CN106381289A - 抗25‑羟基维生素d3单克隆抗体及其制备细胞株和方法 - Google Patents

抗25‑羟基维生素d3单克隆抗体及其制备细胞株和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供抗25‑羟基维生素D3单克隆抗体及其制备细胞株和方法。通过优化杂交瘤细胞制备过程，和/或优化单克隆细胞株的筛选过程，从而得到产生抗25‑羟基维生素D3单克隆抗体的细胞株及单克隆抗体。本发明优化了制备细胞株或抗体的制备步骤，减少了筛选次数，提高了抗25‑羟基维生素D3单克隆抗体细胞株的制备效率，降低了生产成本。另外，本发明的单克隆抗体的亲和力大于3.84×109，其与25‑羟基维生素D2的交叉反应低于10％。

Description

抗25-羟基维生素D3单克隆抗体及其制备细胞株和方法
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，具体地涉及一种抗25-羟基维生素D3单克隆抗体及其制备细胞株和方法。
背景技术
维生素D是一种脂溶性维生素，也被看作是一种作用于钙、磷代谢的激素前体。目前已知的维生素D至少有10种，但最重要的是维生素D2(麦角骨化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。维生素D3是维生素D中生物代谢率最高的一种形式。
维生素D3(胆钙化醇)除存在于少数动物性食物之外，主要是由人体自身皮肤中的7-脱氢胆固醇经紫外线照射后形成的，而7-脱氢胆醇则是由胆固醇转变生成的，所以有人叫它太阳维生素。如果孩子能充分接受阳光直射皮肤4-6小时以上的话，自身合成的维生素D3，就基本上能满足。另外，维生素D3还可来自动物性食物，如肝类，尤其是由海产类的鱼肝中提炼的鱼肝油。
维生素D3没有活性，在肝脏25-羟化酶作用下在25碳位加入羟基，生成25-羟基维生素D3。25-羟基维生素D3是维生素D3在血液中主要活性存在形式。维生素D3缺乏可导致儿童佝偻病的发生。最新研究显示，维生素D3还与肿瘤相关，检测人体25-羟基维生素D3含量尤其重要。
目前，临床上对维生素D3的定量检测已成为常规检测项目和体检项目。25-羟基维生素D3的定量检测主要有理化检验方法和免疫学方法。理化检验方法采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)，由于存在仪器昂贵、样本前处理复杂、过程繁琐费时等缺陷，该方法的应用受到限制。免疫学方法具有灵敏、快速、特异和简便等优势，现在成为维生素D3测定的主流方法。此类方法的关键在于制备亲和力强、纯度高且成本低的高质量抗体。
目前，现有技术中已公开了针对25-羟基维生素D的多种抗体。例如，中国专利CN105352958A公开了一种总25-羟基维生素D检测试剂盒，其中所述使用的抗体能与维生素D2和D3同时反应。中国专利CN103857698A也公开了一种针对25-羟基维生素D2和D3的抗体。此外，中国专利CN101273062A公开了一种抗25-羟基维生素D的抗体，其中所述抗体与25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3两种25-羟基维生素D形式均能反应。
如上所述，目前大部分针对25-羟基维生素D的抗体并不能区分，或者至少不能很好地区分维生素D2和D3。另外，在目前针对25-羟基维生素D3的抗体中，由于制备过程中引入的交联基团的影响，致使所得抗体亲和力低。此外，现有的抗体制备方法中为了得到单克隆抗体，需要进行多次反复筛选以排除针对交联基团的抗体，因此，费时费力，增加了抗体制备成本。
因此，存在对于建立一种快速简便，低成本制备高亲和力、灵敏度高的单克隆抗体的需求。
发明内容
为了解决至少部分上述技术问题，本发明通过优化杂交瘤细胞制备过程，和/或优化单克隆细胞株的筛选过程，从而得到产生抗25-羟基维生素D3单克隆抗体的细胞株，并基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的一方面，提供一种细胞株的制备方法，其中所述细胞株产生抗25-羟基维生素D3单克隆抗体，所述方法包括：
a)用免疫抗原免疫动物的步骤，其中所述免疫抗原为通过使作为载体的大分子蛋白质与作为半抗原的25-羟基维生素D3经由交联基团偶联制得的非水溶性抗原，且所述大分子蛋白质与所述25-羟基维生素D3的偶联摩尔比为1:80至1:100；
b)细胞融合步骤，使所述动物的脾细胞与同系骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞；
c)利用筛选抗原筛选阳性细胞株的步骤，其中所述筛选抗原不包含所述交联基团。
在某些实施方案中，所述大分子蛋白质为白蛋白。例如，人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白等，优选牛血清白蛋白。
在某些实施方案中，所述交联基团为二羧酸类，例如亚乙基二羧酸酯键。
在某些实施方案中，所述筛选抗原不包含所述交联基团，且不包含所述大分子蛋白质。
在某些实施方案中，所述筛选抗原为大分子蛋白质与25-羟基维生素D3氨基衍生物的偶联分子。
在某些实施方案中，使用免疫抗原与用于将其分离的凝胶的混合物直接免疫动物。优选使用SDS-PAGE凝胶与免疫抗原的混合物。
本发明的另一方面，提供一种细胞株，其通过本发明所述的方法制备获得。
本发明的再一方面，提供一种生产抗25-羟基维生素D3单克隆抗体的方法，其包括本发明所述的细胞株的制备方法作为其中的步骤，或者包括培养本发明所述细胞株的步骤。
