CN117050183B - 一种ptn-ptprz1通路的阻断抗体及其在胶质瘤靶向治疗的应用 - Google Patents

一种ptn-ptprz1通路的阻断抗体及其在胶质瘤靶向治疗的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于肿瘤靶向治疗技术领域，涉及一种PTN‑PTPRZ1通路的阻断抗体及其在胶质瘤靶向治疗的应用。本发明提供一种分泌PTPRZ1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C2023174；本发明还提供上述杂交瘤细胞株分泌的PTPRZ1单克隆抗体，其中优选的单克隆抗体为鼠抗PTPRZ1抗体2F10。本发明还提供了上述PTPRZ1单克隆抗体在制备胶质瘤靶向治疗药以及PTN阻断试剂中的应用。根据上述应用可以得出，本发明公开的鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)可以作为PTN阻断抗体来抑制胶质瘤干细胞生长，进而达到治疗作用。

Description

一种PTN-PTPRZ1通路的阻断抗体及其在胶质瘤靶向治疗的 应用
技术领域
本发明属于肿瘤靶向治疗技术领域，涉及一种PTN-PTPRZ1通路的阻断抗体及其在胶质瘤靶向治疗的应用。
背景技术
胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是一种致死性极高的原发恶性脑肿瘤，因具有高度异质性和侵袭性而难以有效治疗。相关研究表明，胶质瘤干细胞侵袭迁移能力和克隆形成能力的大幅增加是GBM难以彻底清除的关键因素。PTN(Pleiotrophin)是多效生长因子，可旁分泌到细胞外，通过与其受体PTPRZ1(Protein Tyrosine Phosphatase Receptor-type Zpolypeptide1)结合，调控细胞增殖、迁移运动、血管生成等多种生物学功能。研究表明，PTN-PTPRZ1信号通路的过度激活促进GBM的快速增殖、侵袭转移等恶性生物学行为，目前尚缺乏靶向PTN-PTPRZ1信号轴的治疗措施。
PTPRZ1是一种跨膜受体蛋白酪氨酸磷酸酶，在GBM中特异性高表达，在其他组织中不表达或仅微量表达。PTPRZ1以高度硫酸软骨素蛋白聚糖或蛋白聚糖修饰的形式存在。PTN可与PTPRZ1的糖胺聚糖结构通过配受体作用而结合，PTN介导的PTPRZ1二聚化导致PTPRZ1磷酸酶活性抑制，继而激活ERK磷酸化，ERK激活下游与细胞增殖、迁移运动等相关通路，促进细胞增殖和迁移。
因此，如果研发出相应靶向PTPRZ1的单克隆抗体，竞争性阻断PTN与PTPRZ1结合，有望抑制PTN介导的PTPRZ1激活，抑制PTPRZ1下游ERK信号通路的激活，最终降低GBM的增殖和侵袭能力，将为GBM提供新的治疗手段。
而目前缺乏明确抗原识别区序列的PTPRZ1靶向单克隆抗体。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种PTN-PTPRZ1通路的阻断抗体及其在胶质瘤靶向治疗中的应用，具体的，本发明公开的鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)作为PTN阻断抗体可以抑制胶质瘤干细胞生长。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种分泌PTPRZ1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C2023174。
本发明还提供上述杂交瘤细胞株分泌的PTPRZ1单克隆抗体。
优选的，所述PTPRZ1单克隆抗体为鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)，该抗体的抗原识别区序列如下(Kabat)：
重链：
CDR1:DYYML；
CDR2:LVYPYNGGTSYNQKFKG；
CDR3:SDSYVDYFDY；
轻链：
CDR1:KSSQSLLNSRTRKNYLA；
CDR2:WASTRES；
CDR3:KQSYNLYT；
所述PTPRZ1单克隆抗体的氨基酸序列为：
重链如SEQ ID NO:3所示；
轻链如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供编码所述PTPRZ1单克隆抗体的基因，优选的，所述基因的序列为：
重链如SEQ ID NO:1所示；
轻链如SEQ ID NO:2所示。
上述PTPRZ1单克隆抗体为PTN-PTPRZ1通路的阻断抗体。
本发明还提供含有上述基因的重组载体，以及含有该重组载体的宿主细胞。
本发明还提供了上述PTPRZ1单克隆抗体在制备胶质瘤靶向治疗药中的应用。
首先，本发明通过胶质瘤干细胞成球实验，发现本发明的PTPRZ1单克隆抗体显著抑制PTN对胶质瘤干细胞成球能力的促进作用；其次，本发明通过胶质瘤干细胞Transwell实验，发现本发明的PTPRZ1单克隆抗体显著抑制PTN对胶质瘤干细胞迁移、侵袭能力的促进作用；另外，本发明发现PTPRZ1单克隆抗体通过抑制PTN介导的ERK信号通路活化发挥作用。因此，可将本发明PTPRZ1单克隆抗体用于制备PTN阻断试剂。
