CN106754486B - 一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法 - Google Patents

一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法，属于微生物或酶领域，所述菌株具体为假单胞菌菌株(Pseudomonas sp.)CSY‑67，保藏编号为CGMCC No.13154。该菌株通过液体50L罐深层发酵，经补料，发酵培养80h，产酶平均水平为39575U/mL。本发明建立的液态发酵海藻糖合酶的方法，生产的海藻糖合酶最适pH范围为7.5‑8.5，最适作用温度范围为35℃‑45℃，在60℃保温1h后剩余酶活为88％，80℃保温2h后剩余酶活为59.5％，具有良好的耐热性，可广泛应用海藻糖的工业化生产中。

Description

一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法
技术领域
本发明属于微生物或酶领域，具体涉及一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法。
背景技术
海藻糖是由两分子葡萄糖以1，1-糖苷键连接而成的非还原性双糖，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。海藻糖对生物体具有非常重要的生物学意义，它是能源和碳源的储备物，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳定剂和保护剂，是信号传感复合物和生长调控因子，还是某些细菌细胞壁的组分之一。由于海藻糖具有甜度适中、性质稳定、不易分解、无还原性等特殊性质，以及其保护生物大分子（生物膜、蛋白质、DNA）免受干燥、高温、低温、过氧等环境压力破坏的独特功能，因此该双糖的应用价值十分巨大，已经被广泛应用于食品加工业、医药业、农业、生化制品业和化妆品产业中。
海藻糖合酶（trehalose synthase）是由日本生化研究所在1995年首次发现的，其能直接将麦芽糖转化为海藻糖，此后，在脂肪杆菌（Pimelobacter sp. R48）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida H262）和一些嗜热菌中都发现了海藻糖合酶，可喜的是该酶能特异性的催化麦芽糖转化为海藻糖，不作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽寡糖、蔗糖、异麦芽糖、异麦芽寡糖等。
但是由于受酶活及酶适用条件的制约，目前现有技术海藻糖合酶仍不能满足工业生产的需求，所以选育一株高产海藻糖合酶的假单胞菌菌株，其发酵产品具有良好的耐热性，生产成本低廉，对大规模推进各行业的机械化具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法，在确保假单胞菌发酵高产海藻糖合酶稳定性的同时，显著提高海藻糖合酶良好的耐热性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一株高产海藻糖合酶的假单胞菌，所述菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）CSY-67，菌株保藏号为CGMCC No. 13154。
所述假单胞菌CSY-67发酵所产的海藻糖合酶最适作用pH范围为7.5-8.5，最适作用温度范围为35℃-45℃。
本发明的另一目的在于提供上述假单胞菌CSY-67的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：
斜面培养：挑取一环假单胞菌CSY-67接种于固体斜面培养基，37℃下恒温培养48h，得一级种子；
摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温37℃，摇床转速200 r/min条件下培养48 h，得二级种子液；
种子罐培养：将二级种子液按照接种量5%(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温37℃，转速200-800 r/min条件下培养14-18 h；
发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5%(v/v)的比例接入发酵罐培养基，恒温 37℃，转速200-800 r/min，设置通风量：0h至5h 为0.25 vvm、5h至20h为0.5 vvm、20h至发酵结束为1.0 vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液pH值为6.5，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为75-85 h，得到最终发酵液；
将最终发酵液通过提取与精制方法，获得海藻糖合酶成品液体酶制剂。
