CN109134657A - 一种25-羟基维生素d3的抗体制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种25‑羟基维生素D3的抗体制备方法，包括人工抗原制备、动物免疫及脾细胞制备、骨髓瘤细胞的制备、饲养细胞的制备、细胞融合、杂交瘤细胞筛选和亚克隆、25‑羟基维生素D3单克隆抗体纯化等步骤，由于25‑羟基维生素D3本身的分子量太小，不具有免疫原性，本发明将25‑羟基维生素D3偶联卵清白蛋白获得25‑羟基维生素D3人工抗原，所制备的25‑羟基维生素D3单克隆抗体具有效价高、亲和力好，与25‑羟基维生素D3抗原结合力强等优点，可用于免疫荧光、酶联免疫或磁微粒免疫技术等来定性或定量检测人体中25‑羟基维生素D3表达水平，临床辅助预防及治疗佝偻病、骨软化病和婴儿手足搐搦症。

Description

一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法。
背景技术
血清25羟基维生素D3是合成25-OH-VD3的前体，是维生素D的主要循环形式，其半寿期较长,血中浓度较稳定，可直接反映机体维生素D的水平，维生素D参与不但钙磷代谢的调节作用，近年来维生素D被证实具有更为广泛的生物学效应和免疫学效应，包括用以预防及治疗佝偻病、骨软化病和婴儿手足搐搦症，抑制多种类型细胞的增殖，诱导细胞调亡和分化，调节机体免疫***的功能等。因此，血清中的25羟维生素D3已经成为健康体检的重要指标。
现在有越来越多公司参与开发25羟维生素D3检测试剂盒，高品质的抗体，是开发25羟维生素D3检测试剂盒的关键技术和基础，但是当前的25羟维生素D3检测试剂盒，无论使用哪种技术，放射免疫法，胶体金，酶联免疫法，化学发光检测，磁微粒免疫技术，都不能得到与HPLC精确测试相媲美的结果，因此需进一步研发出一种25-羟基维生素D3单克隆抗体，可用于能够快速、准确检测25-羟基维生素D3的免疫检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法，制备的抗体特异性好，亲和力高，能够用于25-羟基维生素D3免疫荧光检测试剂盒，对人体内25-羟基维生素D3蛋白做出准确的检测。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法，包括如下步骤：
(1)25-羟基维生素D3人工抗原制备：将25-羟基维生素D3蛋白与N,N二甲基酰胺混合均匀后，加入三乙胺，混合均匀后，4℃反应，加入氯甲酸异丁酯，混匀4℃反应，得到活化的25-羟基维生素D3蛋白；将OVA(卵清白蛋白)溶于超纯水中，通过氢氧化钠调整pH至8.5，加入N,N二甲基酰胺，混合均匀后，4℃反应，得到活化的卵清白蛋白；将活化的25-羟基维生素D3蛋白与活化的卵清白蛋白混合4℃反应，反应完成后先用PBS缓冲液透析，重复2次，再用超纯水透析，重复2次，即得25-羟基维生素D3人工抗原；
(2)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将25-羟基维生素D3人工抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将25-羟基维生素D3人工抗原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周进行抗原冲击，25-羟基维生素D3人工抗原尾静脉注射，3天后，取效价高小鼠的免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于培养液中；
(3)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞在含10％胎牛血清的完全RPMI1640培养液中进行培养，融合前1天，进行细胞换液并使细胞在融合当天为对数生长阶段；
(4)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，处死未免疫的8周龄KM雌性小鼠，消毒后在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用HAT培养基将沉淀饲养细胞悬浮，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培养箱中培养备用；
(5)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞混合，放入融合管中，离心机离心，弃上清；将1mL 50％PEG4000沿转动的管壁滴入，60s内加完，在5min内加入25mL DMEM培养基，终止反应，离心机离心，弃上清，加入HAT培养基，轻轻吹打使沉淀细胞悬浮；将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI-1640完全培养液换液；
(6)细胞筛选：融合细胞长至孔底1/10面积时，用碳酸盐缓冲液将25-羟基维生素D3人工抗原稀释为5ug/ml，加入酶标板孔中，4℃过夜，弃去孔内液体，磷酸盐缓冲液清洗2次，每孔加封闭液4℃过夜，封闭液为含2％BSA的磷酸盐缓冲液，经洗涤液洗涤后，洗涤液为0.1％Tween20的磷酸盐缓冲液，加入待检杂交瘤细胞培养上清，孵育，经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，孵育，再经洗涤液洗涤后，加入含3％H2O2的邻苯二胺底物液显色，以H2SO4终止反应，读取OD值，选择OD值比阴性对照高5-10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存；