本发明的又一方面，提供一种单克隆抗体，其与25-羟基维生素D3的亲和力常数3.84×109，与25-羟基维生素D2的交叉反应低于10％，优选低于8％，更优选低于5％，甚至低于3％。优选地，所述单克隆抗体通过本发明所述的制备方法获得，或通过上述生产抗25-羟基维生素D3单克隆抗体的方法获得。
在某些实施方案中，本发明制备的免疫抗原具有更高的免疫原性，能更强烈地刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生相应抗体和致敏淋巴细胞。
在某些实施方案中，本发明的免疫抗原克服了抗原纯化时抗原的来源有限或性质不稳定，提纯时易变性的缺陷。
在某些实施方案中，本发明优化了制备细胞株或抗体的步骤，减少了筛选次数，提高了抗25-羟基维生素D3单克隆抗体细胞株的制备效率，降低了生产成本。
在某些实施方案中，本发明的抗体制备方法排除了人工抗原制备中引入的交联基团对制备的抗体的影响。
在某些实施方案中，本发明制备得到的抗体具有更高的亲和力，并且与25-羟基维生素D2的交叉反应低。
附图说明
图1本发明示例性免疫抗原偶联结果电泳图(SDS-PAGE胶)。
图2本发明示例性筛选抗原偶联结果电泳图(SDS-PAGE胶)。
图3本发明示例性25羟基VD3抗体(抗体1至6)的亲和力图，其中纵坐标为吸光度，横坐标为将1mg/ml的抗体按倍比稀释法进行稀释的次数。
图4本发明示例性25羟基VD3抗体(抗体3)的亲和力图，其中纵坐标为吸光度，横坐标为将1mg/ml的抗体按倍比稀释法进行稀释的次数。
具体实施方式
通过解释以下本申请的优选实施方案，本发明的其他目的和优点将变得清楚。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的实验方法、测定或测试方法，但是在本发明的实验、测定或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法或实验。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。本发明中所述的“至少之一”或“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。
本发明中所述的“细胞株”是指单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群体。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。从培养代数来讲，本发明的细胞株可培养到40-50代。从细胞株的来源来讲，其可以是任何哺乳动物细胞或人工处理细胞，例如融合细胞。优选地，本发明的细胞株为小鼠来源的细胞。
本发明中所述的“25-羟基维生素D3”是指在下式结构的化合物(维生素D3，缩写VD3)的第25位羟基化的化合物：
已知25-羟基维生素D3本身都不能产生免疫反应。将维生素D代谢组分化学活化以及使它们与载体分子或报告基团结合并不是件容易的事情。因此，为了使免疫成功，必备条件是制备一种如包含25-羟基维生素D3作为半抗原的缀合物。
本发明中所述的“免疫抗原”有时也简称为“免疫原”或“抗原”，是指具有免疫原性和反应原性的物质。本发明的免疫抗原是指通过使作为载体的大分子蛋白质与作为半抗原的25-羟基维生素D3经由交联基团偶联制得的非水溶性抗原。需要说明的是，本发明使用的免疫抗原需要为非水溶性抗原。常规技术手段中偶联完毕后所得抗原水溶性抗原。
本发明中，免疫抗原中大分子蛋白质与25-羟基维生素D3的摩尔比为1:5至1:150，优选1:50至1:100，更优选1:80至1:100，例如，1:90，1：100等。免疫抗原中25-羟基维生素D3的比例越高，则制备得到的抗原越不容易水溶。
本发明中，所述“交联基团”是指连接大分子蛋白质与25-羟基维生素D3的基团。优选地，交联基团为多元羧酸的衍生物，如多元羧酸酯键。所述多元羧酸包括，但不限于二元羧酸、三元羧酸、四元羧酸等。优选二元羧酸。从减小对抗体的影响的角度，所述多元羧酸的碳原子数优选为2-10，更优选3-8，进一步优选4-6，最优选4。具体实例包括琥珀酸等。
本发明中，所述“交联基团”的位置优选位于25-羟基维生素D3的3位。优选地，交联基团通过多元羧酸的-COOH与25-羟基维生素D3的3位-OH通过化学反应而连接。另外，多元羧酸的另一-COOH与大分子蛋白质上的-NH2 +反应而与载体连接。
本发明中，所述“氨基衍生物”是指，其具体实例包括，但不限于式-(CH2)nNH-表示的化合物，其中n为2-10，更优选3-8，进一步优选4-6的整数，最优选4。
本发明所述的细胞株的制备方法即为淋巴细胞杂交瘤细胞的制备方法。主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等。具体如下：
1、动物免疫
(1)抗原制备
制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好。实践中通常采用纯化的免疫抗原进行免疫。
然而，本发明发现，采用未纯化的免疫抗原进行免疫具有预料不到的技术效果。具体地，本发明采用切胶免疫的方法进行免疫，避免了直接与佐剂乳化时不能形成油包水缓释乳膏的困境，可以使免疫效果得到非常大的提升。同时，克服了抗原的来源有限或性质不稳定，提纯时易变性的缺陷。因此，本发明的免疫方法中对抗原只需初步提纯，甚至不提纯。具体地，优选使用与含分离凝胶的混合物直接免疫动物。在免疫抗原分离时使用的凝胶可为SDS-PAGE凝胶、琼脂凝胶等。本发明中，所述的免疫方法可使用本领域内通常使用的任何方法，例如，注射免疫、口服免疫、气雾免疫等方法。
(2)免疫动物的选择