进一步地，所述固体斜面培养基（g/L）：蛋白胨 12，酵母膏 6，琼脂 15，氯化钠 1，余量为水，pH 7.0，121℃灭菌20 min；
所述种子培养基（g/L）：麦芽糖浆 40，蛋白胨 5，酵母膏 5，硫酸钠 0.8，硫酸镁0.5，氯化钙 0.1，磷酸氢二钠 0.5，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20 min；
所述种子罐培养基（g/L）：麦芽糖浆 40，葡萄糖 10，酵母膏 15，玉米浆 5，KH2PO41.5，氯化钙 0. 1，pH 7.0，121-123℃灭菌30 min；
所述发酵罐培养基（g/L）：麦芽糖 80，蛋白胨 10，酵母膏 5，硫酸镁 0.5，氯化钙0.1，磷酸氢二钾 0.3，pH7.0，121-123℃灭菌30 min；
所述补料瓶培养基（g/L）：麦芽糖浆450，KH2PO4 5，玉米浆 8，CaCl2 5， pH 4.0，121-123℃灭菌30 min。
所述海藻糖合酶的提取与精制方法如下：
先将最终发酵液加1%甲苯进行细胞破壁处理，再加入1~5%珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；
用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；
在所述浓缩液中加入质量百分比20%（m/v）稳定剂、0.45%（m/v）防腐剂，调节pH7.5，然后进行过滤除菌，即得到海藻糖合酶成品液体酶制剂。
优选地，所述稳定剂为甘油，所述防腐剂为质量比为1；2的山梨酸钾和苯甲酸钠。
进一步地，所述的提取与精制方法制得的海藻糖合酶成品液体酶制剂产品。
本发明所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.）CSY-67是通过对假单胞菌原始菌株CAO12进行常温常压等离子体诱变的得到的，所述的假单胞菌CSY-67已于2016年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为CGMCCNo.13154，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号, 中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。
本发明所述高产海藻糖合酶菌株：所述假单胞菌CSY-67的菌落形态特征如下：圆形、乳白色、周边整齐、呈凸透镜状、表面光滑、有色泽、不透明、有臭味。
有益效果：
本发明通过对假单胞菌原始菌株CAO12进行常温常压等离子体诱变选育了一株高产海藻糖合酶的突变菌株，并对假单胞菌CSY-67发酵过程进行补料条件优化使其最终发酵液中酶活达到39000U/mL至40000 U/mL之间，通过提取与精制方法，获得海藻糖合酶成品液体酶制剂的酶活达到200000 U/mL至210000 U/mL之间。而假单胞菌原始菌株CAO12通过液态发酵后发酵液中最高酶活为36100 U/mL。由此可以看出，假单胞菌CSY-67显著高于假单胞菌原始菌株CAO12的酶活。
本发明菌株的发酵方法中培养基成分均来源于成本较低的原料，且在提高发酵产能、提升生产效率的同时，大大减少发酵成本，对生产具有极大帮助。
假单胞菌CSY-67发酵得到的海藻糖合酶最适pH范围为7.5-8.5，最适作用温度范围为35℃-45℃，在60℃保温1 h后剩余酶活为88%，80℃保温2 h后剩余酶活为59.5%，具有显著的耐热性，可广泛应用于高温工业生产中，显著地拓展了海藻糖合酶的工业应用范围，提高了海藻糖合酶的应用价值。
附图说明
图1：不同pH下的相对酶活；
图2：不同温度下的相对酶活；
图3：80℃下保温0-3 h后的相对酶活。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1 假单胞菌CSY-67发酵产酶及其所产海藻糖合酶的提取精制方法
假单胞菌CSY-67发酵所产的海藻糖合酶最适作用pH为7.5，最适作用温度范围为35℃。
假单胞菌CSY-67的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：
斜面培养：挑取一环假单胞菌CSY-67接种于固体斜面培养基，37℃下恒温培养48h，得一级种子；
摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温37℃，摇床转速200 r/min条件下培养48 h，得二级种子液；
种子罐培养：将二级种子液按照接种量5%(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温37℃，转速200 r/min条件下培养14-18 h；
发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5%(v/v)的比例接入50L发酵罐培养基，恒温 37℃，转速200r/min，设置通风量：0h至5h 为0.25 vvm、5h至20h为0.5 vvm、20h至发酵结束为1.0 vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液pH值为6.5，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为75 h，得到最终发酵液；