(7)亚克隆-软琼脂法：在培养皿中制备饲养细胞，将琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1％琼脂糖培养液，45℃水浴中温育，吸去平皿上层培养液，加入1％琼脂糖培养液3ml，室温10分钟，取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1％琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层，37℃、7.5％湿润培养10天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养，吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，直至到100％细胞阳性率，最终得到高特异性25-羟基维生素D3杂交瘤细胞株，将高特异性25-羟基维生素D3杂交瘤细胞株液氮保存；
(8)抗体纯化：将上述高特异性25-羟基维生素D3杂交瘤细胞株于无血清培养基中扩增培养，待细胞浓度达105/ml以上时停止加液，再持续培养直至细胞培养液变黄后收集培养液，离心机离心，上清液再经滤膜过滤后，将上清液置于protein-A亲合层析柱中，protein-A亲合层析柱以磷酸盐缓冲液洗涤去除杂蛋白，再以5倍柱体积的甘氨酸溶液洗脱被吸附的抗体蛋白，并加入Tris溶液中和甘氨酸，使pH为7.2，再以10倍柱体积的磷酸盐缓冲液透析16小时后，其中换液2次，透析后的样品再经滤膜过滤后即获得纯化的25-羟基维生素D3单克隆抗体。
本发明具有有益效果：由于25-羟基维生素D3本身的分子量太小，不具有免疫原性，本发明将25-羟基维生素D3进行化学修饰，偶联卵清白蛋白获得25-羟基维生素D3人工抗原；本发明所制备的25-羟基维生素D3单克隆抗体具有效价高、亲和力好，与25-羟基维生素D3抗原结合力强等优点，可用于免疫荧光、酶联免疫或磁微粒免疫技术等来定性或定量检测人体中25-羟基维生素D3表达水平，临床辅助预防及治疗佝偻病、骨软化病和婴儿手足搐搦症。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种25-羟基维生素D3单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)抗原制备：取100mg25-羟基维生素D3蛋白与1ml N,N二甲基酰胺混合均匀后，加入15ul三乙胺，混合均匀后，4℃反应2h，加入50ul氯甲酸异丁酯，混匀4℃反应1h，得到活化的25-羟基维生素D3蛋白；称取200mgOVA(卵清白蛋白)溶于2ml超纯水中，调整pH至8.5，加入1ml N,N二甲基酰胺，混合均匀后，4℃反应2h，得到活化的卵清白蛋白；将活化的25-羟基维生素D3蛋白与活化的卵清白蛋白混合4℃反应4h，反应完成后先用PBS缓冲液(50mM，pH＝7.2)透析6h，重复2次，再用超纯水透析10h，重复2次，即得25-羟基维生素D3人工抗原；由于25-羟基维生素D3本身的分子量太小，不具有免疫原性，缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，需要对25-羟基维生素D3进行化学修饰，偶联获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的25-羟基维生素D3人工抗原；
(2)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将25-羟基维生素D3人工抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为100ug/只，间隔3周，将25-羟基维生素D3人工抗原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为100ug/只，间隔3周进行抗原冲击，100ug25-羟基维生素D3人工抗原尾静脉注射，3天后，小鼠眼球采血，分离血清，用ELISA检测法检测血清中抗25-羟基维生素D3抗体的效价，处死效价高的小鼠，无菌条件下取免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于不完全RPMI1640培养液中；最后一次免疫多采用尾静脉注射，可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分；
(3)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞在含10％胎牛血清的完全RPMI1640培养液中进行培养，融合前1天，进行细胞换液并使细胞在融合当天为对数生长阶段；
(4)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，通过颈脱位处死未免疫的8周龄KM雌性小鼠，75％酒精浸泡5min后，在无菌的条件下，用消毒剪掀起腹部皮肤，暴露腹膜，75％酒精棉擦拭腹膜，注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，针头留置在腹腔内，另一只手持75％酒精棉轻轻按摩腹部1min后，注射器吸出注入的培养液，2000r/min离心5min,弃上清，用5mlHAT培养基将沉淀饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*105个/mL，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml,放置37℃、5％CO2培养箱中培养备用；
细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，饲养细胞有助于杂交瘤细胞的繁殖，同时饲养细胞吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用；
