CN102124100A

CN102124100A - 特异结合vegf的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途

Info

Publication number: CN102124100A
Application number: CN2008801010291A
Authority: CN
Inventors: 周群敏; 胡红群; 孙亚男; 罗师平; 周青; 徐一清
Original assignee: SUZHOU STAINWEI BIOTECH Inc
Current assignee: Guangzhou Angke immune Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2008-12-01
Filing date: 2008-12-01
Publication date: 2011-07-13
Anticipated expiration: 2028-12-01
Also published as: CN102124100B; WO2010063138A8; WO2010063138A1

Abstract

一种可特异结合人血管内皮细胞生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2743。该单克隆抗体的制备方法和体外化学标记处理的该单克隆抗体。以及该单克隆抗体(标记及未标记的)在检测及分离VEGF蛋白中的应用。

Description

特异结合 VEGF的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途

技术领域：

本发明属于生物技术 -单克隆抗体领域。本发明涉及一种可特异结合人 VEGF 的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途。

背景技术：

血管新生或增生（angiogenesis) 在生物学上是指体内的己存在的血管（如毛细血管和小静脉)通过出芽或***的方式而产生新的血管的过程。血管新生在维持机体的许多正常的生理过程如组织胚胎发育、外伤伤口的癒合与修复等是有益的和必需的。但过度的血管新生或增生也与许多病理变化（如肿瘤的增生扩散，炎症）息息相关。

体内血管能够新生或增生的关键是在于其内衬的血管内皮细胞具有***增生及定向迁移置入已有的血管管壁的能力。在各类刺激血管内皮细胞增生的因子中，以血管内皮细胞生长因子 ( vascular endothel ial growth factor, VEGF) 尤为重要。事实上， VEGF 是目前已知的最强烈的刺激血管内皮细胞***增生的因子。 VEGF在刺激血管增生中的重要性也己在 VEGF基因剔除小鼠的研究中被证实：如只要当 VEGF基因中的一份被敲除后，胚胎中的血管即无法正常形成进而导致胚胎在发育至 11 至 12天时即死亡（Carmel iet P 等 Nature 1996, 380 : 435 ; Ferrara N 等 Nature 1996, 380 : 439)。

VEGF—般常由血管内皮细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞所合成，并通过自分泌 / 旁分泌方式特异地作用于血管内皮细胞上的 VEGF受体，而发挥促进血管内皮细胞生长、增殖、迁移、形成等作用。近期研究表明，在多数恶性肿瘤患者的癌组织中也能够检测到 VEGF, 且 VEGF的表达水平增高与肿瘤恶性程度和疾病进展有关（Dvorak HF 等： J Exp Med 1991 : 174 : 1275-8 ; Brown LF 等 Cancer Res 1993 ; 53 : 4727-35； Weidner N， Semple JP, Welch WR及 Folkman J : N Engl J Med 1991； 324 : 1-8. 4-5)；此外， VEGF在炎症病理的血管中起着重要的作用，如在关节炎病人的关节滑液及组织中（rheumatoid synovial fluids and tissue) 以及牛皮藓 (psoriasis)病人组织中 VEGF水平增高。阻断体内 VEGF, 从而阻止由 VEGF及其受体介导的促血管增生，可达到抑制肿瘤生长与转移，或抗炎症的效果。

在抑制 VEGF及其受体介导的血管增生药物研发领域，主要存在两大手段：即：

1)寻找可直接抑制 VEGF受体中内在的酪氨酸蛋白激酶活性的物质，该类研发的药物主要是各种小分子物抑制剂如 PTK787/ZK 222584 (Wood JM等 Cancer Res 2000， 60: 2178)；

2) 通过抑制 VEGF与其受体的结合，从而达到阻止 VEGF及其受体介导的促血管增生的作用，该类研发的药物包括各种抗 VEGF或抗 VEGF受体的抗体，反义寡核苷酸及小分子抑制剂等（Kim KJ等 Nature 1993， 362: 841; Presta LG 等 Cancer Res, 1997， 57:4593； Posey J A等 Clinical Cancer Research, 2003, 9:1323)。其中由美国 Genentech公司研发、生产并于 2004获美国 FDA批准上市销售的 Bevacizumab (商品名 Avastin)就是一种可识别与结合 VEGF的人源化的单克隆抗体。 Avastin通过中和或清除体内 VEGF而达到抑制肿瘤血管生长，进而遏制肿瘤的生长和转移的作用（Presta LG等 Cancer Res, 1997, 57: 4593; Hurwitz H 等 N Engl J Med, 2004:350:2335)。

