CN109161504A - 一株海洋弧菌及其分离方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株海洋弧菌及其分离方法，进一步从华南沿海地区海水样本中分离获得一株产琼脂糖酶的海洋弧菌HN897，于2018年8月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC NO.16232，菌种鉴定分析显示其为Vibrio astriarenae。在固体琼脂平板上培养该菌株显示其具有降解琼脂的能力，在2种培养液中(TSB和LB)所分泌的琼脂糖酶活性，表明该菌株具有高产琼脂糖酶的能力；由此，本发明的弧菌HN897在琼脂寡糖等生物医药领域具有广阔的应用和市场前景，同时为后续制备活力强、纯度高的酶制品奠定基础。

Description

一株海洋弧菌及其分离方法与应用
技术领域
本发明涉及一株海洋弧菌，具体涉及一株海洋弧菌及其分离方法与应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
琼脂糖酶(Agarase)是1类糖苷水解酶，能够催化琼脂多糖分解为低聚糖。琼脂糖是1种线性大分子，由D-半乳糖和3，6-内醚-α-L-半乳糖通过α-1，3 和β-1，4糖苷键交替连接形成。
根据所催化糖苷键的不同，琼脂糖酶又可以分为α-琼脂糖酶(EC3.2.1.158) 和β-琼脂糖酶(EC3.2.1.81)2类；其中前者专一性作用于琼脂糖的α-1，3糖苷键，生成了琼脂寡糖，分别以β-D-半乳糖为非还原性末端和以3，6-内醚-α -L-半乳糖为还原性末端的琼脂寡糖(Agaro-oligosaccharides)，而后者则特异性作用于琼脂糖的β-1，4糖苷键，生成以β-D-半乳糖为还原性末端和以3，6-内醚 -α-L-半乳糖为非还原性末端的(Neoagaro-oligosaccharides)。
因此，琼脂糖酶可以帮助制备具有生物活性的琼脂寡糖，琼脂寡糖有着抗氧化、免疫调节、降血脂等作用，在医药领域有着广泛的应用前景。
琼脂糖酶分布比较广泛，在多种海洋物质中可以找到，如海洋软体动物、海藻、海洋微生物和海洋沉积物，但利用琼脂糖作为碳源的海洋微生物是琼脂糖酶生产的主要来源。
海洋微生物来源的琼脂糖酶不仅种类多，而且具有产量高、适应条件广等优点，是琼脂糖酶研究领域的热点。自1902年Gram从海水中分离鉴定出第1 株降解琼脂的芽孢杆菌以后，陆续已有20多个种属的细菌产琼脂糖酶，主要集中在弧菌(Vibrio spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas spp.)等革兰氏阴性的海洋细菌中。
目前，琼脂酶的研究方法已经比较成熟，国外研究起步较早，已发现多种能产生琼脂酶的细菌及对应的琼脂酶，如AgaA，AgaB和AgaC等，研究重点也已从细菌提取琼脂酶转向对琼脂酶基因进行研究并通过将该基因重组在大肠杆菌中进行原核表达以获得更多更纯净的琼脂酶；国内研究比较晚，但是在国外研究的基础上，也取得了一些突破。
总结国内外当前的研究，存在以下问题尚待解决，一部分是α-琼脂酶的天然来源较少，因此对α-琼脂酶的研究比较少；另一部分是目前研究得出的高纯度琼脂酶相当昂贵，琼脂酶降解琼脂生成的副产物尚未能真正广泛用于工业生产。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能够产琼脂糖酶的海洋弧菌及其分离方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种海洋弧菌，其保藏号为CGMCC NO.16232，于2018年8月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种鉴定分析显示为Vibrio astriarenae。
上述的一种海洋菌株，应用于产琼脂糖酶。
上述的一种海洋菌株，其特征在于，应用于制备酶制品。
根据权利要求1所述的一种海洋菌株的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将待筛选菌株划线于TCBS培养基，恒温培养，进行复苏；挑取单菌落，接种于含NaCl的TSB培养基中，恒温震荡培养；
S2、取震荡培养后的菌液，点在含NaCl的TSA平板上，恒温正置培养后，筛选保存。
上述步骤S1中的待筛选菌株，来源于华南沿海地区海水样本。
上述步骤S1中的恒温培养的温度为30℃，时间为24h；震荡培养的温度为 30℃，转速为200r·min-1，NaCl的质量体积百分比为1.5％；
步骤S2中的菌液为5μL，NaCl的质量体积百分比为1.5％；正置培养的温度为30℃，时间为24～48h。
上述TCBS培养基包括：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L硫代硫酸钠， 10g/L枸橼酸钠，5g/L牛胆粉，3g/L牛胆酸钠，20g/L蔗糖，10g/L氯化钠，1g/L 柠檬酸铁，0.04g/L溴麝香草酚兰，0.04g/L麝香草酚兰，15g/L琼脂；
所述TSB培养基包括：磷酸氢二钠6g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钠0.5g/L，氯化铵1g/L，维生素B1 2mg/L，硫酸镁1mM，氯化钙0.1mM和0.2％葡萄糖。