本发明的有益效果在于：
1、在胶质瘤干细胞成球实验中，本发明公开的鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)显著抑制PTN对胶质瘤干细胞成球能力的促进作用；
2、在胶质瘤干细胞Transwell实验中，本发明公开的鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)显著抑制PTN对胶质瘤干细胞迁移、侵袭能力的促进作用；
3、本发明公开的鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)抑制PTN介导的ERK信号通路活化；
4、总的来说，本发明公开的鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)可以作为PTN阻断抗体来抑制胶质瘤干细胞生长，进而达到治疗作用。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)显著抑制PTN对胶质瘤干细胞成球能力的促进作用；
图2为鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)显著抑制PTN对胶质瘤干细胞迁移能力的促进作用；
图3为鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)显著抑制PTN对胶质瘤干细胞侵袭能力的促进作用；
图4为鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)显著抑制PTN介导的ERK信号通路活化。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明所述杂交瘤细胞株的保藏信息：
保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2023年06月28日，保藏号：CCTCC NO:C2023174，培养物名称及注明的鉴别特征：抗人杂交瘤细胞株2F10(Hybridoma cell line 2F10)。
实施例1.PTPRZ1单克隆抗体的制备
一、重组PTPRZ1蛋白的表达纯化
选取人PTPRZ1基因(UniProtKB：P23471)的特定区域(选取的片段为编码人PTPRZ1的氨基酸26-300区段的基因)克隆至真核表达载体pSIN-EF-1a-puro获得真核表达质粒。将表达质粒转染HEK293细胞后进行悬浮培养5天，离心收集细胞上清，通过镍柱纯化和阴离子交换纯化得到目的蛋白(重组PTPRZ1蛋白)。
二、小鼠免疫及抗体检测
将弗氏完全佐剂与浓度为2mg/mL的抗原蛋白(重组PTPRZ1蛋白)按等体积混合并乳化，将乳化完成的抗原免疫6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，采用脚底注射的方式，每只小鼠注射100μg抗原蛋白。初次免疫完成两周后，将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，再次采用脚底注射的方式，每只小鼠注射100μg抗原蛋白。两周以后通过尾静脉采血，离心收集上清并用ELISA检测血清效价，并选取血清效价>8万的小鼠开展融合前的加强免疫。
三、B细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选和亚克隆
1.脾脏B淋巴细胞和SP2/0细胞悬液的制备
取用重组PTPRZ1蛋白免疫好的雌性Balb/c小鼠，摘除眼球放血处死，眼血离心后收集血清作ELISA的阳性对照，无菌操作取出小鼠腹股沟***，放入盛有10mL不完全培养基的玻璃皿中，洗涤，小心剥去周围的***和脂肪组织，换一玻璃皿，将脾脏捞出，置于200目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，同时不时用不完全培养基冲洗，使脾细胞穿过网孔进入溶液中，将脾细胞移至10mL玻璃离心管中，1500rpm水平离心10分钟，去上清。同法，用不完全培养基10mL洗涤细胞1次，离心收集沉淀的细胞，将细胞用10mL不完全培养基重悬混匀，细胞计数约为1×108个细胞。
将SP2/0细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇晃，直至细胞溶液完全溶解，将细胞转移到10mL离心管中，1500rpm水平离心10分钟，弃上清，10mL完全培养液重悬沉淀，把细胞悬液转移到50mL培养瓶中，置37℃、5％ CO2培养箱中培养。待细胞生长良好后用含8-AG的1640培养基筛选细胞一周；融合前2天，将1瓶细胞传至4瓶，则融合当天细胞正处于对数生长期，活力正好，细胞大小均匀，圆而透亮，融合当天，用弯头滴管将SP2/0细胞从管壁上轻轻吹下，收集于离心管中，离心，弃上清，沉淀用1640不完全培养基洗涤后，10mL不完全培养基重悬，细胞计数，约为5×107个。
2.饲养细胞的制备