根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。本发明中，优选所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，优选用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，也可免疫其他动物，例如，兔、鸡、狗或灵长类等。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，染色体容易丢失，所以优选同种细胞之间的杂交。
(3)免疫程序的确定
免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应根据抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等而确定。
免疫途径包括，但不限定体内免疫法，例如皮下注射、腹腔或静脉注射，也可采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫优选采用腹腔或静脉注射，优选后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。
本发明的免疫方法还可包括体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞(或***细胞，或外周血淋巴细胞)取出体外，在一定条件下与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。
2、细胞融合
(1)主要试剂的配制
a、细胞培养基
杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM两种基础培养基，这些培养基均为本领域内已知的。
·不完全RPMI-1640培养基：
RPMI-1640培养基原液96ml
100×L.G.溶液(L-谷氨酸)1ml
双抗溶液1ml
7.5％NaHCO3溶液1-2ml
HEPES溶液1ml
·不完全DMEM培养基：
DMEM 13.37g
超纯水或四蒸水980ml
NaHCO3 3.7g
双抗溶液10ml
100×L.G.溶液10ml用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。
·完全RPMI-1640或DMEM培养基：
不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml
小牛血清15-20ml
用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。
·HT培养基：
完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml
HT贮存液1ml
·HAT培养基：
完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml
HT贮存液1ml A贮存液1ml
b、氨基喋呤(A)贮存液(100×，4×10-5mol/L):
称取1.76mg氨基喋呤(Aminopterin MW 440.4)，溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶(2ml/瓶)，-20℃保存。
c、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L):
称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶(2ml/瓶)，-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。
d、L-谷氨酰胺(L.G.)溶液(100×，0.2mol/L):
称取2.92g L-谷氨酰胺(L-glutamine，MW 146.15)，用100ml不完全培养液或超纯水(或四蒸水)溶解，过滤除菌，分装小瓶(4-5ml/瓶)，-20℃冻存。
e、青、链霉素(双抗)溶液(100×):
取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶(4-5ml/瓶)，-20℃冻存。
f、7.5％NaHCO3溶液:
称取分析纯NaHCO3 7.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶(4-5ml/瓶)，盖紧瓶塞，4℃保存。
g、HEPES溶液(1mol/L):
称取23.83g HEPES，N-2-羟乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸，MW238.3)溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶(4-5ml/瓶)，4℃保存。
h、8-氮鸟嘌呤贮存液(100×):
称取200mg 8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine，MW 152.1)，加入4mol/LNaOH 1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20℃冻存。使用时按1％浓度加入到培养液中(即终浓度为20ug/ml)。
i、50％PEG:
称取PEG 1000或4000 20-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，0.6ml分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20℃存放备用。临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许7.5％NaHCO3调pH至8.0，或购买Sigma或Gibco公司现成产品。