将最终发酵液通过提取与精制方法，获得海藻糖合酶成品液体酶制剂。
固体斜面培养基（g/L）：蛋白胨 12，酵母膏 6，琼脂 15，氯化钠 1，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20 min；
种子培养基（g/L）：麦芽糖浆 40，蛋白胨 5，酵母膏 5，硫酸钠 0.8，硫酸镁 0.5，氯化钙 0.1，磷酸氢二钠 0.5，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20 min；
种子罐培养基（g/L）：麦芽糖浆 40，葡萄糖 10，酵母膏 15，玉米浆 5，KH2PO4 1.5，氯化钙 0. 1，pH 7.0，121-123℃灭菌30 min；
发酵罐培养基（g/L）：麦芽糖 80，蛋白胨 10，酵母膏 5，硫酸镁 0.5，氯化钙 0.1，磷酸氢二钾 0.3，pH7.0，121-123℃灭菌30 min；
补料瓶培养基（g/L）：麦芽糖浆450，KH2PO4 5，玉米浆 8，CaCl2 5， pH 4.0，121-123℃灭菌30 min。
海藻糖合酶的提取与精制方法如下：
先将最终发酵液加1%甲苯进行细胞破壁处理，再加入1%珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；
用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；
在浓缩液中加入质量百分比20%（m/v）甘油、0.15%（m/v）山梨酸钾、0.3%(m/v) 苯甲酸钠，调节 pH7.5，然后进行过滤除菌，即得到海藻糖合酶成品液体酶制剂。
提取与精制方法制得的海藻糖合酶成品液体酶制剂产品。
最终发酵液酶活为39865 U/mL，通过提取与精制方法，获得海藻糖合酶成品液体酶制剂酶活为208800 U/mL。
实施例2假单胞菌CSY-67发酵产酶及其所产海藻糖合酶的提取精制方法
假单胞菌CSY-67发酵所产的海藻糖合酶最适作用pH范围为8.5，最适作用温度范围为45℃。
假单胞菌CSY-67的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：
斜面培养：挑取一环假单胞菌CSY-67接种于固体斜面培养基，37℃下恒温培养48h，得一级种子；
摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温37℃，摇床转速200 r/min条件下培养48 h，得二级种子液；
种子罐培养：将二级种子液按照接种量5%(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温37℃，转速800 r/min条件下培养14-18 h；
发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5%(v/v)的比例接入50L发酵罐培养基，恒温 37℃，转速800 r/min，设置通风量：0h至5h 为0.25 vvm、5h至20h为0.5 vvm、20 h至发酵结束为1.0 vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液pH值为6.5，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为85 h，得到最终发酵液；
将最终发酵液通过提取与精制方法，获得海藻糖合酶成品液体酶制剂。
固体斜面培养基（g/L）：蛋白胨 12，酵母膏 6，琼脂 15，氯化钠 1，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20 min；
种子培养基（g/L）：麦芽糖浆 40，蛋白胨 5，酵母膏 5，硫酸钠 0.8，硫酸镁 0.5，氯化钙 0.1，磷酸氢二钠 0.5，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20 min；
种子罐培养基（g/L）：麦芽糖浆 40，葡萄糖 10，酵母膏 15，玉米浆 5，KH2PO4 1.5，氯化钙 0. 1，pH 7.0，121-123℃灭菌30 min；
发酵罐培养基（g/L）：麦芽糖 80，蛋白胨 10，酵母膏 5，硫酸镁 0.5，氯化钙 0.1，磷酸氢二钾 0.3，pH7.0，121-123℃灭菌30 min；
补料瓶培养基（g/L）：麦芽糖浆450，KH2PO4 5，玉米浆 8，CaCl2 5， pH 4.0，121-123℃灭菌30 min。
海藻糖合酶的提取与精制方法如下：
先将最终发酵液加1%甲苯进行细胞破壁处理，再加入5%珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；