(5)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞以10:1的比例混合，放入融合管中，2000r/min离心5min，弃上清，用手指轻弹管底，使沉淀松散成糊状；将1mL 50％PEG4000沿转动的管壁滴入，60s内加完，在5min内加入25mL DMEM培养基，终止反应，加入速度为：第lmin内加1mL，第2min内加4mL，剩余20mL在5min内加完，1000rpm/min离心5min，弃上清，加入20mL HAT培养基，轻轻吹打使沉淀细胞悬浮；将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，加入量为0.1mL/孔，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI-1640完全培养液换液；
(6)细胞筛选：融合细胞长至孔底1/10面积时，用碳酸盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)将25-羟基维生素D3人工抗原稀释为5ug/ml，以100ul/孔量加入酶标板孔中，4℃过夜，弃去孔内液体，磷酸盐缓冲液清洗2次，每孔加200ul封闭液4℃过夜，封闭液为含2％BSA的磷酸盐缓冲液，经含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤后，加入待检杂交瘤细胞培养上清，以未融合的骨髓瘤细胞培养上清为阴性对照，以免疫小鼠血清为阳性对照，37℃孵育2小时，经含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，37℃孵育1小时，再经含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤后，加入含3％H2O2的邻苯二胺底物液显色10min，以0.2M H2SO4终止反应，在酶标仪读取OD值，选择OD值比阴性对照高5-10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存；
采用ELISA对杂交瘤细胞进行筛选，具有快速、准确、简便，便于一次处理大量样品等特点；
(7)亚克隆-软琼脂法：在培养皿中制备饲养细胞，将2.0％琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1％琼脂糖培养液，45℃水浴中温育，吸去平皿上层培养液，加入1％琼脂糖培养液3ml，室温10分钟，取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1％琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层，37℃、7.5％湿润培养10天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养，吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，直至到100％细胞阳性率，最终得到高特异性25-羟基维生素D3杂交瘤细胞株，将高特异性25-羟基维生素D3杂交瘤细胞株液氮保存；
细胞融合后得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或多个杂交瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的，对杂交瘤细胞进行多次克隆化，才能得到完全同质的单克隆抗体；
(8)抗体纯化：将上述高特异性25-羟基维生素D3杂交瘤细胞株于无血清培养基中扩增培养，待细胞浓度达105/ml以上时停止加液，再持续培养直至细胞培养液变黄后收集培养液，1500rpm/min离心10分钟，上清液再经0.22um滤膜过滤后，将上述上清液上样于protein-A亲合层析柱中，上样完毕后，protein-A亲合层析柱以磷酸盐缓冲液洗涤去除杂蛋白，再以5倍柱体积的甘氨酸溶液(0.1M，pH＝2.7)洗脱被吸附的抗体蛋白，并加入Tris(1M，pH＝9.0)中和甘氨酸，使pH为7.2，再以10倍株体积的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)透析12～16小时后(期间换液2-3次)，透析后的样品再经0.22um滤膜过滤后即获得纯化的25-羟基维生素D3单克隆抗体。
实施例2
对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，杂交瘤细胞染色体分析的具体方法为：
a.在加秋水仙素前36-48小时将杂交瘤细胞传代；
b.秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素(100ug/ml，除菌，-20℃保存)，使最终秋水仙素的浓度为0.5ug/ml，继续培养4小时，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min离心10分钟，弃上清；
c.加入已预热到37℃的0.075mol/L KCl溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴20分钟；
d.向细胞悬液中加入1ml新配制的固定液，混匀，然后1000r/min离心10分钟，弃去上清液；固定液为甲醇与冰醋酸以3：1的比例混合；
e.加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30分钟，然后1000r/min离心10分钟，弃去上清液，重复操作一次，其后加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀，置4℃过夜；