(2)髓瘤细胞的准备
融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功地得到杂交瘤是最为重要的。目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前肯定不能少于1周。冻存的细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态，长过了的骨髓瘤细胞至少几天才可能恢复。在实验室中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10％小牛血清的培养基中，方法是用6个装5ml培养基的培养瓶，接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞。1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植。典型的倍增时间为14-16小时。
骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下：
a、于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养(一般按一块96孔板的融合试验约需2-3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备)。
b、融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。
c、1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。
d、加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。
e、取骨髓瘤细胞悬液，加0.4％台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数＝4个大方格细胞数×105/4；或每毫升细胞数＝5个中方格细胞数×106/2。
(3)脾淋巴细胞的准备
取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围***。将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏(也可用注射器内芯挤压脾脏)，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块，可用200目铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min离心5-10分钟，用不完全培养基离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀，取上述悬液，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108个脾细胞，每只大鼠脾脏可得5×108-10×108脾细胞。
(4)饲养细胞的制备
在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞。饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了，一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用，因此使用最为普遍。其制备方法如下：按上述采小鼠脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。通常对巨噬细胞来说，96孔培养板每孔需2×104个细胞，24孔板每孔需105个细胞。每只小鼠可得3-5×106个细胞，因此一只小鼠可供两块96孔板的饲养细胞。也可在细胞融合前1-2天制备并培养饲养细胞，这样使培养板孔底先铺上一层饲养细胞层。
(5)细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
细胞融合的程序已报道的有很多种。例如，下述方法，
A、将1×108脾细胞与2×107-5×107骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。
B、1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。
C、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；置40℃水浴中预热。
D、用1ml吸管在1分钟左右(最佳时间为45秒)加预热至40℃的50％PEG(pH 8.0)1ml，边加边轻轻搅拌。
E、用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37℃的不完全培养基；20-37℃静置10分钟。
F、1000r/min 5分钟；弃去上清。
G、加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。
H、分装96孔细胞培养板，每孔0.10-0.15ml；分装24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后将培养板置37℃，6％CO2培养箱内培养。
I、5天后用HAT培养基换出1/2培养基。