人源化抗体 Avastin 的前身可追溯到代号为 A4.6.1的小鼠单克隆抗体。该 A4.6.1 小鼠单克隆抗体的来源及分泌它的杂交瘤细胞系与用途在专利号为 6，582，959的美国专利（发明人：!(^，1^111^₁1 ，专利公开日期： June 24, 2003，专利名称： Antibodies to vascular endothelial cell growth factor); 及专利号为7,227，004的美国专利（发明人： 1^111， 1^1^_§】专利公开日期： June 5， 2007, 专利名称： Antibodies to vascular endothelial cell growth factor) 中都有所描述。但该抗体还存在如下不足：（1) 与大多数的单克隆抗体一样， A4.6.1小鼠单克隆抗体及其人源化抗体 Avastin也只是能结合 VEGF抗原的部分位点，无法认识或涵盖 VEGF上众多的其他抗原位点。（2) 进一步的动物实验及临床研究发现仅单独注射 A4.6.1小鼠单克隆抗体或其人源化抗体 Avastin, 无法达到完全中和抑制体内 VEGF及其介导的促血管新生。

因此，研发更多新的抗人 VEGF的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系就显得很有意义与必要。

发明内容：

本发明的一个目的是提供能与天然的 VEGF或变性的 VEGF特异结合的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供分泌产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明的再一个目的是提供本发明的单克隆抗体的制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种体外化学标记过的单克隆抗体。

. 本发明的另一个目的是提供本发明的单克隆抗体在检测 VEGF 蛋白中的应用。

本发明的另一个目的是提供体外化学标记过的单克隆抗体在检测 VEGF蛋白中的应用。

本发明的另一个目的是提供本发明的单克隆抗体在分离 VEGF 蛋白中的应用。 .

本发明选取重组人 VEGF蛋白为免疫原，通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗 VEGF多克隆抗体；再从中挑取小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合、再经药物筛选及亚克隆等步骤而建立了多株稳定分泌抗人 VEGF抗体的杂交瘤单克隆细胞。其中一代号为 M23杂交瘤细胞株，经 ELISA、免疫印迹、免疫组化等多种方法鉴定，证实其所分泌的单克隆抗体能够特异识别并结合人 VEGF (包括 VEGF121、 VEGF165 及 VEGF189 等）。体外研究还证明该单克隆抗体可竞争抑制 VEGF受体与其配体（即 VEGF ) 的结合。在本发明的一方面，提供一种可分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系代号为 M23，已于 2008年 11月 14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称为 CGMCC ) , 保藏编号为 CGMCC No. 2743 , 保藏地点：中国，北京。

在本发明的另一方面，提供一种可特异结合 VEGF蛋白的单克隆抗体，由上述保藏编号为 CGMCC No. 2743的杂交瘤细胞系分泌产生。

在本发明的另一方面，提供一种上述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤: 步骤 1、制备重组人 VEGF蛋白为免疫原；步骤 2、动物免疫：通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗人 VEGF多克隆抗体；步骤 3、从中挑取小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合：步骤 4、酶联免疫吸附试验筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞；步骤 5、阳性杂交瘤细胞经亚克隆鉴定得到多株稳定分泌抗人 VEGF抗体的杂交瘤单克隆细胞；步骤 6、将杂交瘤细胞扩增培养，收集培养液，采用亲合层析法分离纯.化抗人 VEGF单克隆抗体。

其中，步骤 1具体为： PCR扩增得到编码人 VEGF的基因片断，将其克隆到酵母表达载体 pPi9K载体中，获得表达质粒 pPi9K-VEGF，转化酵母菌，筛选出高效表达工程菌株，工程菌株经发酵、诱导表达、分离纯化后，获得纯度 95 % 以上的 VEGF蛋白。

其中，步骤 2所述小鼠皮下免疫的方法为：将所述纯化的重组人 VEGF蛋白与弗氏完全佐剂混合，于皮下多点注射小鼠。

其中，步骤 6所述的亲合层析法具体为：将含单克隆抗体的杂交瘤细胞滤液上清上样于预先填充有共价交联了重组人 VEGF蛋白的微粒珠亲合层析柱中；上样完毕，亲合层析柱以 PBS洗脱去除杂蛋白，再以甘氨酸液洗脱被微粒珠吸附的抗体蛋白，再透析；透析后的样品再经过滤后即获得纯化的抗 VEGF单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供一种体外化学标记过的上述单克隆抗体，其标记步骤如下：

