐黄袍链霉菌菌丝体浓度为44～45％，纳他霉素的含量为6.9～7g/L。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
褐黄袍链霉菌孢子液活化：将-78℃冻存的保藏编号为CGMCCNO.4628的褐黄袍链霉菌孢子液采用ddH2O进行稀释，稀释倍数为10-5，涂布于盛有20ml于120℃灭菌35min后的斜面培养基的平皿中，26℃培养8天进行活化培养，斜面培养基包括：葡萄糖11.0g/L、麦芽浸出粉2.5g/L、酵母浸出粉3.5g/L、蛋白胨5.0g/L、琼脂16.0g/L和余量的水，初始pH值为6.9。
种子培养：在500ml的摇瓶中加入40ml在130℃灭菌35min后的种子培养基，挑取活化后的褐黄袍链霉菌孢子接种于培养基中，接种量为1.9％，在210rpm，25℃下培养26h，得到浓度为10.5％的褐黄袍链霉菌，种子培养基包括：葡萄糖21.0g/L、酵母粉3.5g/L、蛋白胨5.5g/L、玉米浆5.0g/L、氯化钠9.0g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、碳酸钙5.0g/L和余量的水，初始pH值为6.9。
发酵培养：在发酵罐中添加发酵罐75％体积的于121℃灭菌35min后的发酵培养基，将得到的褐黄袍链霉菌按重量百分比计，以8.5％的接种量添加到发酵培养基中，在培养温度为25℃，起始通气量为0.35VVM，起始搅拌速度为140rpm条件下进行发酵，发酵全程维持发酵罐压力为0.05MPa。发酵培养基包括：葡萄糖60.0g/L、中温黄豆饼粉2.3g/L、棉籽饼粉1.8g/L、酵母粉11.0g/L、玉米浆15.0g/L、氯化钠0.6g/L、硫酸镁0.3g/L、豆油9.0g/L、SCH-1型增效剂5.0g/L、碳酸钙5.5g/L和余量的水，初始pH值为6.5。发酵过程中，当pH值下降到7.0时用质量分数为30％的氨水调节pH值，使pH值为6.9～7.1。在发酵过程中通过搅拌和/或通气量来控制溶氧量，发酵液的溶氧量在30％以上，采用斐林试剂法测定糖浓度，当糖浓度下降到2.5％时添加浓度为200g/L于121℃灭菌35min后的葡萄糖，按重量百分比计，使发酵培养过程中糖的浓度为2.5～3.5％。每3h对发酵液中的褐黄袍链霉菌菌丝体浓度进行一次检测，当褐黄袍链霉菌菌丝体浓度达到30％时补加浓度为21.0g/LSCH-1型增效剂，每1L发酵液每小时补入0.25ml。当发酵进行到58h时，在发酵培养基中加入采用孔径为0.22μm的滤菌器过滤除菌的正丁醇，添加量为5.5ml/L。整个发酵过程中采用发酵罐自带的溶氧电极测定溶氧量，采用发酵罐自带的pH电极测定pH。发酵82h后，褐黄袍链霉菌浓度不再增加，浓度为44％，纳他霉素含量为6.9g/L，结束发酵。
实施例2
褐黄袍链霉菌孢子液活化：将-82℃冻存的保藏编号为CGMCCNO.4628的褐黄袍链霉菌孢子液采用ddH2O进行稀释，稀释倍数为10-5，涂布于盛有30ml于130℃灭菌25min后的斜面培养基的平皿中，30℃培养6天进行活化培养，斜面培养基包括：葡萄糖9.0g/L、麦芽浸出粉3.5g/L、酵母浸出粉3.0g/L、蛋白胨5.5g/L、琼脂14.0g/L和余量的水，初始pH值为7.1。
种子培养：在500ml的摇瓶中加入60ml在130℃灭菌25min后的种子培养基，挑取活化后的褐黄袍链霉菌孢子接种于培养基中，接种量为2.1％，在230rpm，28℃下培养20h，得到浓度为10.3％的褐黄袍链霉菌，种子培养基包括：葡萄糖19.0g/L、酵母粉3.0g/L、蛋白胨4.5g/L、玉米浆4.5g/L、氯化钠10.5g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、碳酸钙5.5g/L和余量的水，初始pH值为7.0。
发酵培养：在发酵罐中添加发酵罐65％体积的于130℃灭菌30min后的发酵培养基，将得到的褐黄袍链霉菌按重量百分比计，以7.5％的接种量添加到发酵培养基中，在培养温度为29℃，起始通气量为0.25VVM，起始搅拌速度为160rpm条件下进行发酵，发酵全程维持发酵罐压力为0.06MPa。发酵培养基包括：葡萄糖61.0g/L、中温黄豆饼粉2.5g/L、棉籽饼粉2.5g/L、酵母粉11.0g/L、玉米浆16.0g/L、氯化钠0.4g/L、硫酸镁0.3g/L、豆油11g/L、SCH-1型增效剂5.5g/L、碳酸钙4.5g/L和余量的水，初始pH值为6.6。发酵过程中，当pH下降到7.0时用质量分数为30％的氨水调节pH值，使pH值为6.9～7.1。在发酵过程中通过搅拌和/或通气量来控制溶氧量，发酵液的溶氧量在30％以上，采用斐林试剂法测定糖浓度，当糖浓度下降到2.5％时添加浓度为202g/L于121℃灭菌35min后的葡萄糖，按重量百分比计，使发酵培养过程中糖的浓度为2.5～3.5％。每5h对发酵液中的褐黄袍链霉菌菌丝体浓度进行一次检测，当褐黄袍链霉菌菌丝体浓度达到30％时补加浓度为19.0g/LSCH-1型增效剂，每1L发酵液每小时补入0.35ml。当发酵进行到62h时，在发酵培养基中加入采用孔径为0.22μm的滤菌器过滤除菌的正丁醇，添加量为4.5ml/L。整个发酵过程中采用发酵罐自带的溶氧电极测定溶氧量，采用发酵罐自带的pH电极测定pH。发酵79h后，褐黄袍链霉菌浓度不再增加，浓度为44.5％，纳他霉素含量为6.9g/L，结束发酵。