J、7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；(第14天后可用普通完全培养基)。
L、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
3、杂交瘤细胞筛选
杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便，便于一次处理大量样品等特点。一般说来，在融合之前就必须建立好抗体检测方法，并克服可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”，即检出背景以上的最强与最弱信号之比，依所用的检测抗原是否纯净而定。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的，100％的抗原参与反应，一个阳性/阴性判别***就够了。另一方面，如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗原，检测***可能需要能测出微弱信号，则动力学范围至少应为10:1，最好为100:1。
另外，检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。如需结合A蛋白的杂交瘤抗体，就要用结合蛋白A的检测方法。作为筛选方法，包括免疫酶技术、可溶性抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)、用全细胞抗原的ELISA、抗体捕捉ELISA试验、ABC-ELISA试验、Dot-ELISA试验、免疫组化染色法等。
4、杂交瘤细胞的克隆化
从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或多个杂交瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。另一方面，杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已不再分泌抗体的细胞，得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系(又称亚克隆)，也需要克隆化。另外，长期液氮冻存的杂交瘤细胞，复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失，因此也应作克隆化，以检测抗体分泌情况。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化，有时还需进行多次。所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。克隆化的方法很多，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪(FACS)分离法。
5、杂交瘤细胞的冻存与复苏
(1)杂交瘤细胞的冻存
在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以免遭到不测。在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。
细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度(0℃-20℃，每分钟下降1℃；-20℃-40℃每分钟下降2℃)，可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。下面介绍我们实验室的细胞冻存方法，经几年来对多种细胞的使用，细胞复苏存活率均在80％以上。
(2)杂交瘤细胞的复苏
杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的-5℃-0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。通常情况下，冻存时细胞数量多，生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法，这也是各个实验室普遍采用的程序。即复苏时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。用5-10ml HT培养基稀释，1000r/min 10分钟，弃上清，再悬浮于适量HT培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5％CO2培养。如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加104-105/ml小鼠腹腔细胞进行培养。不过，冻存的细胞并不都能100％复苏成功，其原因较多，如冻存时细胞数量少或生长状态不良，或复苏时培养条件改变或方法不当，也可能细胞受细菌或支原体污染，以及液氮罐保管不善等。在出现上述情况时，可采用一些补救方法复苏这些细胞，如小鼠皮下形成实体瘤法，脾内接种法，小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法，以及96孔板培养法等。
6、单抗特性的鉴定
⑴单克隆性的确定
包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。
A、杂交瘤细胞的染色体分析