取未免疫的雌性大鼠，摘眼球放血处死，70％乙醇浸泡消毒5分钟，剪开大鼠皮肤，用镊子提起腹膜，用剪刀剪一小口，弯头滴管吸取预冷的不完全培养基冲洗腹腔，将洗液吸至50mL离心管中。同法，用不完全培养基冲洗腹腔3次，收集洗液，室温下1000rpm水平离心10分钟，去上清，10mL不完全培养基重悬细胞并计数。
3.骨髓瘤细胞和脾脏B淋巴细胞融合
融合前将PEG 1450置于37℃培养箱中预温，吸取1×107个骨髓瘤细胞悬液和1×108个脾脏B淋巴细胞悬液至一个50mL无菌离心管中，补加30mL RPMI-1640培养基，充分混匀，1500rpm离心10分钟，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37℃水浴，用滴管吸取0.8mL预温的50％ PEG1450溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，在1分钟左右加完，然后静置90秒，逐滴加入37℃预温的RPMI-1640培养基30mL终止融合，3分钟之内加完，速度先慢后快，动作轻柔，将离心管在37℃培养箱中静置5分钟，取出离心管，1500rpm离心5分钟，弃去上清，加入10mL HAT培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀，将融合细胞接种至已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，按100μL/孔，每块培养板留6孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37℃、5％ CO2培养箱中培养。
融合后第4-5天即可在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并补加HAT培养基100μL，第10-12天可用间接ELISA法测杂交瘤效价，第14-15天换HAT培养基培养。
4.特异性杂交瘤细胞的筛选
初步筛选：融合后12-15天，待细胞长到满培养孔的1/4-1/2孔底时，采用游离ELISA法检测培养上清，筛选阳性克隆；以山羊抗小鼠多抗包被酶标板(0.5μg/孔)，4℃过夜，洗涤缓冲液洗涤5次，每次5分钟，拍干液体，加入50μL细胞培养上清和50μL的0.2％的PBST，阳性对照选小鼠的免疫血清，阴性对照选SP2/0培养上清，空白对照用洗涤液，37℃孵育1小时；使用生物素标记重组PTPRZ1蛋白得到PTPRZ1-生物素，洗涤酶标板后加入100μLPTPRZ1-生物素稀释液(约0.5μg/mL)37℃孵育1小时。洗涤酶标板以后，再加入1:5000稀释的链霉素亲和素-HRP，37℃孵育30分钟。洗涤，拍干液体，加新鲜配制的TMB溶液100μL/孔，室温暗处反应3-5分钟，加终止液每孔50μL终止反应，酶标仪检450nm吸光度值。
5.复核筛选
采用细胞ELISA方法进行复核筛选。选取前一步骤中显色值OD450>0.5的细胞孔用于复核筛选，其余细胞孔淘汰。于96孔细胞培养板中培养胶质瘤成球细胞，约4×104个细胞/孔，贴壁培养过夜。第二天吸走培养基，用PBS清洗两遍，使用4％ PFA固定处理10分钟。吸走固定液，用PBS清洗2遍。取50μL待查的细胞上清加入细胞ELISA孔，于室温条件300rpm孵育1小时。吸走上清，用洗涤缓冲液洗涤2次，拍干液体后，加入1:5000稀释的HRP标记山羊抗鼠多抗，于室温条件300rpm孵育1小时。洗涤，拍干液体，加新鲜配制的TMB溶液100μL/孔，室温暗处反应3-5分钟，加终止液每孔50μL终止反应，酶标仪检450nm吸光度值。选出显色值>0.3的细胞进行后续克隆化培养。
结果显示，以重组PTPRZ1蛋白为抗原，先后免疫雌性Balb/c小鼠6只，共融合2次，先后共筛选获得5株能分泌高亲和力的PTPRZ1抗体的杂交瘤细胞株，经3次克隆化和ELISA筛选后，得到分泌PTPRZ1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将这些杂交瘤细胞经数次冻存，体外传代培养3个月以上均能稳定分泌PTPRZ1单克隆抗体，最终冻存于液氮罐。
四、抗体的纯化制备
将经过筛选及克隆化所得目的杂交瘤细胞扩大培养，并接种至摇瓶进行无血清摇瓶培养发酵。按照1×106个/mL的浓度接种摇瓶，于37℃，65rpm的无菌条件连续培养4天。发酵完成后，收取培养液，于15℃，4000g离心条件离心30分钟，收取离心上清，并用0.45μm滤膜对离心上清进行过滤，收集滤液。采用蛋白G纯化柱进行亲和纯化，得到目的抗体。
五、抗体的亚型鉴定及基因序列克隆
采用Southern Biothech公司的SBA Clonotyping System-HRP试剂盒，按照说明书的操作来鉴定单克隆抗体重链和轻链的亚型。
