CN112646749A - 一种利用氨水调节培养基pH的金霉素种子生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于金霉素发酵技术领域，具体公开一种利用氨水调节培养基pH的金霉素种子生产方法，由金色链霉菌作为出发菌株，经过纯种培养、三级发酵生成金霉素，具体工艺步骤包括砂土孢子制备工序、母瓶斜面孢子制备工序、子瓶斜面孢子制备工序、一级种子制备工序、二级种子制备工序、发酵制备工序，所述一级种子制备工序中种子培养基灭活以后的PH值由氨水调节，用氨水在培养基消毒后调整pH，通过控制氨水的滴加速度和合适的时机加入，一方面可缓冲pH，另一方面则是可以为孢子生长提供速效氮源，物美价廉。
Description
技术领域
本发明属于金霉素发酵技术领域，尤其涉及一种利用氨水调节培养基pH的金霉素种子生产方法。
背景技术
金霉素的发酵生产方法，是由金色链霉菌作为出发菌株，经过纯种培养、二级发酵生成金霉素，发酵过程中微生物的正常生长需要维持在一定的pH值下，pH对微生物的生长和代谢产物生成都有很大影响。不同的微生物对pH值的要求是不同的，每种微生物都有自己的生长最适和耐受的pH值，大多数细菌的最适pH值为6.5～7.5；霉菌的最适pH值为4.0～5.8，酵母菌的最适pH值为3.8～6.0；放线菌的最适pH值为6.5～8.0，有的微生物生长繁殖阶段的最适pH范围与产物生成阶段的是不一致的，这不仅与菌种特性有关，也与产物的化学性质有关。特别是在金霉素的发酵生产过程中，种子培养基的消后pH不仅影响孢子的萌发，同时也影响种子的生长趋势，更是影响抗生素的产量。现有种子的培养基的pH调整一般用氢氧化钠调整，但是氢氧化钠属于强碱，对培养基营养物质会有破坏，对pH的缓冲能力弱，同时，钠离子增加微生物生长环境的渗透压，对种子的生长造成一定的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用氨水调节培养基pH的金霉素种子生产方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种利用氨水调节培养基pH的金霉素种子生产方法，是由金色链霉菌作为出发菌株，经过纯种培养、二级发酵生成金霉素，具体工艺步骤包括砂土孢子制备工序、母瓶斜面孢子制备工序、子瓶斜面孢子制备工序、一级种子制备工序、发酵制备工序，所述一级种子制备工序中种子培养基的pH值由浓度22.5%的氨水调节至6.15±0.05，氨水的添加量为种子培养基体积的0.1%，由于氨水对微生物的pH微环境缓冲和调节，可以促进微生物生长环境的渗透压平衡，同时促进孢子对氮源的快速吸收，一级种子液定容4000 升，添加4L氨水，浓度为22.5%，利于种子生长从而提高后期种子在发酵工工序的产率，在种子制备工序，种子罐中每升培养基水溶液中含有花生饼粉 20g、黄豆饼粉 10g、玉米淀粉 35g、氯化钠1.5g、硫酸铵 2.5g、碳酸钙 4g、酵母粉15g、磷酸二氢钾 0.5g。
进一步的，发酵生产采取变温控制，接种后培养温度在 28-34℃，菌丝长好后降温至 29±3℃培养，培养压力在 0.01Mpa—0.04Mpa，发酵培养粘度为 1-35 秒，发酵周期为90-124小时。
进一步的，在发酵制备工序，每个种子罐中培养基水溶液为 4000 升。
本发明具有的优点是：用浓度22.5%的氨水调整种子培养基的pH，一方面可缓冲pH， pH调整到6.15±0.05，为金霉素种子生长的最佳pH范围，促进微生物生长环境的渗透压平衡,另一方面则是可以为孢子生长提供速效氮源，在比较好的微环境中，快速利用氮源，促进种子很快的进入对数期，提前转入二级发酵罐，节约时间，物美价廉。
具体实施方式
实施例
一种利用氨水调节培养基pH的金霉素种子生产方法，是由金色链霉菌作为出发菌株，经过纯种培养、二级发酵生成金霉素，具体工艺步骤包括砂土孢子制备工序、母瓶斜面孢子制备工序、子瓶斜面孢子制备工序、一级种子制备工序、发酵制备工序，所述一级种子制备工序中种子培养基灭pH值由氨水调节，具体的，包括以下步骤：
（1）砂土孢子制备工序 ：将河沙用 10% 盐酸浸泡水洗后烘干过 60 目筛，将土用水浸泡，烘干后过 80 目筛，砂和土按 2 ：1 比例混合均匀，分装于 12×100mm 小试管中，装量约 1cm，纱布棉塞封口，121-126℃，1小时间歇灭菌三次，烘干无菌试验检查，无菌后备用，将经过分离筛选的高效价的斜面孢子在无菌条件下接入经检查无染菌的砂土管中，贴上标签，记上砂土名称及埋藏日期，置于放有干燥剂的容器中，盖紧密封，置于 0-10℃冰箱中保存备用；
（2）母瓶斜面孢子制备工序 ：在无菌条件下从砂土管中挑取适量砂土接于母瓶斜面培养基上，要求菌落分布稍稀，标识后，放于温度32±1℃，湿度40-65%的恒温室培养3—5天，成熟后放于 0--10℃冰箱保存备用；
（3）子瓶斜面孢子制备工序 ：从母瓶上挑取孢子丰满、无白点的单菌落 4-10 只，于约 5ml 无菌水中，搅匀，用玻璃铲挑孢子液接入子瓶斜面培养基上，要求菌落分布较密，同时做露碟和肉汤无试检查，接好的斜面标识后放于温度 32±1℃，湿度 40-65% 的恒温室培养 3-5 天，成熟后放于 0--10℃冰箱保藏备用；