1 )、溶解上述单克隆抗体于 PBS中；

2 )、加入适量的标记试剂与单克隆抗体样品混合，并混匀，在室温下反应；

3 )、通过透析或脱盐等方法去除未反应的过量标记试剂，即得到体外化学标记过的单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供一种上述单克隆抗体在检测 VEGF蛋白中的应用。本发明进一步确认了上述单克隆抗体用于检测体液或病变组织中的 VEGF蛋白的表达。例如用该单克隆抗体作为试剂用以体外定量检测各种体液如血液、血浆、血清、尿、淋巴液或脑脊液中的 VEGF的水平，或检测各种生物材料如细胞培养上清液、组织细胞裂解物中的 VEGF的水平；或该单克隆抗体作为试剂用于免疫组化等方法来定性或定量检测各种病变器官组织的 VEGF蛋白的表达，或各种疾病下如肿瘤（肿瘤增生早期及扩散期等）、炎症（如关节炎、 ***性红瘢狼苍等）患者外周血液中 VEGF的水平表达，以作为临床诊断或辅助诊断的一个标志。

在本发明的另一方面，提供一种上述体外化学标记过的单克隆抗体在检测 VEGF蛋白中的应用。标记的（如生物素、放射素或荧光素如 FITC等标记）抗 VEGF 的单克隆抗体为探针显影剂，用于免疫荧光实验、放射自显影或其他显影方法来定位或定量检测各种疾病如肿瘤或炎症患者的组织器官中的 VEGF表达水平，以辅助临床诊断。

在本发明的另一方面，提供一种上述单克隆抗体在分离 VEGF蛋白中的应用。利用该单克隆抗体制备免疫亲和层析柱，来分离纯化 VEGF蛋白。

本发明的单克隆抗体还可作为 VEGF的拮抗剂，用于药理学等基础医学研究。此外，分泌该抗体的 M23杂交瘤细胞系，可用来分离纯化 mRNA，再以 RT- PCR等方法从中克隆和扩增出编码 M23抗体的轻链和重链可变区的基因。扩增获得的抗体轻链和重链可变区基因可用于制备单链抗体、 Fab 片断、人-鼠嵌^ ·抗体或者人源化抗体等各种基因工程抗体。 M23 抗体或其衍生体（如抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、放射药物标记抗体等）作为单独成分，或与其他药物合并使用，可用于制备与 VEGF高表达有关的病变（如肿瘤的增生扩散、炎症等）的治疗药物或制剂。附图说明：

图 1 为实施例 1 中以 ELISA 法鉴定证明 M23杂交瘤细胞的培养上清液中 (m23 ) 含有与重组 VEGF165蛋白高亲合结合的单克隆抗体的实验结果示意图，其中， X653代表未融合的 P3X63. Ag8. 653骨髓瘤细胞培养上清液，为阴性对照。

图 2为实施例 2中 SDS-PAGE 分析经 VEGF亲合层析柱纯化的 M23抗体蛋白在 DTT还原条件下的电泳实验结果示意图。其中泳道 1、 2、 3、 4分别表示同一批次产品的四个平行上样（每泳道上样的蛋白量相同，为 5 y g)。 M23抗体蛋白来源于 Μ23杂交瘤细胞的培养上清液中。

图 3为实施例 3中以免疫印迹 (Western- blot)分析检测 M23杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与重组 VEGF165蛋白（还原的及未还原的）结合反应的实验结果示意图。其中泳道 1 (未还原的 VEGF165蛋白）及泳道 2 (还原的 VEGF165蛋白）为以 M23单克隆抗体检测的结果；泳道 3 (未还原的 VEGF165蛋白）及泳道 4 (还原的 VEGF165蛋白）为以兔多克隆抗体检测的结果。

图 4为实施例 4中以 ELISA 法鉴定 M23单克隆抗体反应特异性的实验结果示意图，结果证明 M23单克隆抗体能与 VEGF165蛋白结合，但不与胎盘生长因子（PLGF)蛋白结合。

