CN114686503B - 一种稳定高产海藻酸裂解酶的大肠杆菌突变菌株 - Google Patents

一种稳定高产海藻酸裂解酶的大肠杆菌突变菌株 Download PDF

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    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明涉及基因工程和微生物改造技术领域，具体涉及一种稳定、高产海藻酸裂解酶的大肠杆菌突变菌株。申请人首先构建得到重组表达海藻酸裂解酶Alg的大肠杆菌工程菌株，然后通过紫外诱变筛选，获得了一株稳定性好、海藻酸裂解酶产量高的突变株，保藏编号为CCTCC NO:M2020792，为海藻酸裂解酶的工业化生产奠定了基础。

Description

一种稳定高产海藻酸裂解酶的大肠杆菌突变菌株
技术领域
本发明属于微生物诱变筛选技术领域，具体涉及一种稳定高产海藻酸裂解酶的大肠杆菌突变菌株。
技术背景
海藻酸主要是从马尾藻、海带、泡叶藻、巨藻等褐藻中提取的多糖聚合物，故又称褐藻胶，是褐藻细胞壁的主要成分之一，也是褐藻中含量最多的多糖，占褐藻总干重的左右。由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)经过1，4-键合形成的线型共聚物。因其具有凝胶性和生物相容性, 在医学、制药和食品领域有广泛的应用. 由于海藻酸特殊的理化性质和结构, 使之不能够直接被生物体利用, 而其降解后释放的寡糖却可以被广泛的利用. 而近年来的研究证明低分子量海藻酸寡糖还具有多种生物活性, 如抗肿瘤、抗菌、增强巨噬细胞吞噬作用、促进白细胞因子的产生、促植物生长等, 在药物研制、功能食品开发、农业等领域具有广阔的开发前景。综上所述, 对海藻酸的降解是利用海藻酸多糖的前提条件。
目前降解海藻酸的方法一般有三种：化学法、物理法和生物降解法。其中生物降解法即海藻酸裂解酶酶解法，该法降解海藻酸条件温和、过程可控、得率高、绿色安全、环境友好，是海藻酸生物法降解的主要研究方向之一。
海藻酸裂解酶（alginate lyase，Alg）催化海藻酸的β-1，4-糖苷键,通过β-消去反应的解聚作用，在C-4和C-5之间形成双键, 在生成寡糖的非还原性末端产生 4-deoxy-L-erythro-hex-4-ene pyranosyluronate, 并且在 230～240 nm 有强吸收。Alg的来源广泛，主要有三大类，第一类是微生物，如海洋细菌、土壤细菌、真菌等；第二类是海洋软体动物和棘皮动物，如海螺、海参、鲍鱼等；第三类是植物，如巨藻、泡叶藻、海带等。目前，海藻酸裂解酶的生产大多是依靠海藻酸分解菌。虽然野生型海藻酸分解菌能有效的获得定量的酶蛋白，但产量很低、提取和纯化步骤繁琐，成本较高，很难满足实际应用要求。因此想要获得高效大量的酶对其进行基因工程方面的研究是重要的方法，其中异源表达是解决其在天然生物体中含量低，生产成本昂贵，难纯化,获得高产量、活性酶的有效方法。目前开发海藻酸裂解酶高产菌株仍是本领域的研究热点，对于降低海藻酸裂解酶的生产成本具有重要的意义。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种稳定、高产海藻酸裂解酶的大肠杆菌突变菌株。申请人首先构建得到重组表达海藻酸裂解酶Alg的大肠杆菌工程菌株，然后通过紫外诱变筛选，获得了一株稳定性好、海藻酸裂解酶产量高的突变株，为海藻酸裂解酶的工业化生产奠定了基础，从而弥补现有技术的不足。
本发明一方面提供了一种重组质粒，其携带有海藻酸裂解酶基因。
所述的海藻酸裂解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明一方面提供了一种大肠杆菌工程菌，其携带有上述重组质粒。
本发明还提供了一种大肠杆菌突变菌，是以上述大肠杆菌工程菌为出发菌，通过紫外诱变方法获得的。
所述突变菌命名为大肠杆菌EcalgH（Escherichia coli EcalgH），已于2020年11月30日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020792。
本发明还提供了上述突变菌在海藻酸裂解酶生产中的应用。
本发明采用紫外诱变方法获得的突变菌株大肠杆菌EcalgH能稳定、高效重组表达海藻酸裂解酶Alg，其摇瓶发酵和20L罐发酵酶活分别达到407U/mL和4500U/mL，比出发菌分别提高了85.0%和78.6%。此外，该突变菌株重组表达的海藻酸裂解酶Alg的最适作用温度为50℃，最适作用pH值为8.5，与出发菌株相同，海藻酸裂解酶的酶学性质未发生改变。因此，该突变菌株可有效应用于海藻酸裂解酶Alg的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，实现海藻酸裂解酶Alg在工业领域的广泛使用。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范围。
一、本发明实施例中所述培养基中各组分及其含量分别为：
LB平板：胰蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，NaCl 1%，琼脂1.5%；
LB液体培养基：胰蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，NaCl 1%。
二、本发明实施例中所述海藻酸裂解酶酶活的测定方法如下：
1、酶活力单位定义
在40℃，pH为7.5条件下，在本方法规定反应体系下，每分钟降解底物海藻酸钠产生不饱和键，在235nm下，吸光度每增加0.1，为一个酶活单位U。