用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；
在所述浓缩液中加入质量百分比20%（m/v）稳定剂、0.45%（m/v）防腐剂，调节pH7.5，然后进行过滤除菌，即得到海藻糖合酶成品液体酶制剂。
提取与精制方法制得的海藻糖合酶成品液体酶制剂产品。
最终发酵液酶活为39025 U/mL，通过提取与精制方法，获得海藻糖合酶成品液体酶制剂酶活为207540 U/mL。
实施例3假单胞菌CSY-67发酵产酶及其所产海藻糖合酶的提取精制方法
假单胞菌CSY-67发酵所产的海藻糖合酶最适作用pH范围为8，最适作用温度范围为40℃。
假单胞菌CSY-67的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：
斜面培养：挑取一环假单胞菌CSY-67接种于固体斜面培养基，37℃下恒温培养48h，得一级种子；
摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温37℃，摇床转速200 r/min条件下培养48 h，得二级种子液；
种子罐培养：将二级种子液按照接种量5%(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温37℃，转速500 r/min条件下培养16 h；
发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5%(v/v)的比例接入50L发酵罐培养基，恒温 37℃，转速500 r/min，设置通风量：0h至5h 为0.25 vvm、5h至20h为0.5 vvm、20h至发酵结束为1.0 vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液pH值为6.5，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为80h，得到最终发酵液；
将最终发酵液通过提取与精制方法，获得海藻糖合酶成品液体酶制剂。
固体斜面培养基（g/L）：蛋白胨 12，酵母膏 6，琼脂 15，氯化钠 1，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20 min；
种子培养基（g/L）：麦芽糖浆 40，蛋白胨 5，酵母膏 5，硫酸钠 0.8，硫酸镁 0.5，氯化钙 0.1，磷酸氢二钠 0.5，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20 min；
种子罐培养基（g/L）：麦芽糖浆 40，葡萄糖 10，酵母膏 15，玉米浆 5，KH2PO4 1.5，氯化钙 0. 1，pH 7.0，121-123℃灭菌30 min；
发酵罐培养基（g/L）：麦芽糖 80，蛋白胨 10，酵母膏 5，硫酸镁 0.5，氯化钙 0.1，磷酸氢二钾 0.3，pH7.0，121-123℃灭菌30 min；
补料瓶培养基（g/L）：麦芽糖浆450，KH2PO4 5，玉米浆 8，CaCl2 5， pH 4.0，121-123℃灭菌30 min。
海藻糖合酶的提取与精制方法如下：
先将最终发酵液加1%甲苯进行细胞破壁处理，再加入1~5%珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；
用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；
在浓缩液中加入质量百分比20%（m/v）甘油、0.15%（m/v）山梨酸钾、0.3%（m/v）苯甲酸钠，调节 pH7.5，然后进行过滤除菌，即得到海藻糖合酶成品液体酶制剂。
提取与精制方法制得的海藻糖合酶成品液体酶制剂产品。
最终发酵液酶活为40025 U/mL，通过提取与精制方法，获得海藻糖合酶成品液体酶制剂酶活为210450 U/mL。
实施例4 假单胞菌CSY-67的诱变选育
取两株出发菌株CAO12的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体分散，离心收集菌体，以5%甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为107-108个/mL，以此作为出发菌悬液。
开启常温常压等离子***，以酒精棉擦拭操作室内外，并开启紫外灯灭菌30 min。待***操作室内灭菌结束，后取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上。开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变。诱变时间分别设定为90 s、120 s、150 s、180 s、210 s。每次诱变结束后均将载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1 min。稀释涂布后置于30℃培养箱内培养。
固体肉汤培养基（g/L）： 胰蛋白胨 10，酵母浸粉：5，氯化钠 10，琼脂20，余量为水，pH值7.0；