具体操作为：用包被液(0.05M pH＝9.5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液)将捕获抗体稀释至1μg/mL，按照100μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液(洗板液)洗板3次。用稀释液(1％BSA,0.1％PBST)按照1:1稀释待检杂交瘤细胞的培养上清，按照100μL/孔加入酶标板，于37℃孵育30分钟。用稀释液将对应的酶标抗体(Ig-HRP、IgG1-HRP、IgG2a-HRP、IgG2b-HRP、IgG3-HRP、IgM-RP、kappa-HRP、lambda-HRP)按照1:3000稀释。用洗板液洗板3次后每孔加入100μL稀释的酶标抗体，于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液，约5分钟(视反应强弱而定)之后加入2M硫酸终止反应，读取450nm吸光值。经过鉴定，本发明抗体的重链均为IgG2a，轻链均为Kappa。根据抗体亚型结果，采用成熟的技术路线克隆抗体基因序列，具体的，收集生长状态良好的杂交瘤细胞，利用Thermo公司的Trizol提取杂交瘤细胞总RNA，按照Takara公司的PrimerScript II ReverseTranscriptase说明书的操作方法将mRNA逆转录为cDNA，于-20℃冻存备用。
反转录具体操作流程如下：
首先配制10μL总体积的模板RNA/引物DNA的预混液，其中包括1μL 10μM浓度的逆转录引物引物(Oligo d(T)18Primer)，4μL浓度为2.5mM的dNTP混合液，5μL RNA(总量小于5μg)。混匀之后于65℃处理5分钟，立即放于冰上。向预混液中加入4μL 5×PrimeScript II缓冲液，20单位的RNA酶抑制剂，1μL Primer Script II RTase(200单位)，混匀之后于42℃反应60分钟，再于70℃处理15分钟，之后放于冰上冷却备用。
然后以cDNA为模板，采用文献(Sequencing and cloning of antigen-specificantibodies from mouse memory B cells，Nature Protocols，2016Oct；11(10):1908-1923.doi:10.1038/nprot.2016.102.)报道的抗体基因扩增引物分别独立进行扩增尝试，筛选出能够高效扩增抗体基因的引物。按南京诺唯赞公司的Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase说明书的操作方案进行PCR。
PCR反应体系为：25μL 2×Phanta、1μL dNTP、4μL 10uM引物对、4μL杂交瘤细胞cDNA、1μL DNA polymerase、15μL dd H2O，总反应体积为50μL。扩增条件为：预变性94℃，3分钟；变性94℃，30秒；退火56℃，30秒；延伸72℃，2分钟。按照OMEGA公司OMEGA GelExtraction Kit说明书对PCR产物进行胶回收，扩增产物链接T载体以后经过质粒测序获得抗体基因序列。
实施例2.PTPRZ1单克隆抗体亲和力SPR实验
一、捕获分子偶联
配制运行缓冲液(0.01M HEPES,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05％ Tween-20，pH＝7.4)，连接运行缓冲液试剂瓶至Biacore T200(GE Healthcare)。将CM5芯片置于芯片仓，运行Primer程序，冲洗***管路。用10mM醋酸钠缓冲液(pH＝5.0)将Anti-Mouse IgG稀释20倍，装入EP管，另将氨基偶联相关试剂装入EP管，置于试剂架上，放入Biacore T200样品仓，运行手动程序，依次进行芯片活化、偶联配体、封闭三个步骤，将Anti-Mouse IgG共价偶联至CM5芯片的4个通道。
二、亲和力测定
使用HEPES运行缓冲液将配体及分析物稀释至目的浓度。将配体及分析物装入EP管，置于试剂架上；将再生液10mM甘氨酸(pH＝1.7)，装入EP管，置于试剂架上。将试剂架放入Biacore T200样品仓，打开亲和力测定程序，芯片流路选择“2-1、3-1、4-1”通道，采用多循环动力学方法(设置参数：捕获通道2/3/4，流速10μL/分钟，捕获45秒；分析物1、2、3、4通道，流速30μL/分钟，进样120秒，解离900秒；再生液流速30μL/分钟，再生时间90秒。芯片仓与样品仓温度选择25℃，测定分析物与配体亲和力。动力学数据使用1:1结合模型分析。
通过SPR实验检测5株PTPRZ1抗体亲和力。所有抗体的KD值均在可信范围内(KD在E-08M级)，其中鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)KD值最低，为3.31E-08M，说明鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)的抗体亲和力最佳。
鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)的抗原识别区序列如下(Kabat)：
重链：
CDR1:DYYML；
CDR2:LVYPYNGGTSYNQKFKG；
CDR3:SDSYVDYFDY；
轻链：
CDR1:KSSQSLLNSRTRKNYLA；
CDR2:WASTRES；
CDR3:KQSYNLYT。
实施例3.鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)显著抑制PTN对胶质瘤干细胞成球能力的促进作用
