CN113308423B - 一株工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株工程菌及其应用，该大肠杆菌工程菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年3月25日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021282。该基因工程菌株能够生产海洋弧菌来源的琼脂糖酶，所生产的琼脂糖酶具有降解琼脂中琼脂糖的活性，可利用该工程菌株生产琼脂糖酶应用于酶解法制备琼脂寡糖等活性产物。

Description

一株工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株菌及其应用，尤其涉及一株工程菌及其应用。

背景技术

琼脂是由海洋藻类中提取的一类胶状多糖，琼脂糖(Agarose)是其主要组成成分之一。琼脂糖是由α-L-半乳糖和β-D-半乳糖重复单元构成的琼脂多糖；部分微生物可通过琼脂糖酶(Agarase)生化酶解作用将琼脂糖水解为更小分子量的琼脂寡糖，从而可被生物体进一步分解利用，这也是海洋微生物碳源利用的方式之一。依据水解糖苷键的不同琼脂糖酶分为α-琼脂糖酶和β-琼脂糖酶，其中β-琼脂糖酶可水解多糖的β(1，4)糖苷键从而产生具有β-D-半乳糖还原性残基末端的新琼寡糖(Neoagaro oligosaccharides) 等。琼脂经水解作用可获得二糖、四糖、六糖、八糖等琼脂寡糖；琼脂寡糖具有抗氧化、抗炎、抗辐射、降血糖等多种生物学活性，目前可基于化学方法和酶解方法水解琼脂获得该类低聚糖产物，广泛应用于食品、医药、化工等领域；化学方法主要通过强酸或氧化还原法破环琼脂糖苷键获得新低聚产物，该类方法具有专一性(稳定性)差，反应条件苛刻等劣势，同时还带来一定的环境污染问题。与此类方法相比，酶解法利用琼脂糖酶特异性识别底物水解琼脂糖，有利于特定寡糖的大量制备，酶促反应具有一定的稳定性及环保性。酶解法利用的琼脂酶大多分离自微生物，或利用基因工程方法重组表达获得。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是弥补现有技术的不足，构建获得一株生产琼脂糖酶的工程菌，且能高效水解琼脂中的琼脂糖。

技术方案：本发明的工程菌，包括一株大肠杆菌Vas1-1339菌株，具有卡那霉素抗性；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名为Escherichia coli BL21-Vasl-1339，保藏时间为2021年3月25日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021282，保藏地址为：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学。

本发明利用生物工程技术在大肠杆菌中表达弧菌琼脂糖酶基因，证明该基因表达的琼脂糖酶能够独立发挥琼脂糖酶水解活性；可作为生物工具应用于酶解方法水解琼脂糖，从而获得低聚糖产物。

本发明的工程菌在生产琼脂糖酶中的应用。

在生产琼脂糖酶中的应用包括如下步骤：

(1)将工程菌单克隆培养；

(2)扩大培养，加入IPTG诱导表达，诱导后即可获得氨基端带有His6标签的琼脂糖酶。

进一步地，步骤(1)具体包括如下步骤：挑取工程菌株Vas1-1339单克隆于LB液体培养基中培养。LB液体培养基含有50μg ml-1卡那霉素。

步骤(2)具体包括如下步骤：按1∶100稀释菌液扩大培养至OD600达到0.3-0.4 左右，加入IPTG诱导表达，诱导后即可获得氨基端带有His6标签的琼脂糖酶。IPTG 使用浓度为10至100μM。琼脂糖酶生产的最优诱导时间：2至4h。

本发明的工程菌在生产琼脂糖分解产物中的应用。

本发明的获得的生产琼脂糖酶的工程菌株在提取生物活性物质-琼脂寡糖中的应用。本发明涉及的工程菌株能够有效生产琼脂糖酶，所生产的琼脂糖酶具有水解琼脂中琼脂糖的能力，可应用于琼脂糖分解产物(琼脂寡糖)的生产等领域。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