2、原理
海藻酸裂解酶可以通过β-消除反应切断海藻酸分子中的糖苷键，产生非还原性端具有不饱和双键，双键位于产物非还原末端C4、C5之间，并在235nm处产生最大紫外吸收。
3、测定方法
3.1 液体样品：用缓冲液稀释至适当倍数，控制在吸光值OD235在0.22-0.35之间，酶活约为0.5 U/mL。
3.2 测定步骤
酶反应：取三支15mm*150mm试管，加入1.8mL底物，40℃水浴预热5min，加入稀释好的酶液0.2mL，准确计时，涡旋震荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2mL磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。
空白：取15mm*150mm试管，加入1.8mL底物，40℃水浴预热5min，加入缓冲液0.2mL，涡旋震荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2mL磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。
比色：每个样品的空白和酶反应终止后，立即在235nm比色，并记录吸光值A0和A样。
计算：
X=（A0－A样）×2×N/（t×0.1）。
式中：
X— 酶活力，U/mL或U/g；
2—加入2mL磷酸终止液的体积系数；
t（min）—酶促反应时间（在酶反应的线性范围内）；
0.1—体系系数，即将吸光值增长单位换算为0.1；
N—稀释倍数。
经简化：酶活力（U/mL）= （A0－A样）×2×N。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1 大肠杆菌表达载体的构建
根据NCBI的公开报道，人工合成海藻酸裂解酶基因，并根据大肠杆菌（Escherichia coli）的密码子偏爱性进行优化。以合成的基因为模板，设计引物进行PCR扩增；
PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S，58℃ 30S，72℃ 1.5min 30个循环；72℃7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
将上述回收的扩增产物连接到pET-28a质粒，获得重组质粒pET-28a-Alg，并送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果显示，扩增得到的海藻酸裂解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2。申请人将该基因命名为Alg，将构建得到的重组质粒命名为pET-28a-Alg。多个克隆的结果证明没有发生扩增错误。
实施例2 大肠杆菌工程菌株发酵验证及酶活测定
将重组质粒pET-28a-Alg转化将BL21(DE3)，涂布LB+Kan平板37℃过夜倒置培养。挑取阳性转化子，分别接种至20ml/100ml LB+Kan摇瓶中，37℃，220rpm过夜培养。次日按0.5%接种量接种至100ml/500ml LB+Amp摇瓶中，37℃，220rpm培养3h生长菌体，然后加入终浓度0.2mM的IPTG在25℃、220rpm条件下继续诱导培养20h。10000rpm离心10min收集菌体，用超纯水漂洗2次后，用20ml pH7.4的PBS缓冲液重悬菌体，并超声破碎(P=200W，工作3s，停5s。40个循环)。然后10000rpm离心10min，收集上清液进行海藻酸裂解酶活性检测。
申请人将菌体裂解上清液中海藻酸裂解酶酶活最高的阳性转化子命名为大肠杆菌Alg-1（Escherichia coli Alg-1），其上清液中海藻酸裂解酶酶活达到220U/mL。
实施例3 紫外诱变与筛选
紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。
申请人以实施例2构建得到的重组菌株大肠杆菌Alg-1为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其海藻酸裂解酶的产量。
3.1菌体的活化与培养
挑取少量大肠杆菌Alg-1接种于20mL/100mL LB+Kan的摇瓶中，37℃过夜培养。次日按0.5%接种量转接至50ml/250ml摇瓶中37℃培养至对数期约3-4h，活化好的菌悬液4000rpm离心5min，弃上清，菌体用生理盐水洗涤2次后，制成菌数约为108个/mL的单细胞菌悬液。
3.2 紫外诱变
菌体的活化与培养取菌悬液4mL加到直径6cm的培养皿(内装搅拌子)内，在15W紫外线下25cm处搅拌照射不同时间。将照射后的菌悬液用0.85%生理盐水10倍稀释法梯度稀释成10-1~10-5；取10-3、10-4、10-5三个稀释度的菌悬液各100 μL，涂布LB+Kan平板，每个稀释度涂布三个平板，用无菌玻璃棒均匀涂满整个平板表面。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置37℃过夜培养。
挑取平板上长出的单菌落，在含50 μg/mL Kan的LB平板上划线纯化；挑取单菌落，划线接种于含50 μg/mL Kan的LB斜面保种；共富集筛选到80株突变菌株。
3.3摇瓶初筛