1、建立胶质瘤干细胞，具体方法如下：取胶质瘤肿瘤组织与木瓜蛋白酶解离***(Worthington Biochemical)分离，分离的肿瘤细胞在干细胞培养基中培养。胶质瘤干细胞培养基为Neurobasal medium基础培养基，再加入1×B27补充剂(Gibco)，表皮生长因子(20ng/ml，PeproTech)和碱性成纤维细胞生长因子(20ng/ml，PeproTech)，培养6小时后。然后用异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗CD15抗体(BD Biosciences)和CD133抗体(Miltenyi，130-090-854)在4℃下标记细胞30分钟，然后用流式分离胶质瘤干细胞(CD15+/CD133+)。
2、取对数生长期胶质瘤干细胞，弃掉培养基，加入PBS洗三次，加入0.25％胰蛋白酶消化2分钟，用含10％FBS的DMEM培养基终止消化。
3、离心300g，5分钟，弃上清，PBS洗三次。
4、用1mL Neurobasal medium干细胞培养基重悬，细胞计数。
5、将细胞分为四组，分别为对照组、10ng/mL重组人PTN处理组、1μg/mL鼠抗PTPRZ1抗体处理组和10ng/mL重组人PTN+1μg/mL鼠抗PTPRZ1抗体四组。每组10个复孔，每孔接种40个细胞到96孔板中，每2天进行补液。
6、10天后观察细胞成球情况，并拍照记录。
通过成球实验检测胶质瘤干细胞成球能力情况。结果如图1所示，与对照组相比，加入重组人PTN(购自北京义翘神州公司)可以促进胶质瘤干细胞成球能力，而加入鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)则不影响胶质瘤干细胞成球能力，当同时加入重组人PTN和鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)后，胶质瘤干细胞成球能力大幅降低，说明鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)作为中和抗体可以有效阻断PTPRZ1以抑制PTN对胶质瘤干细胞自我更新和成球能力的促进作用。
实施例4.鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)显著抑制PTN对胶质瘤干细胞迁移能力的促进作用
1、制备胶质瘤干细胞悬液
收集处于对数生长期的胶质瘤干细胞，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗三遍，用无血清培养基重悬。调整细胞密度至1×105/mL。取200μL细胞到1.5mL EP管中，再分别加入PBS(对照)、10ng/mL重组人PTN、1μg/mL鼠抗PTPRZ1抗体和10ng/mL重组人PTN+1μg/mL鼠抗PTPRZ1抗体，混匀后取上述细胞悬液加入Transwell小室上室中，24孔板下室加入600μL含5％FBS的DMEM培养基。
2、培养细胞
放入CO2培养箱中，培养24小时。
3、细胞染色
取出Transwell小室，PBS洗三次，4％PFA室温固定15分钟，结晶紫染色20分钟，蒸馏水洗三次。用棉签擦去Transwell上室内的细胞，37℃晾干后拍照。
通过Transwell实验检测胶质瘤干细胞迁移情况。结果如图2所示，与对照组相比，加入重组人PTN促进胶质瘤干细胞迁移能力，而加入鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)则不影响胶质瘤干细胞迁移能力，当同时加入重组人PTN和鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)后，胶质瘤干细胞迁移能力大幅降低，说明鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)中和抗体可以显著抑制PTN对胶质瘤干细胞迁移能力的促进作用。
实施例5.鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)显著抑制PTN对胶质瘤干细胞侵袭能力的促进作用
1、Transwell小室制备
将Matrigel与DMEM培养基进行1:1稀释，吸取稀释液均匀涂抹在Transwell小室底部膜的上室面，37℃晾干。
2、制备胶质瘤干细胞悬液
消化胶质瘤干细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗三遍，用无血清培养基重悬。调整细胞密度至1×105/mL。取200μL细胞到1.5mL EP管中，对应加入重组人PTN、鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)。取上述细胞悬液200μL加入Transwell小室上室中，24孔板下室加入600μL含5％FBS的DMEM培养基。
3、培养细胞
放入二氧化碳培养箱中，培养24小时。
4、细胞染色
取出Transwell小室，PBS洗三次，4％PFA室温固定15分钟，结晶紫染色20分钟，蒸馏水洗三次。用棉签擦去Transwell上室内的细胞，37℃晾干后拍照。