利用海洋弧菌的琼脂糖酶基因，将其克隆构建表达质粒，转化至异源工程细菌，获得一株生产琼脂糖酶的工程菌；利用该工程菌开发有效的表达琼脂糖酶的方法，利用该方法获得的琼脂糖酶能够有效水解琼脂糖，对于制备琼脂糖水解产物(琼脂寡糖)具有重要的意义。利用工程菌Vas1-1339生产琼脂糖酶可应用于制备琼脂糖水解产物(琼脂寡糖)，具有如下优势：

1)工程菌株带有卡那霉素抗性筛选标记，保证了菌株应用过程中的筛选稳定性；2)菌株的培养条件简易且培养基易获取；3)琼脂糖酶生产条件已优化(包括诱导剂使用浓度及诱导表达时间)，更有益于琼脂糖酶的获取；4)利用获得的琼脂糖酶可开发酶解法制备琼脂糖的分解产物，酶促反应时间短、效率高(2h内即可水解琼脂糖)；5)应用该方法有利于特定寡糖的大量制备且具有一定的稳定性及环保性。

附图说明

图1为实例1中涉及的pET28a-1339载体构建，琼脂糖酶基因Vas1-1339扩增产物。

图2为实施例1中涉及的琼脂糖酶基因在工程菌中诱导表达情况，其中，U表示未添加诱导剂IPTG，I表示添加100μM浓度的诱导剂IPTG。

图3为实施例2中涉及的琼脂糖酶在工程菌株中表达的诱导剂使用浓度优化，其中，纵坐标显示OD600检测的吸光值，横坐标为培养时间，诱导剂使用浓度及对照在图例中已标注。

图4为实施例2中涉及的琼脂糖酶在工程菌株中表达时间优化，其中，免疫印迹条带粗细代表琼脂糖酶的表达量，诱导表达时间在图例中已标注。

图5为实施例3中涉及的活体工程菌Vas1-1339水解琼脂糖能力，其中，透明水解圈代表水解琼脂糖能力强弱，诱导剂IPTG使用浓度在图例中已标注。

图6为实施例3中涉及的工程菌Vas1-1339生产的琼脂糖酶(His6-1339)水解琼脂糖能力，其中，透明水解圈代表纯化的琼脂糖酶具有水解琼脂糖能力，对照组使用BSA 蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1：表达琼脂糖酶基因的工程菌株构建方法

基于分子克隆技术构建表达琼脂糖酶基因的工程菌株，包括pET28a-1339载体克隆构建及转化大肠杆菌BL21表达验证。

1)pET28a-1339载体克隆构建：弧菌HN897菌株，复苏涂布于TCBS培养基平板， 30℃培养16h，挑取单菌落扩大培养，提取HN897菌株基因组DNA。依据HN897菌株基因组信息设计β-琼脂糖酶基因Vas1-1339的阅读框扩增引物；引物为1339-F1： atgggtcgcggatccgaattcATGAAATCCATAATTAAAACTCTGACATT；1339-R1： ttgtcgacggagctcgaattcTTATTGTATAAATTTCAATCGCTGGTT。200ng弧菌HN897DNA 作为模板，进行PCR扩增；PCR产物纯化回收(图1)，利用In-fusion cloning kit*** pET28a空质粒(EcoR I酶切位点)；热激转化大肠杆菌DH5α，37℃培养12h，挑取单克隆测序验证，获得pET28a-1339载体质粒；将100ng pET28a-1339质粒，热激转化大肠杆菌BL21菌株获得重组表达大肠杆菌菌株，即工程菌株Vas1-1339。

2)琼脂糖酶基因在工程菌中诱导表达验证：挑取工程菌株Vas1-1339单克隆于5mlLB液体培养基(50μg ml^-1卡那霉素)中培养12h；进一步1∶100稀释菌液扩大培养至OD600达到0.4左右，加入100μM浓度的IPTG诱导表达氨基端带有His6标签的琼脂糖酶；聚丙烯胶变性电泳(SDS-Page)分析发现约55kDa蛋白大小附近有明显条带 (图2)，初步表明琼脂糖酶成功表达(图2)。