将富集到的80株突变菌株与出发菌大肠杆菌Alg-1同时接种至5ml LB+Kan试管中，37℃，220rpm过夜培养。次日按0.5%接种量接种至50ml/250ml LB+Kan摇瓶中，37℃，220rpm培养3h生长菌体，然后加入终浓度0.2mM的IPTG在25℃、220rpm条件下继续诱导培养20h。10000rpm离心10min收集菌体，用超纯水漂洗2次后，用10ml pH7.4的PBS缓冲液重悬菌体，并高压匀浆仪对其进行破碎裂解。然后10000rpm离心10min收集上清液进行海藻酸裂解酶活性检测。
结果显示，上述80株突变菌中菌体裂解上清液中海藻酸裂解酶酶活最高的仅为142U/ml，比出发菌仅提高了5.2%，效果不明显。
申请人按照上述方法继续进行了11轮紫外诱变筛选，最终获得一株海藻酸裂解酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为大肠杆菌EcalgH（Escherichia coli EcalgH）。该突变菌株摇瓶发酵后，其菌体裂解上清液中海藻酸裂解酶酶活达到407 U/mL，比出发菌株提高了85.0%。
3.4 20 L罐发酵
分别挑取突变菌株大肠杆菌EcalgH和出发菌单菌落接种于0.6 L种子培养基（胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%）中，34℃、210 rpm振荡培养8 h；将0.6 L种子培养液完全接种到含12 L发酵培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K2HPO4 1.8%）的20L发酵罐中，34℃发酵培养10h，然后添加IPTG诱导继续培养24h后，取10ml菌悬液进行高压破碎裂解，然后10000rpm离心10min，收集上清液进行海藻酸裂解酶酶活检测。结果显示，所述突变菌大肠杆菌EcalgH的菌体裂解上清液中海藻酸裂解酶酶活达到4500U/ml，比出发菌提高了78.6%，取得了意料不到的技术效果。
实施例4 酶学性质分析
4.1 最适作用pH值
分别配制pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液。将突变菌株大肠杆菌EcalgH和出发菌株大肠杆菌Alg-1的菌体裂解上清液分别用上述缓冲液稀释至合适的浓度，然后测定其中海藻酸裂解酶的酶活力。以原始酶活为100%，计算不同pH条件下重组表达的海藻酸脱羧酶的相对酶活。结果显示，本发明提供的突变菌大肠杆菌EcalgH和出发菌株重组表达的海藻酸裂解酶相对酶活-pH变化曲线相同，最适作用pH均为8.5。
4.2 最适作用温度
将突变菌大肠杆菌EcalgH和出发菌大肠杆菌Alg-1的菌体裂解上清液用上述pH8.5的缓冲液稀释至合适的浓度，分别在30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃条件下，测定其中海藻酸裂解酶的酶活力。以原始酶活为100%，计算不同温度条件下重组表达的海藻酸裂解酶的相对酶活。结果显示，本发明提供的突变菌大肠杆菌EcalgH和出发菌株重组表达的海藻酸裂解酶的相对酶活-温度变化曲线相同，其最适作用温度均为50℃。
综上，本发明通过紫外诱变方法筛选获得的突变菌株大肠杆菌EcalgH（Escherichia coli EcalgH）能显著提高海藻酸裂解酶的产量，20L罐发酵酶活高达4500U/ml，较出发菌提高了78.6％，且该突变菌株产海藻酸裂解酶的酶学性质较出发菌没有发生改变。
申请人已于2020年11月30日将上述突变菌大肠杆菌EcalgH（Escherichia coliEcalgH）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020792。
序列表
<110> 潍坊康地恩生物科技有限公司
青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一种稳定高产海藻酸裂解酶的大肠杆菌突变菌株
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1728
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaatca acaggttact tcctttcagc atttcccttc tgttcagcgc ctcggcactg 60
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atcggtcaaa ttcacgccaa cgatgatgaa ccactgcgcc tgtactatcg aaagcttccc 1380
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tacgagctga tcggcagccg gtcgagcagc gcctcagacc ctagtgacgg gattgcactt 1500
gatgaagttt tcagctacga aatcgacgtt acttatgaca ctctgacggt cactatttac 1560
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ggtggccagt atatgtactt taaagcgggc gtatataacc agaacaactc tggtaacagc 1680
gacgactacg tccaagccac attctactcc cttgagcaca cccacgat 1728
<210> 2