试管斜面培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏2，KCl 10，MgSO4·7H2O 0.5，琼脂20，余量为水，pH7.2；
高渗固体培养基（g/L）：麦芽糖20，蛋白胨5，牛肉膏2，K2HPO4 1，NaCl 50，MgSO4·7H2O 0.5，琼脂20，余量为水，pH7.2；
产酶培养基（g/L）：麦芽糖20，蛋白胨6，牛肉膏3，K2HPO4 1.2，MgSO4·7H2O 0.3，余量为水，pH7.2；
菌株的初筛：将富集后的菌液依次稀释成 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，分别涂于固体肉汤培养基和高渗固体培养基平板，于37℃和45℃分别培养72 h。
菌株的复筛：从初筛固体平板上挑取大小、形状、颜色不一的具有典型特征的细菌单菌落在固体肉汤培养基上进行划线分离纯化，反复3次后，挑取典型细菌单菌落在固体肉汤培养基试管斜面上划线，37℃培养96 h后于冰箱中4℃保存。
菌株代谢产酶试验（初筛）：将筛选出的菌株接种在含100 mL产酶培养基的500 mL三角瓶中，37℃、200 r/min 摇床培养72 h，5000 r/min离心20 min 收集菌体。用 pH7.2的0.03 mol/L磷酸钠缓冲液洗涤两次，离心条件为：5000 r/min、20 min。然后，将菌体悬浮于9.8 mL、pH7.2 的0.03mol/L磷酸钠缓冲液中，加入0.2 mL甲苯，37℃、200 r/min反应2h。加入10mL、10%麦芽糖溶液，37℃、200 r/min反应10 h后沸水浴10 min灭酶。5000 r/min 离心20 min收集上清液。利用薄层层析法对上清液中糖分进行定性分析，点样量为10μL。
菌株代谢产酶试验（复筛）：将初筛中定性分析含有海藻糖的菌株再进行复筛，每株接5瓶，接种在含100 mL 产酶培养基的500 mL三角瓶中，37℃、200 r/min 摇床培养72h，5000 r/min离心20 min收集菌体，称湿重，测水分。利用HPLC 法对上清液中糖分进行定量分析，点样量为10μL。
摇瓶复筛：
复筛方法：将诱变菌株接入发酵摇瓶进行发酵，30℃，220 r/min，培养62 h后以分光光度法测定各突变株发酵酶活。
通过摇瓶复筛选出5株具有较高酶活的突变株列表如下：
表1原始菌株与具有较高酶活的突变株的发酵液酶活对比
菌株 原始菌 CSY-02 CSY-23 CSY-67 CSY-123 CSY-231
酶活（U/mL） 1432 1571 1592 1768 1601 1632
经再次的摇瓶发酵后选育出CSY-67为稳定的最高酶活菌株。
实施例5 假单胞菌CSY-67发酵性能验证
按照实施例3假单胞菌CSY-67发酵产酶及其所产海藻糖合酶的提取精制方法，进行50L发酵罐验证实验，发酵周期80h，其6批次的发酵产酶情况，平均产酶水平，最终发酵液中酶活为39575 U/mL。表2说明菌株不仅高产海藻糖合酶而且其发酵性能以及其所产的海藻糖合酶的酶活均具有显著的稳定性。
需要说明的是：本发明实施例1-2制备的混合益生菌片剂同样具有上述实验效果，各实施例之间及与上述实验效果差异性不大。
表2 6批次高产海藻糖合酶菌株的发酵产酶情况
批次 发酵周期（h） 最终发酵液中酶活（U/mL） 成品液体酶制剂酶活（U/mL）
1 80 39825 207300
2 80 38560 198984
3 80 40025 210450
4 80 39690 205940
5 80 39400 202875
6 80 39950 209425
实施例6 海藻糖合酶酶活测定方法
（1）粗酶液的制备：发酵液6000 r/min 离心15 min，收集菌体，用20 mmol/L、pH7.0的KH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗涤后离心，收集菌体，配成菌悬液，进行超声处理，超声波功率200 W，超声时间2 s，间隔3 s，总超声时间10 min，所得处理液10000 r/min离心15min，上清液即为粗酶液。
（2）酶活定义：在pH7.4、50℃条件下，每毫升海藻糖合酶每小时催化转化30%麦芽糖溶液产生1 g海藻糖的酶量为1单位（U/mL）
（3）酶活测定：以麦芽糖溶液为底物，用HPLC法测定该酶的酶活。酶活测定体系为800μL含终浓度为30%(W/V)的麦芽糖，20 mmol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲液，pH7.4，在50℃下加入400 μL适当稀释的酶液反60 min后，沸水浴10 min终止酶反应，10000 r/min离心20min，用HPLC法测定生成的海藻糖含量。
实施例7 海藻糖合酶的最适作用pH范围
以本发明所产的酶活力39000 U/mL的海藻糖合酶为基准，在35℃条件下，分别在不同pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5）下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图1所示，酶的最适作用pH范围为7.5-8.5。