对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。另一方面，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。检查杂交瘤细胞染色体的方法最常用秋水仙素法，其原理是应用秋水仙素特异的破坏纺锤丝而获得中期***相细胞；再用0.075mol/L KCl溶液等低渗处理，使细胞膨胀，体积增大，染色体松散；经甲醇-冰醋酸溶液固定，即可观察检查。
B、抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定
抗体的类和亚类对决定提纯的方法有很大的帮助。除采用特殊的免疫方法和检测方法，最经常得到的单抗是IgM和IgG，分泌IgE的杂交瘤细胞很少见，而分泌IgA的杂交瘤通常只有在用于融合的淋巴细胞来自肠道相关淋巴组织才能得到。如在抗体检测中使用葡萄球菌A蛋白试剂，则不可能得到IgG以外的其他类的抗体。鉴定单抗Ig类和亚类的方法主要有两种，一种是免疫扩散，另一种是ELISA。
C、单抗纯度的鉴定
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳(IEF)及免疫转印分析(WB)等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB的原理和方法请参阅有关专著，这里不再赘述。
⑵单抗理化特性的鉴定
从实用意义上说，单抗对温度和pH变化的敏感性以及单抗的亲合力都是理化特性鉴定的主要项目，它们可为单抗的使用和保存提供重要依据。其中单抗亲合力测定比较复杂，下面作简要介绍。
抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇(部)和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数(K)表示。
单抗亲合力测定是十分重要的，它可为正确选择不同用途的单抗提供依据。在建立各种检测方法时，应选用高亲合力的单抗，以提高敏感性和特异性，并可节省试剂。而在亲和层析时，应选用亲合力适中的单抗作为免疫吸附剂，因为亲合力过低不易吸附，亲合力过高不易洗脱。
精确测定单抗的亲合力是较困难的，好在实际应用中选择单抗时，通常只需测定各单抗的相对亲合力及其高低排列次序。常用的方法有竞争ELISA、非竞争性ELISA、间接ELISA、间接法夹心ELISA等，这里仅介绍竞争性ELISA测定单抗亲和常数的方法。其步骤是：
取适宜浓度的纯化抗原包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜。洗涤后，加入封闭液(0.5％BSA-PBS，pH7.2)100μl/孔，37℃1小时。取一定浓度的单抗，与系列倍比稀释的抗原混合，4℃过夜，使反应达到平衡；必须注意所用抗原浓度至少要比抗体浓度高10倍以上。将平衡后的抗原抗体复合物加入酶标板孔中，100μl/孔，37℃1小时。洗涤后，加入适宜稀释度的HRP标记抗小鼠IgG抗体，100μl/孔，37℃1小时。洗涤后，加入底物(OPD)溶液，100μl/孔，37℃显色15分钟；2mol/L H2SO4终止反应后，于495nm波长测定各孔的吸收率(A)。
按下列公式计算各单抗的亲和常数(K)：A0/(A0-A)＝1+K/a0其中A0＝无抗原时A值；A＝采用不同浓度抗原时的A值；a0＝抗原总量；K＝亲和常数。
⑶单抗与相应抗原的反应性测定
单抗与相应抗原的反应性决定于它所识别的抗原表位，确定单抗针对的表位在抗原结构上的位置，是单抗特性鉴定的关键环节，同时，进一步分析这类表位的差别，可正确评价单抗的特异性和交叉反应性，如一些抗原为同属不同血清型共有，甚至是科内不同属所共有，而另一些抗原表位则是某种血清型乃至某一菌株或毒株所特有。此外，单抗的反应性往往呈现一种或几种免疫试验特异性，这在建株时予以测定，有利于正确使用这些单抗。
单抗反应性测定的方法很多，包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等，选择何种方法依据不同的单抗特性和试验目的而定，请参阅有关论著的详细论述。
本发明的单克隆抗体的生产
获得稳定的杂交瘤细胞系后，即可根据需要大量生产单抗，以用于不同目的。目前大量制备单抗的方法主要有两大***，一是动物体内生产法；另一是体外培养法。本发明中优选采用体外培养法。
总体上讲，杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖细胞(anchorage dependentcell，ADC)，因此既可以进行单层细胞培养，又可以进行悬浮培养。杂交瘤细胞的单层细胞培养法是各个实验室最常用的手段，即将杂交瘤细胞加入培养瓶中，以含10-15％小牛血清的培养基培养，细胞浓度以1×106-2×106/ml为佳，然后收集培养上清，其中单抗含量约10-50ug/ml。这种方法制备的单抗量极为有限，无疑是不适用于单抗的大规模生产。要想在体外大量制备单抗，就必须进行杂交瘤细胞的大量(高密度)培养。单位体积内细胞数量越多，细胞存活时间越长，单抗的浓度就越高，产量就越大。
杂交瘤细胞的大量培养包括悬浮培养***，采用转瓶或发酵罐式的生物反应器，其中包括使用微载体；或细胞固定化培养***，包括中空纤维细胞培养***和微囊化细胞培养***。
A.悬浮培养法：目前小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器，美国、加拿大、法国和德国等几家公司生产这类反应器，其培养方式可分为纯批式、流加式、半连续式和连续式。