实施例2：琼脂糖酶在工程菌中诱导表达条件

为优化琼脂糖酶在工程菌株中表达的诱导剂使用浓度条件，利用全自动生长曲线分析仪在不同IPTG诱导浓度下测定工程菌生长曲线。1∶100稀释Vas1-1339工程菌菌液，培养基中添加0，1，10，100μM IPTG；培养及测定条件：转速150rpm每分钟、37℃、每间隔20min测定吸光值(OD600)。结果发现100μM IPTG能够显著抑制His6-1339 菌株的生长，说明工程菌株Vas1-1339对高浓度IPTG敏感；IPTG的使用浓度应该小于 100μM(图3)。

为优化琼脂糖酶在工程菌株中表达的时间条件，挑取工程菌株Vas1-1339单克隆于 5ml LB液体培养基(50μg ml-1卡那霉素)中培养12h；进一步1∶100稀释菌液扩大培养至OD600达到0.4左右，加入10μM浓度的IPTG诱导表达氨基端带有His6标签的琼脂糖酶；在诱导0h，1h，2h，3h，4h后收取工程菌蛋白样品。对各样品进行免疫印迹分析，发现琼脂糖酶在不同诱导时间条件下均有效表达；2-4h表达量高于1h的表达量(图4)；说明琼脂糖酶在工程菌中诱导表达最优时间为2-4h(图4)。

实施例3：工程菌生产的琼脂糖酶降解琼脂中的琼脂糖

1.活体工程菌Vas1-1339降解琼脂糖：

利用卢戈氏碘液染色分析法初步评估活体工程菌Vas1-1339水解琼脂糖能力。具体实施步骤如下：活化培养工程菌株至OD₆₀₀达到0.4，1∶100稀释，1μL点加至LB培养基固体平板(含有50μg ml^-1卡那霉素及不同浓度的IPTG)，37℃培养12h；利用1.5％卢戈氏碘液进行平板染色，时间：0.5min至1min；根据平板上菌落周围透明圈的大小对菌株降解琼脂糖的能力进行定性分析；转化pET28a空载体的大肠杆菌BL21菌株作为对照组。结果表明活体工程菌株在LB平板上能够有效水解培养基中的琼脂糖，形成明显的透明水解圈(图5)，其中10μM IPTG诱导条件下形成的透明水解圈更明显；该结果说明构建的工程菌株Vas1-1339具有降解琼脂糖的能力，且诱导剂IPTG最优使用浓度10μM。

2.纯化的琼脂糖酶降解琼脂糖：

纯化的琼脂糖酶水解琼脂活性分析：利用基本生物工程组氨酸标签蛋白纯化方法纯化获得琼脂糖酶；500ng纯化的琼脂糖酶融合蛋白His6-1339溶液点加至琼脂固体平板，37℃孵育2h，进行卢戈氏碘液染色；5μg BSA蛋白溶液作为阴性对照。卢戈氏碘液染色分析发现纯化的琼脂糖酶2h内即能够有效水解培养基中的琼脂糖，形成透明水解圈 (图6)；说明纯化的琼脂糖酶能够有效降解琼脂糖。同比例扩大可满足规模化应用。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一株工程菌，其特征是，所述工程菌为一株大肠杆菌BL21-Vas1-1339菌株，具有卡那霉素抗性；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2021年3月25日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021282。

2.一种权利要求1所述工程菌在生产琼脂糖酶中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征是，包括如下步骤：

（1）将工程菌单克隆培养；

（2）扩大培养，加入IPTG诱导表达，诱导后即获得氨基端带有His6标签的琼脂糖酶。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，步骤（1）具体包括如下步骤：挑取工程菌株BL21-Vas1-1339单克隆于LB液体培养基中培养。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是：所述LB液体培养基含有50μg/ml卡那霉素。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征是，步骤（2）具体包括如下步骤：按1：100稀释菌液扩大培养至OD600达到0.3-0.4，加入IPTG诱导表达，诱导后即获得氨基端带有His6标签的琼脂糖酶。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述IPTG使用浓度为10至100μM。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述琼脂糖酶生产的诱导时间为2至4h。

9.一种权利要求1所述工程菌在生产琼脂糖分解产物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征是：所述琼脂糖分解产物为琼脂寡糖。

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