一种产琼脂糖酶的海洋弧菌的分离方法，基于上述的海洋菌株的分离方法，所述正置培养后的平板用卢戈氏碘液染色，观测平板上菌落周围的凹陷情况以及染色后出现的透明圈，测量透明圈的大小以确定细菌具有的降解琼脂糖的能力，获得海洋弧菌HN897。
本发明的有益之处在于：
本发明通过分离实验来源于华南地区的海水样本，得到一株产琼脂糖酶的海洋弧菌菌株HN897，并鉴定了该菌株的种属，为以后找到更多的相同能力的菌株奠定了基础。
本发明的产琼脂糖酶的海洋弧菌，具有高产能力，产生的琼脂糖酶可将降解琼脂糖，在医疗和制药工业有较高的经济价值。此外，琼脂糖酶也能用于降解海藻细胞细胞壁，在制作海藻原生质体和生产海藻寡糖中发挥重要作用；在此基础上，可通过一系列分子生物学和基因工程手段对琼脂糖酶的特性、分泌机制等进行深入研究，并通过体外表达等方法制备活力强、纯度高的酶制品，为后续制备活力强、纯度高的酶制品奠定基础。
附图说明
图1为本发明分离的具有琼脂糖降解能力的弧菌菌株HN897，其中，图A 为肉眼观察菌落周围琼脂平板凹陷图，图B是卢戈氏碘液染色显示菌落周围的透明水解圈。
图2为本发明的弧菌菌株HN897 16S rRNA基因序列***发育树，每一分支节点上的数字为自展值，代表该进化树分支的可行度。
图3为本发明的弧菌菌株HN897在培养液上清中的琼脂糖酶活力值，其中，图A是D-半乳糖标准曲线，图B是弧菌HN897在2种培养液上清中的琼脂糖酶活性。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
本发明所用的材料、试剂，均可从商业途径得到。所用弧菌鉴定引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，PCR产物由广州擎科生物技术有限公司进行测序，PrimeSTAR MAX购自宝生物工程(大连)有限公司。
本发明分离的一种海洋弧菌，于2018年8月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.16232，菌种鉴定分析显示为Vibrio astriarenae，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。
1、具有琼脂糖酶降解能力的菌株的发现：
HN897是一株华南地区海水中分离的海洋菌株，本发明发现HN897具有较高的琼脂糖酶分泌能力，具体的发现过程如下：
S1、将待筛选菌株划线于TCBS培养基进行复苏，30℃恒温培养24h。挑取单菌落，接种于含1.5％NaCl的TSB液体培养基中，于30℃200r·min-1震荡培养过夜。
S2、取过夜培养的菌液5μL，点在含1.5％NaCl的TSA平板上，30℃恒温正置培养24～48h。
TCBS培养基配方：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L硫代硫酸钠，10 g/L枸橼酸钠，5g/L牛胆粉，3g/L牛胆酸钠，20g/L蔗糖，10g/L氯化钠，1 g/L柠檬酸铁，0.04g/L溴麝香草酚兰，0.04g/L麝香草酚兰，15g/L琼脂；
TSB培养基配方：磷酸氢二钠6g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钠0.5g/L，氯化铵1g/L，维生素B1 2mg/L，硫酸镁1mM，氯化钙0.1mM和0.2％葡萄糖。
S3、培养后的平板用卢戈氏碘液染色，根据染色后是否出现透明圈，以确定细菌是否具有降解琼脂糖的能力；并测量透明圈的大小，以确定具有的降解琼脂糖的能力的大小，观察过程中，可结合观察平板上菌落周围的凹陷情况。
结果分析：通过透明圈筛选法，从华南沿海地区海水样本中分离的150株海洋弧菌进行产琼脂糖酶的筛选，从中分离到3株具有琼脂糖降解能力的菌株。其中编号HN897菌株降解能力较强，该菌株在平板上形成规则的圆形菌落，表面光滑，边缘比较整齐，整体呈乳白色；同时可以发现到在菌落周围有较为明显的凹陷(如图1A所示)。卢戈氏碘液染色显示，菌落周围形成较大的透明水解圈，而平板的其他地方则被染成暗红色(如图1B所示)。这说明菌落周围的琼脂糖已被该菌分泌的琼脂糖酶所降解，产生具有还原性的琼脂低聚糖，不能被碘液染色。
2、HN897的种属鉴定以及***进化树的分析
通过如下步骤对HN897种属进行鉴定：
A1、HN897基因组DNA制备：
取过夜培养的1mL菌液于1.5mL离心管中，瞬时离心沉淀菌体，随后使用 200μLPBS重悬菌体，100℃煮沸菌液5min，通过1000r·min-1离心3min获得细菌基因组DNA，并用作PCR扩增的模板。
A2、序列的获得：
建立25μL PCR反应体系：2X PrimeSTAR Max预混物12.5μL，引物 16S_27Fs和16S_1492Rs各1μL，灭菌超纯水9.5μL，基因组DNA 1μL，进行 PCR反应，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
PCR产物测序由广州擎科生物技术有限公司完成。
A3、序列比对及***进化树分析:
选择BLAST软件，将测序得到的序列与GenBank数据库的序列进行比对，发现该菌株16S rRNA基因序列与其他海洋弧菌以及其他种菌株的序列相似度在 98％以上，***进化分析显示HN897与2株Vibrio astriarenae(C7和C20)单独聚为1枝，可信度达100％，如图2所示。这说明HN897为Vibrio astriarenae 的成员。
表1引物序列表
引物名称 引物序列(5'→3')
16S_27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
16S_1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT
3、粗酶液的酶活力测定
为了更加清晰地了解HN897的产酶能力，进行酶活力测定，包括如下步骤：
B1、D-半乳糖标准曲线的绘制：
如表2所示，取2mL离心管，编号，往其中加入试剂，混匀后100℃金属浴10min，冷水冷却至室温；
再取15mL离心管，将反应液全部转移到该管中并定容至12.5mL；用分光光度计测定波长520nm下吸光值A520。
每组做3个平行，取平均值；以吸光值A520为纵坐标，D-半乳糖含量(mg· mL-1)为横坐标，绘制标准曲线。
表2制作D-半乳糖标准曲线中各管成分表
B2、菌体培养：
在平板上挑取产琼脂糖酶的海洋弧菌单菌落(HN897)，接种于含1.5％NaCl 的TSB液体培养基中，于30℃200r·min-1震荡培养6h以活化菌株；
将活化后的菌液以1:100接种量分别接种于50mL含1.5％NaCl的TSB液体培养基和LB液体培养基中，培养36h；
TSB培养基配方：磷酸氢二钠6g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钠0.5g/L，氯化铵1g/L，维生素B1 2mg/L，硫酸镁1mM，氯化钙0.1mM和0.2％葡萄糖。
LB培养基配方：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L。
分别取培养液上清经4℃，12000r·min-1离心5min后作为琼脂糖酶的粗酶液，用于测定其琼脂酶活力。
B3、酶活力的测定：
往2mL离心管中加入0.2％琼脂底物1mL，粗酶液1mL，37℃水浴60min；反应液经4℃，10000r·min-1离心3min，取1mL上清液注入另一个2mL离心管中，加入0.75mLDNS试剂，100℃金属浴10min；冷水冷却至室温，再取15mL 离心管，将反应液全部转移到该管中并定容至12.5mL，空白对照将高温灭活的粗酶液代替原始粗酶液，其他操作不变。在波长520nm下测吸光值A520。与标准曲线结合计算酶活力。
如图3所示，HN897在TSB和LB培养液上清中的粗琼脂糖酶酶活力值分别为0.366U·mL-1和0.413U·mL-1。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一株海洋弧菌，其特征在于，其保藏号为CGMCC NO.16232，于2018年8月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种鉴定分析显示为Vibrio astriarenae。
2.根据权利要求1所述的一株海洋菌株，其特征在于，应用于产琼脂糖酶。
3.根据权利要求2所述的一株海洋菌株，其特征在于，所述琼脂糖酶，应用于制备酶制品。
4.根据权利要求1所述的一株海洋菌株的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将待筛选菌株划线于TCBS培养基，恒温培养，进行复苏；挑取单菌落，接种于含NaCl的TSB培养基中，恒温震荡培养；
S2、取震荡培养后的菌液，点在含NaCl的TSA平板上，恒温正置培养后，筛选保存。
5.根据权利要求4所述的一株海洋菌株的分离方法，其特征在于，所述步骤S1中的待筛选菌株，来源于华南沿海地区海水样本。
6.根据权利要求4所述的一种海洋菌株的分离方法，其特征在于，所述TCBS培养基包括：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L硫代硫酸钠，10g/L枸橼酸钠，5g/L牛胆粉，3g/L牛胆酸钠，20g/L蔗糖，10g/L氯化钠，1g/L柠檬酸铁，0.04g/L溴麝香草酚兰，0.04g/L麝香草酚兰，15g/L琼脂；
所述TSB培养基包括：磷酸氢二钠6g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钠0.5g/L，氯化铵1g/L，维生素B1 2mg/L，硫酸镁1mM，氯化钙0.1mM和0.2％葡萄糖。
7.根据权利要求4所述的一株海洋菌株的分离方法，其特征在于，所述步骤S1中的恒温培养的温度为30℃，时间为24h；震荡培养的温度为30℃，转速为200r·min-1，NaCl的质量体积百分比为1.5％；
步骤S2中的菌液为5μL，NaCl的质量体积百分比为1.5％；正置培养的温度为30℃，时间为24～48h。
8.一株产琼脂糖酶的海洋弧菌的分离方法，其特征在于，基于权利要求4所述的海洋菌株的分离方法，所述正置培养后的平板用卢戈氏碘液染色，观测平板上菌落周围的凹陷情况以及染色后出现的透明圈，测量透明圈的大小以确定细菌具有的降解琼脂糖的能力，获得海洋弧菌HN897。
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