B.微载体培养法：微载体(Microcarrier)是以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，在搅拌作用下微载体悬浮于培养液中，细胞则在固体颗粒表面生长成单层。可用作细胞大量培养的微载体主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品，其中以Cytodex I，Biosilon和Superbeads为好。微载体培养的基本方法上与悬浮培养相同。近来的研究表明，该法是杂交瘤细胞大量培养的理想途径之一。
C.中空纤维细胞培养***：该***由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵等组成。用于细胞培养的中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯-丙烯复合物、多聚碳酸硅等材料制成，外径一般为100-500um，壁厚25-75um，壁呈海绵状，上面有许多微孔。中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，其孔径只允许营养物质和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质(如单抗等)有滞留作用。目前使用的中空纤维生物反应器分为柱式、板框式和中心灌流式。尽管该培养***在大规模生产单抗时成本较低，并可获得高产量高纯度的抗体，由于设备价格昂贵，限制了其使用范围。
D.微囊化细胞培养***：该***是先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高浓度的单抗。
本发明的单克隆抗体与其抗原25-羟基维生素D3的亲和力为3.84×109。优选地，抗体亲和力为yyy。另外，本发明的单克隆抗体与25-羟基维生素D2的交叉反应低于10％，优选低于5％。
实施例
1.免疫原的制备：
把25-羟基VD3羧基延伸物偶联到BSA上，偶联(BSA:25-羟基VD3)质量比1:1，使25-羟基VD3过量。偶联方式如下图所示：
偶联完毕后，离心留沉淀。沉淀用PBS重悬后，跑SDS-PAGE胶(参见图1)，切胶液氮研磨进行免疫。
实验细节：
A.称取25-羟基VD3羧基延伸物2mg用500μl DMSO溶解，加入2mgEDC(用100μlpH5.6的0.01M EMS溶解)，以及2mg NHS(用100μl pH5.6的0.01M EMS溶解)，室温搅拌活化1h。
B.用0.1M氢氧化钠调节NHS活化的25-羟基VD3后，逐滴加入到500μl 0.01M PBS溶解的BSA中，室温搅拌3小时。
C.用0.01M PBS透析，换液三次。取出后离心得沉淀和上清。沉淀用200μl PBS重悬。沉淀和上清分别取出20ul进行SDS-PAGE跑胶鉴定，沉淀分子量明显比未偶联的BSA分子大。
E.配置一板不插梳子，只有分离胶和浓缩胶的SDS-PAGE,把150μl重悬的沉淀用2×loading buffer处理后上样跑入胶中。无毒染色脱色后，把目的条带切胶。
F.把目的条带切下的胶用液氮研磨后收集起来，分成五等分，-20冷冻保存。
2.免疫过程：
100ug/只小鼠，弗氏完全佐剂初次免疫，以后每次间隔14天用弗氏不完全佐剂50ug/只小鼠加强免疫，共加强三次后进行细胞融合。
详细过程：
A.初免：取两份研磨好的胶(大约400μg蛋白)，合并后用PBS补充到800μl，再加入800μl弗氏完全佐剂乳化后分6个点，60μl/点免疫四只6周龄的BalB/C小鼠。
B.加强：初次免疫后，每隔14天取出一份胶，用PBS补足至800μl，再加入800μl弗氏不完全佐剂乳化后分6个点免疫，每点60μl。
C.冲击：重悬的沉淀蛋白15μl/只，腹腔冲击免疫后第四天进行融合。
3.筛选过程：
筛选抗原的制备：如下所述，把25-羟基VD3氨基延伸物偶联到BSA上，偶联(BSA:25-羟基VD3)质量比4:1.偶联结束后离心去沉淀。收集上清做筛选抗原。
实验细节：
A.4mg BSA溶解到500μl pH5.6的0.01M EMS中，加入4mgEDC(用200μl pH5.6的0.01M EMS溶解)，以及2mg NHS(用200μl pH5.6的0.01M EMS溶解)，室温搅拌活化1h。
B.用0.1M氢氧化钠调节NHS活化的BSA后，加入50μl0.1MPBS。边搅拌边逐滴加入500μl DMSO溶解的25-羟基VD3氨基衍生物，室温搅拌3小时。
C.用0.01M PBS透析，换液三次。取出后离心得沉淀和上清。沉淀用200μl PBS重悬。沉淀和上清分别取出5μl进行SDS-PAGE跑胶(参见图2)鉴定，沉淀只有非常少的蛋白。上清蛋白比未偶联的BSA蛋白略微弥散，证明已经偶联上了。
D.上清用作筛选抗原。
E.筛选时，用BSA-25-羟基VD3抗原和未偶联的BSA抗原同时包被ELISA板子进行筛选，排除对BSA反应的阳性克隆后，得到6株与BSA-25-羟基VD3抗原反应，与BSA没有反应的单克隆细胞株。即为产生抗25-羟基VD3抗体的细胞株。
4.纯化抗体最终鉴定：
筛选出的6株阳性克隆打腹水，纯化出抗体进行ELISA最终鉴定，用25-羟基VD3(缩写25VD3)竞争反应，都有明显竞争抑制，其中3号细胞株抑制最明显。同时用VD3反应，无任何竞争抑制作用。表明6株细胞高度特异地针对25-羟基VD3，与VD3无交叉反应，且3号细胞株最佳。
表1， 6株阳性克隆产生的抗体的亲和性分析
注：对照为罗氏产品Vitamin D total。
抗体稀释度是指将1mg/ml的抗体按倍比稀释法进行稀释的倍数，其中进行第一次倍比稀释的抗体稀释度为200。
5.本发明的纯化抗体与维生素D2的交叉反应
实验步骤：
BSA-25羟基VD3筛选抗原4ug/ml,100ul/孔加入ELISA板，4℃度包被过夜。
TBST洗涤3次
2％BSA加入ELISA板，200ul/孔，37℃度封闭2h.