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Ile Asn Arg Leu Leu Pro Phe Ser Ile Ser Leu Leu Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Leu Ala Ser Leu Thr Asn Pro Gly Phe Glu Asn Gln Phe
20 25 30
Ser Gly Trp Ser Asp Thr Asp Pro Ser Ala Ile Ser Gly Asp Ala Ala
35 40 45
Ser Gly Ser Tyr Ser Ala Lys Ile Thr Gly Ser Ser Gly Arg Val Asp
50 55 60
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65 70 75 80
Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly Ile Asn Ile Gly Gly Thr Val His
85 90 95
Asp Glu Arg Val Asn Thr Ser Ser Trp Thr Thr Val Thr Val Glu Phe
100 105 110
Asp Ser Gly Ser Ala Ser Ser Gly Glu Val Phe Ala Lys Tyr Asn Asp
115 120 125
Gly Thr Gly Arg Phe Asp Asp Phe Thr Leu Ser Val Ile Gly Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Glu Cys Val Asn Gly Glu Ala Ile Asp Ile Val Ser
145 150 155 160
Ala Ser Asp Asp Gly Thr Asn Asp Gly His Thr Pro Asp Leu Ala Ile
165 170 175
Asp Gly Asn Leu Ala Asp Ser Ser Arg Trp Ser Ser Leu Gly Asp Gly
180 185 190
Lys Ala Ile Thr Leu Asp Leu Gly Ser Val Ser Thr Ile Asp Thr Ile
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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340 345 350
Gly Gly Met Val Phe Lys Cys Pro Ile Asp Gly Phe Lys Thr Ser Thr
355 360 365
Asn Thr Ser Tyr Thr Arg Thr Glu Leu Arg Glu Met Leu Arg Ala Gly
370 375 380
Asp Thr Ser Ile Ala Thr Gln Gly Val Asn Lys Asn Asn Trp Val Phe
385 390 395 400
Gly Ser Ala Pro Ser Ser Asp Arg Asn Asp Ala Gly Gly Val Asp Gly
405 410 415
Asn Met Thr Ala Thr Leu Ala Val Asn His Val Thr Thr Thr Gly Ser
420 425 430
Asn Ser Gln Val Gly Arg Val Ile Ile Gly Gln Ile His Ala Asn Asp
435 440 445
Asp Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Tyr Arg Lys Leu Pro Gly Asn Ser Lys
450 455 460
Gly Ser Ile Tyr Phe Ala His Glu Pro Asn Gly Gly Ser Asp Ser Trp
465 470 475 480
Tyr Glu Leu Ile Gly Ser Arg Ser Ser Ser Ala Ser Asp Pro Ser Asp
485 490 495
Gly Ile Ala Leu Asp Glu Val Phe Ser Tyr Glu Ile Asp Val Thr Tyr
500 505 510
Asp Thr Leu Thr Val Thr Ile Tyr Arg Asp Gly Lys Asn Pro Val Ser
515 520 525
Glu Ser Val Asn Met Ser Ser Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gln Tyr
530 535 540
Met Tyr Phe Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Asn Asn Ser Gly Asn Ser
545 550 555 560
Asp Asp Tyr Val Gln Ala Thr Phe Tyr Ser Leu Glu His Thr His Asp
565 570 575

Claims (3)

1.一种大肠杆菌突变菌，其特征在于，所述突变菌的保藏编号为CCTCC NO：M2020792。
2.权利要求1所述的大肠杆菌突变菌在生产海藻酸裂解酶中的应用。
3.一种生产海藻酸裂解酶的方法，是以权利要求1所述的大肠杆菌突变菌为发酵菌株。
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