实施例3
褐黄袍链霉菌孢子液活化：将-80℃冻存的保藏编号为CGMCCNO.4628的褐黄袍链霉菌孢子液采用ddH2O进行稀释，稀释倍数为10-5，涂布于盛有25ml于121℃灭菌30min后的斜面培养基的平皿中，28℃培养6天进行活化培养，斜面培养基包括：葡萄糖10.0g/L、麦芽浸出粉3.0g/L、酵母浸出粉3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、琼脂15.0g/L和余量的水，初始pH值为7.0。
种子培养：在500ml的摇瓶中加入50ml在121℃灭菌30min后的种子培养基，挑取活化后的褐黄袍链霉菌孢子接种于培养基中，接种量为2.0％，在220rpm，28℃下培养24h，得到浓度为10.4％的褐黄袍链霉菌，种子培养基包括：葡萄糖20.0g/L、酵母粉3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、玉米浆5.0g/L、氯化钠10.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、碳酸钙5.0g/L和余量的水。
发酵培养：在发酵罐中添加发酵罐70％体积的于121℃灭菌30min后的发酵培养基，将得到的褐黄袍链霉菌按重量百分比计，以7.0％的接种量添加到发酵培养基中，在培养温度为28℃，起始通气量为0.3VVM，起始搅拌速度为150rpm条件下进行发酵，发酵全程维持发酵罐压力为0.05MPa。发酵培养基包括：葡萄糖60.0g/L、中温黄豆饼粉2.0g/L、棉籽饼粉2.0g/L、酵母粉10.0g/L、玉米浆15.0g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸镁0.2g/L、豆油10.0g/L、SCH-1型增效剂5.0g/L、碳酸钙5.0g/L和余量的水，初始pH值为6.5。发酵过程中,当pH下降到7.0时用质量分数为30％的氨水调节pH值，使pH值为6.9～7.1。在发酵过程中通过搅拌和/或通气量来控制溶氧量，发酵液的溶氧量在30％以上，采用斐林试剂法测定糖浓度，当糖浓度下降到2.5％时添加浓度为200g/L于121℃灭菌35min后的葡萄糖，按重量百分比计，使发酵培养过程中糖的浓度为2.5～3.5％。每4h对发酵液中的褐黄袍链霉菌菌丝体浓度进行一次检测，当褐黄袍链霉菌菌丝体浓度达到30％时补加浓度为20.0g/LSCH-1型增效剂，每1L发酵液每小时补入0.3ml。当发酵进行到60h时，在发酵培养基中加入采用孔径为0.22μm的滤菌器过滤除菌的正丁醇，添加量为5.0ml/L。整个发酵过程中采用发酵罐自带的溶氧电极测定溶氧量，采用发酵罐自带的pH电极测定pH。发酵80h后，褐黄袍链霉菌浓度不再增加，浓度为45％，纳他霉素含量为7.0g/L，结束发酵。
实施例4
褐黄袍链霉菌孢子液活化：将-80℃冻存的保藏编号为CGMCCNO.4628的褐黄袍链霉菌孢子液采用ddH2O进行稀释，稀释倍数为10-5，涂布于盛有25ml于121℃灭菌30min后的斜面培养基的平皿中，28℃培养6天进行活化培养，斜面培养基包括：葡萄糖10.0g/L、麦芽浸出粉3.0g/L、酵母浸出粉3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、琼脂15.0g/L和余量的水，初始pH值为7.0。
种子培养：在500ml的摇瓶中加入50ml在121℃灭菌30min后的种子培养基，挑取活化后的褐黄袍链霉菌孢子接种于培养基中，接种量为2.0％，在220rpm，28℃下培养24h，得到浓度为10.4％的褐黄袍链霉菌，种子培养基包括：葡萄糖20.0g/L、酵母粉3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、玉米浆5.0g/L、氯化钠10.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、碳酸钙5.0g/L和余量的水。