TBST洗涤3次
分别向ELISA板中加入配置好25羟基VD3标准品，25羟基VD2标准品，以及VD3的标准品。50ul/孔。
分别向ELISA板中加入配置好0.2ug/ml的Anti-25VD3-3抗体以及对照抗体，50ul/孔，混匀。
37℃度反应45min后，TBST洗涤5次
每孔加入100ul羊抗鼠IgG-HRP(1：20000).
37℃度反应45min后，TBST洗涤5次
每孔加入50ul底物A，50ul底物B，混匀
37℃度反应5min
每孔加入终止液50ul，OD450读取吸光度。
交叉率计算方式：抗体在25羟基VD3标准品1/2标准品为0时的吸光度，所对应的标准品浓度或最接近的浓度，与25羟基VD2达到同样吸光度值所对应的浓度比值即为交叉率。下表所示的Anti-25VD3-3达到1/2×3.056的最接近的吸光度为1.079，所对应标准品浓度为50ng/ml，达到同样吸光度需要的25羟基VD2浓度大于1000ng/ml，因此，50ng/ml与大于1000ng比值为小于5％。
表2交叉反应结果
注：对照为罗氏产品Vitamin D total。
表2显示：本发明所得到的第3株抗体，在对25羟基VD3反应上特异性高，与25羟基VD2交叉在5％以内，并且与VD3无任何交叉反应。同等条件下，对照抗体与25羟基VD2交叉率大于70％以上，并且与VD3也有一定交叉。
6.胶体金试纸条制备：
用BSA-25-羟基VD3筛选抗原5mg/ml划在NC膜上，10ug/ml抗体标记纳米金颗粒后铺在金垫上，用配置好的25-羟基VD3标准品反应，随着标准品浓度的增大，T线也越浅，甚至消失(消线)。其中3号抗体表现最佳。
结论：制备出高亲和力，高特异的25-羟基VD3抗体可用于ELISA试剂盒以及胶体金试剂盒的生产。
参考本申请的优选技术方案详细描述了本申请的生物材料去细胞洗脱装置，然而，需要说明的是，在不脱离本申请的精神的情况下，本领域技术人员可在上述公开内容的基础上做出任何改造、修饰以及变动。本申请包括上述具体实施方案及其任何等同形式。

Claims (10)

1.一种细胞株的制备方法，其中所述细胞株产生抗25-羟基维生素D3单克隆抗体，所述方法包括：
a)用免疫抗原免疫动物的步骤，其中所述免疫抗原为通过使作为载体的大分子蛋白质与作为半抗原的25-羟基维生素D3经由交联基团偶联制得的非水溶性抗原，且所述大分子蛋白质与所述25-羟基维生素D3的偶联摩尔比为1:80至1:100；
b)细胞融合步骤，使所述动物的脾细胞与同系骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞；
c)利用筛选抗原筛选阳性细胞株的步骤，其中所述筛选抗原不包含所述交联基团。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述大分子蛋白质为血清白蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述交联基团为多元羧酸酯键。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述筛选抗原不包含多元羧酸酯键。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述筛选抗原为大分子蛋白质与25-羟基维生素D3氨基衍生物的偶联分子。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中步骤a)中使用所述免疫抗原与用于将其分离的凝胶的混合物直接免疫动物。
7.一种细胞株，其通过根据权利要求1-6任一项所述的制备方法获得。
8.一种生产抗25-羟基维生素D3单克隆抗体的方法，其包括根据权利要求1-6任一项所述的制备方法作为其中的步骤，或者包括培养根据权利要求7所述的细胞株的步骤。
9.一种单克隆抗体，其与25-羟基维生素D3的亲和力大于3.84×109，且其与25-羟基维生素D2的交叉反应低于10％。
10.一种胶体金试纸条，其包含根据权利要求9所述的单克隆抗体。
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