f.取出细胞悬液，1000r/min离心5分钟，吸去大部分上清液，留下0.5-1ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，轻轻摇晃载玻片，使细胞悬液在载玻片上铺展开来，并在酒精灯上方穿过3-5次，自然干燥；
g.用新配制的10％Giemsa染液染色10-20分钟，然后用去离子水洗去染液，自然干燥；
h.镜检：在显微镜下选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析，每份标本应计数100个完整的中期核细胞。
本发明提供的25-羟基维生素D3单克隆抗体制备方法所用试验动物、生物制剂、试剂、仪器均可由市场购得。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)25-羟基维生素D3人工抗原制备：将25-羟基维生素D3蛋白与N,N二甲基酰胺混合均匀后，加入三乙胺，混合均匀后，4℃反应，加入氯甲酸异丁酯，混匀4℃反应，得到活化的25-羟基维生素D3蛋白；将OVA溶于超纯水中，通过氢氧化钠调整pH至8.5，加入N,N二甲基酰胺，混合均匀后，4℃反应，得到活化的卵清白蛋白；将活化的25-羟基维生素D3蛋白与活化的卵清白蛋白混合4℃反应，反应完成后先用PBS缓冲液透析，重复2次，再用超纯水透析，重复2次，即得25-羟基维生素D3人工抗原；
(2)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将25-羟基维生素D3人工抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将25-羟基维生素D3人工抗原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周进行抗原冲击，25-羟基维生素D3人工抗原尾静脉注射，3天后，取效价高小鼠的免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于培养液中；
(3)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞在含10％胎牛血清的完全RPMI1640培养液中进行培养，融合前1天，进行细胞换液并使细胞在融合当天为对数生长阶段；
(4)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，处死未免疫的8周龄KM雌性小鼠，消毒后在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用HAT培养基将沉淀饲养细胞悬浮，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培养箱中培养备用；
(5)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞混合，放入融合管中，离心机离心，弃上清；将1mL 50％PEG4000沿转动的管壁滴入，60s内加完，在5min内加入25mL DMEM培养基，终止反应，离心机离心，弃上清，加入HAT培养基，轻轻吹打使沉淀细胞悬浮；将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI-1640完全培养液换液；
(6)细胞筛选：融合细胞长至孔底1/10面积时，用碳酸盐缓冲液将25-羟基维生素D3人工抗原稀释为5ug/ml，加入酶标板孔中，4℃过夜，弃去孔内液体，磷酸盐缓冲液清洗2次，每孔加封闭液4℃过夜，经洗涤液洗涤后，加入待检杂交瘤细胞培养上清，孵育，经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，孵育，再经洗涤液洗涤后，加入含3％H2O2的邻苯二胺底物液显色，以H2SO4终止反应，读取OD值，选择OD值比阴性对照高5-10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存；
(7)亚克隆：采用软琼脂法对杂交瘤细胞进行亚克隆，克隆数次，直至到100％细胞阳性率，最终得到高特异性25-羟基维生素D3杂交瘤细胞株；
(8)抗体纯化：将上述高特异性25-羟基维生素D3杂交瘤细胞株扩增培养，待细胞浓度达105/ml以上时停止加液，再持续培养直至细胞培养液变黄后收集培养液，离心机离心，上清液经滤膜过滤后，将过滤后的上清液置于protein-A亲合层析柱中，用磷酸盐缓冲液洗涤层析柱去除杂蛋白，再以5倍柱体积的甘氨酸溶液洗脱被吸附的抗体蛋白，并加入Tris溶液中和甘氨酸，使pH为7.2，再以10倍柱体积的磷酸盐缓冲液透析16小时后，透析后的样品再经滤膜过滤后即获得纯化的25-羟基维生素D3单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法，其特征在于，步骤(2)中，小鼠的免疫量为100ul/只/次。
3.如权利要求1所述的一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法，其特征在于，步骤(6)中，洗涤液为0.1％Tween20的磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述的一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法，其特征在于，步骤(6)中，封闭液为含2％BSA的磷酸盐缓冲液。
5.如权利要求1所述的一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法，其特征在于，步骤(5)中，DMEM培养的加入速度为：第lmin内加1mL，第2min内加4mL，剩余20mL在5min内加完。
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