发酵培养：在发酵罐中添加发酵罐70％体积的于121℃灭菌30min后的发酵培养基，将得到的褐黄袍链霉菌按重量百分比计，以7.0％的接种量添加到发酵培养基中，在培养温度为28℃，起始通气量为0.3VVM，起始搅拌速度为150rpm条件下进行发酵，发酵全程维持发酵罐压力为0.05MPa。发酵培养基包括：葡萄糖60.0g/L、中温黄豆饼粉2.0g/L、棉籽饼粉2.0g/L、酵母粉10.0g/L、玉米浆15.0g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸镁0.2g/L、豆油10.0g/L、碳酸钙5.0g/L和余量的水，初始pH值为6.5。发酵过程中当pH下降到7.0时用质量分数为30％的氨水调节pH值，使pH值为6.9～7.1。在发酵过程中通过搅拌和/或通气量来控制溶氧量，发酵液的溶氧量在30％以上，采用斐林试剂法测定糖浓度，当糖浓度下降到2.5％时添加浓度为200g/L于121℃灭菌35min后的葡萄糖，按重量百分比计，使发酵培养过程中糖的浓度为2.5～3.5％。每4h对发酵液中的褐黄袍链霉菌菌丝体浓度进行一次检测。整个发酵过程中采用发酵罐自带的溶氧电极测定溶氧量，采用发酵罐自带的pH电极测定pH。发酵100h后，褐黄袍链霉菌浓度不再增加，浓度为30％，纳他霉素含量为5.0g/L，结束发酵。
本申请提供的褐黄袍链霉菌发酵生产纳他霉素的方法，发酵周期短，相较于实施例4的对照组，整个发酵周期从100h缩短为79～82h，最终褐黄袍链霉菌菌丝体浓度为44～45％，较对照组的30％的菌丝体浓度提高了50％，纳他霉素的含量由对照组的5g/L提高到6.9～7g/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种褐黄袍链霉菌发酵生产纳他霉素的方法，包括以下步骤：
1)将褐黄袍链霉菌孢子液活化；
2)将所述步骤1)活化后的褐黄袍链霉菌孢子接种于种子培养基中进行种子培养，得到褐黄袍链霉菌；
3)将所述步骤2)得到的褐黄袍链霉菌接种于发酵培养基中进行有氧发酵培养，得到纳他霉素；
所述步骤3)中发酵培养基包括：葡萄糖60.0±1.0g/L、中温黄豆饼粉2.0±0.5g/L、棉籽饼粉2.0±0.5g/L、酵母粉10.0±1.0g/L、玉米浆15.0±1.0g/L、氯化钠0.5±0.1g/L、硫酸镁0.2±0.1g/L、豆油10.0±1.0g/L、SCH-1型增效剂5.0±0.5g/L、碳酸钙5.0±0.5g/L和余量的水。
2.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述步骤2)中的种子培养基包括：葡萄糖20.0±1.0g/L、酵母粉3.0±0.5g/L、蛋白胨5.0±0.5g/L、玉米浆5.0±0.5g/L、氯化钠10.0±1.0g/L、磷酸二氢钾0.5±0.1g/L、碳酸钙5.0±0.5g/L和余量的水。
3.根据权利要求1或2所述的发酵生产方法，其特征在于，所述步骤2)中的种子培养的条件为：摇床转速：210-230rpm，培养温度为25～30℃，培养时间为20～26h，初始pH值为6.9～7.0。
4.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，按体积百分比计，所述步骤3)中发酵培养的接种量为发酵培养基体积的7.5～8.5％。
5.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，按体积百分比计，所述步骤3)中发酵培养基的起始添加量为发酵罐体积的65～75％。
6.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述步骤3)中发酵培养的条件为：培养温度为25～30℃，起始通气量为0.25～0.35VVM，起始搅拌速度为140～160rpm，起始pH值为6.4～6.6，发酵全程维持发酵罐压力为0.04～0.06MPa。
7.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述步骤3)中发酵培养过程中发酵液的溶氧量在30％以上。
8.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述步骤3)中发酵培养过程中发酵液的pH值为6.9～7.1。
9.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，按重量百分比计，所述步骤3)中的发酵培养过程中糖的浓度为2.5～3.5％。
10.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述步骤3)中当发酵液中的褐黄袍链霉菌菌丝体浓度达到30％时补加SCH-1型增效剂。
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