通过Transwell实验检测胶质瘤干细胞侵袭情况。结果如图3所示，与对照组相比，加入重组人PTN促进胶质瘤干细胞侵袭能力，而加入鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)则不影响胶质瘤干细胞侵袭能力，当同时加入重组人PTN和鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)后，胶质瘤干细胞侵袭能力大幅降低，说明鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)中和抗体可以显著抑制PTN对胶质瘤干细胞侵袭能力的促进作用。
实施例6.鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)抑制PTN介导的ERK信号通路活化
1、收集胶质瘤干细胞，用枪头吸除培养皿中的培养基，加PBS清洗，吸除PBS；
2、用细胞刮收集培养皿中全部贴壁细胞，装入离心管中，300g离心5分钟；
3、向细胞沉淀中加入配好的RIPA蛋白裂解液(RIPA:蛋白酶/磷酸酶抑制剂＝100：1)，充分混匀，置于冰上裂解30分钟，每隔5分钟充分震荡，直至无白色沉淀；
4、4℃离心机12000g，离心30分钟，吸取上清液置于离心管中，冰上保存；
5、按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度，562nm测定吸光值，计算出蛋白浓度；
6、将蛋白样品用RIPA调至等浓度后，按照3:1体积比加入4×loading buffer，用枪头混匀，在95℃金属浴锅中加热10分钟；
7、取20μg蛋白和5μL marker缓慢加入电泳槽拔掉梳子的电泳道中，恒压跑电泳，初始电压为80V，大约30分钟蛋白进入分离胶后，设置电压为120V，大约再跑60分钟；
8、电泳结束后甲醇激活PVDF膜1分钟，放入转膜液，滤纸需至少提前15分钟用转膜液浸湿，组装电转夹子(由正极至负极顺序为海绵、薄滤纸、PVDF膜、电泳凝胶、薄滤纸、海绵)，三明治法压紧，并用滚轮赶走气泡，恒流150mA跑电转大约90分钟；
9、电转结束后，将PVDF膜置于配置好的封闭液中，室温震荡封闭60分钟；
10、用PBST轻柔洗去封闭液，按照说明书浓度用抗体稀释液配制好一抗溶液，4℃过夜震荡孵育；
11、将PVDF膜用PBST室温震荡洗3次，每次5分钟；
12、二抗室温震荡孵育60分钟；
13、将PVDF膜用PBST室温震荡洗3次，每次5分钟；
14、用ECL试剂盒进行显影。
通过免疫印迹实验检测胶质瘤干细胞ERK蛋白活化情况。结果如图4所示，与对照组相比，加入重组人PTN促进胶质瘤干细胞磷酸化ERK表达，而加入鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)则不影响胶质瘤干细胞磷酸化ERK表达，当同时加入重组人PTN和鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)后，胶质瘤干细胞磷酸化ERK表达显著降低，说明鼠抗PTPRZ1抗体(2F10)中和抗体抑制PTN介导的通过ERK信号通路活化。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种分泌PTPRZ1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO: C2023174。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的PTPRZ1单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的PTPRZ1单克隆抗体，其特征在于，所述PTPRZ1单克隆抗体的重链的CDR1的序列为 DYYML、CDR2的序列为LVYPYNGGTSYNQKFKG、CDR3的序列为SDSYVDYFDY；
PTPRZ1单克隆抗体的轻链的CDR1的序列为KSSQSLLNSRTRKNYLA、CDR2的序列为WASTRES、CDR3的序列为KQSYNLYT。
4.根据权利要求2所述的PTPRZ1单克隆抗体，其特征在于，所述PTPRZ1单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.编码权利要求2-4任一项所述的PTPRZ1单克隆抗体的基因。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，所述PTPRZ1单克隆抗体的重链的基因序列如SEQ ID NO:1所示、轻链的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
7.含有权利要求5或6所述的基因的重组载体。
8.含有权利要求7所述的重组载体的宿主细胞。
9.权利要求2-4任一项所述的PTPRZ1单克隆抗体在制备胶质瘤靶向治疗药物中的应用。
10.一种药物，其特征在于，所述药物为胶质瘤靶向治疗药物，所述药物中含有权利要求2-4任一项所述的PTPRZ1单克隆抗体。
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