（4）一级种子制备工序 ：在种子培养基制备工序，种子罐中每升培养基水溶液中含有 ：花生饼粉 20g、黄豆饼粉 10g、玉米淀粉 35g、氯化钠1.5g、硫酸铵 2.5g、碳酸钙4g、酵母粉15g、磷酸二氢钾 0.5g，每个种子罐中培养基水溶液的体积可按 4000 升或者4m3计算，在无菌条件下，在合格的 4-6 瓶子瓶斜面孢子内加 150ml 无菌蒸馏水，以火焰法接种到一级种子罐中，温度控制在 26-33℃，罐压控制在0.04—0.06Mpa，搅拌转速在110-140rpm 条件下进行培养，培养时间 20—26 小时，二级种子液培养时间 20--26 小时，种子生长良好可移入发酵罐；
（5）发酵制备工序 ：发酵罐中每升培养基水溶液中含有 ：花生饼粉 20g、黄豆饼粉 10g、玉米淀粉 35g、氯化钠1.5g、硫酸铵 2.5g、碳酸钙 4g、酵母粉15g、磷酸二氢钾0.5g，每个种子罐中培养基水溶液的体积可按 4000 升或者4m3计算，发酵罐中 30000升培养基水溶液中含有 ：花生饼粉 600Kg、芝麻饼粉 300 Kg、玉米淀粉 1800 Kg、淀粉酶 3Kg、氯化钠 60 Kg、硫酸铵 220 Kg、碳酸钙 170 Kg、酵母粉260 Kg、玉米浆 400 Kg、硫酸镁6.6 Kg、磷酸二氢钾 3 Kg、豆油 5 Kg，当基础培养基灭菌完成温度降至30-35℃时，将培养好的二级种子移入发酵罐，移种后发酵生产采取变温控制，培养压力控制在 0.01Mpa—0.04Mpa，发酵培养粘度控制在 1-35 秒，发酵周期为 90-124 小时，发酵完成后送到提炼车间进行提取。
实验例
为了降低生产成本，提升效能，本发明用价格相对较低的氨水完全替代氢氧化钠作原料，调整种子培养基的消后pH，进行了工艺改进试验，将培养好一级种子转入发酵培养基中，然后进行培养，本试验中种子培养基的pH调整选择用氨水替代氢氧化钠，将好的种子转入发酵培养基，发酵的更好，试验的具体种子移种指标及发酵产能见表1和表2所示 ：
表1种子移种指标
小结：因为氨水具有缓冲作用，本发明消后pH波动较小，更稳定；种子移种时间方面，本发明较原生产缩短1小时；移种pH方面，本发明较原发明平均稍低0.04；菌浓提升7%，这些说明菌丝生长较快，种子长势好，为后续更好的发酵性能打下基础。
表2发酵产能提升
| 项目（产量） | 15%CTC（kg） |
| 本发明平均（20批） | 8586±48 |
| 原生产平均（20批） | 8256±99 |
小结：因为种子长势好，后续发酵更稳定，本发明产能较原生产提升330kg，生产波动小，效果显著。
Claims (3)
1.一种利用氨水调节培养基pH的金霉素种子生产方法，由金色链霉菌作为出发菌株，经过纯种培养、二级发酵生成金霉素，具体工艺步骤包括砂土孢子制备工序、母瓶斜面孢子制备工序、子瓶斜面孢子制备工序、一级种子制备工序、发酵制备工序，其特征在于：所述一级种子制备工序中种子培养基的pH值由浓度22.5%的氨水调节至6.15±0.05，氨水的添加量为种子培养基体积的0.1%，在种子制备工序，种子罐中每升培养基水溶液中含有花生饼粉 20g、黄豆饼粉 10g、玉米淀粉 35g、氯化钠1.5g、硫酸铵 2.5g、碳酸钙 4g、酵母粉15g、磷酸二氢钾 0.5g。
2.如权利要求1所述的利用氨水调节培养基pH的金霉素种子生产方法，其特征在于：发酵生产采取变温控制，接种后培养温度在 28-34℃，菌丝长好后降温至 29±3℃培养，培养压力在 0.01Mpa—0.04Mpa，发酵培养粘度为 1-35 秒，发酵周期为90-124小时。
3.如权利要求2所述的利用氨水调节培养基pH的金霉素种子生产方法，其特征在于：在发酵制备工序，每个种子罐中培养基水溶液为 4000 升。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116515713A (zh) * | 2023-06-06 | 2023-08-01 | 天津科技大学 | 一种生产菌种培养方法 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN103614445A (zh) * | 2013-03-29 | 2014-03-05 | 驻马店华中正大有限公司 | 一种利用菌体蛋白替代部分酵母粉的金霉素发酵生产方法 |
| WO2018120574A1 (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-05 | 内蒙古金达威药业有限公司 | 一种利用微生物发酵生产dha的方法 |
-
2021
- 2021-01-15 CN CN202110057019.XA patent/CN112646749A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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| CN103614445A (zh) * | 2013-03-29 | 2014-03-05 | 驻马店华中正大有限公司 | 一种利用菌体蛋白替代部分酵母粉的金霉素发酵生产方法 |
| WO2018120574A1 (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-05 | 内蒙古金达威药业有限公司 | 一种利用微生物发酵生产dha的方法 |
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