实施例8 海藻糖合酶的最适作用温度范围
以酶活力39000 U/mL的海藻糖合酶为基准，在pH值为8.0条件下，分别在不同温度（30、35、40、45、50、55、60）下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图2所示，酶的最适作用温度范围为35℃-45℃。
实施例9 海藻糖合酶的热稳定性
以最终发酵液中酶活力39000 U/mL的海藻糖合酶为基准，在pH值为8.0条件下，80℃下保温0-3 h测定剩余酶活力，如图3所示，80℃保温2 h后剩余酶活为59.5%，具有良好的耐热保存活性，可广泛应用于高温工业生产中，显著地拓展了海藻糖合酶的工业应用范围，提高了海藻糖合酶的应用价值。

Claims (7)

1.一株高产海藻糖合酶的假单胞菌，其特征在于：所述菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）CSY-67，菌株保藏号为CGMCC No.13154。
2.如权利要求1所述一株高产海藻糖合酶的假单胞菌，其特征在于：所述假单胞菌CSY-67发酵所产的海藻糖合酶最适作用pH范围为7.5-8.5，最适作用温度范围为35℃-45℃。
3.如权利要求1-2任一所述的高产海藻糖合酶的假单胞菌的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：
斜面培养：挑取一环假单胞菌CSY-67接种于固体斜面培养基，37℃下恒温培养48 h，得一级种子；
摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温37℃，摇床转速200 r/min条件下培养48 h，得二级种子液；
种子罐培养：将二级种子液按照接种量5%体积比(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温37℃，转速200-800 r/min条件下培养14-18 h；
发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5%体积比(v/v)的比例接入发酵罐培养基，恒温 37℃，转速200-800 r/min，设置通风量：0h至5h 为0.25 vvm、5h至20h为0.5 vvm、20 h至发酵结束为1.0 vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液pH值为6.5，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为75-85 h，得到最终发酵液；
将最终发酵液通过提取与精制方法，获得海藻糖合酶成品液体酶制剂。
4.如权利要求3所述的高产海藻糖合酶的假单胞菌的发酵产酶方法，其特征在于：
所述固体斜面培养基质量体积比（g/L）：蛋白胨 12，酵母膏 6，琼脂 15，氯化钠 1，余量为水，pH 7.0，121℃灭菌20 min；
所述种子培养基质量体积比（g/L）：麦芽糖浆 40，蛋白胨 5，酵母膏 5，硫酸钠 0.8，硫酸镁 0.5，氯化钙 0.1，磷酸氢二钠 0.5，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20 min；
所述种子罐培养基质量体积比（g/L）：麦芽糖浆 40，葡萄糖 10，酵母膏 15，玉米浆 5，KH2PO4 1.5，氯化钙 0. 1，余量为水，pH 7.0，121-123℃灭菌30 min；
所述发酵罐培养基质量体积比（g/L）：麦芽糖 80，蛋白胨 10，酵母膏 5，硫酸镁 0.5，氯化钙 0.1，磷酸氢二钾 0.3，余量为水，pH7.0，121-123℃灭菌30 min；
所述补料瓶培养基质量体积比（g/L）：麦芽糖浆450，KH2PO4 5，玉米浆 8，CaCl2 5，余量为水，pH 4.0，121-123℃灭菌30 min。
5.如权利要求3所述的高产海藻糖合酶的假单胞菌的发酵产酶方法，其特征在于：所述海藻糖合酶的提取与精制方法如下：
先将所述最终发酵液加1%甲苯进行细胞破壁处理，再加入1~5%珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；
用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩,得到浓缩液；
在所述浓缩液中加入20%质量体积比（m/v）稳定剂、0.45%质量体积比（m/v）防腐剂，调节pH7.5，然后进行过滤除菌，即得到海藻糖合酶成品液体酶制剂。
6.如权利要求5所述的高产海藻糖合酶的假单胞菌的发酵产酶方法，其特征在于：所述稳定剂为甘油，所述防腐剂为质量比为1：2的山梨酸钾和苯甲酸钠。
7.如权利要求3所述的高产海藻糖合酶的假单胞菌的发酵产酶方法，其特征在于：
所述提取与精制方法制得的海藻糖合酶成品液体酶制剂产品。
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