图 5为实施例 5中以纯化的 M23单克隆抗体为试剂成分，用于免疫组化检测转染 CH0 (中国仓鼠卵巢细胞）细胞中 VEGF蛋白 ( VEGF12K VEGF165及 VEGF189 ) 的表达示意图；其中图 5A 为转染有含 VEGF121基因质粒的细胞，图 5B 为转染有含 VEGF165基因质粒的细胞；图 5C 为转染有含 VEGF189基因质粒的细胞；图 5D为转染有空白对照质粒的细胞。

图 6为实施例 6中用生物素标记的 M23单克隆抗体（Biotin- m23，起始稀释溶度为 1 : 8000) ELISA法来检测包被在 96-孔酶标板上的 VEGF的抗体稀释度- 反应曲线。

图 7为实施例 7中竞争性 ELISA法检测生物素标记的 M23单克隆抗体与 VEGF 受体蛋白（F2K3FC ) 竞争结合 VEGF的实验结果示意图。 PLGF蛋白为阴性对照。

图 8为实施例 8中以 M23单克隆抗体为试剂，用于免疫组化检测分析人类病理组织切片中的 VEGF蛋白的实验结果示意图。其中图 8A为人胃腺癌组织切片；图 8B为人***组织切片。实现本发明的最佳方式：

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例 1 : 稳定分泌抗 VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞系的建立与筛选鉴定步骤 1.重组人 VEGF165 蛋白（免疫抗原）的制备（采用申请号为 2007100473522, 发明名称为 "重组人血管内皮细胞生长因子的分离纯化、体外化学标记及其应用" 的中国发明专利申请所记载的方法制备）：

利用 PCR技术从人肺组织细胞 cDNA文库中扩增得到编码人 VEGF165完整开放读码框架序列（open-reading frame, 0RF) 的基因片断，经序列测定鉴定正确，用限制性内切酶处理后，将其克隆到酵母表达载体 pPi9K (Invitrogen公司）载体中。获得表达质粒 _PPi9K- VEGF165, 转化毕赤酵母菌，筛选出高效表达工程菌株。工程菌经发酵、诱导表达，分离纯化后，获得纯度 90%以上的 VEGF165 蛋白。

步骤 2、动物免疫：

将上述纯化的重组人 VEGF165 蛋白与弗氏完全佐剂混合，于皮下多点注射 C57BL/6小鼠 (動1/只，共 10ug VEGF165蛋白）。首次免疫 2- 3周后，小鼠再给予皮下多点注射 VEGF165蛋白与不完全佐剂混合液加强免疫。加强免疫 2- 3 次后，取少量小鼠血清，用包被 VEGF165蛋白的 96-孔酶标板以 ELISA法检测小鼠血清中抗 VEGF蛋白抗体的效价，效价高者小鼠脾细胞用于下一步的细胞融合。

步骤 3、细胞融合- 在 VEGF165 蛋白末次免疫后 3 天，无菌制备小鼠脾细胞悬液，与 P3X63. Ag8. 653 小鼠骨髓瘤细胞（购自中国科学院上海生命科学院细胞保藏中心）以 10: 1的比例在 50% PEG-1500 (美国 Sigma 公司产品）作用下融合。融合按常规法 ( ohler G. and Mi l stein C : Nature 1975 ; 256 :495-497 ) ， PEG用量 lml ， 1分钟内缓慢加完。反应 90秒后，以无血清的 RPMI-1640培养基终止反应， lOOOrpm离心 10 min,去除上清液，再将离心沉淀下的细胞以含 10% HAT (H 为次黄嘌呤、 Α氨基碟呤、 T胸腺嘧啶核苷，为 Sigma公司产品）的 RPMI 1640-10% FCS 培养基将细胞浓度调节至 l X 107ml，加入 96 孔平底细胞培养板（每孔 200ul )，于 37 °C， 5% C02培养箱中培养 2-3 周。

步骤 4、酶联免疫吸附试验（ELISA) 筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞：以重组人 VEGF165蛋白（ 5 μ g/ml， pH 9. 6， 0. 1 M NaHC03 液）包被酶标板， 37°C包被 2小时或 4 °C过夜； 2% 牛血清白蛋白（BSA) 封闭， 4°C过夜。经 PBS-0. 1% Tween20 液洗涤后加入待检杂交瘤细胞培养上清（以未融合的 P3X63. Ag8. 653骨髓瘤细培养上清为阴性对照） 37 °C孵育 2小时；经 PBS-0. 1% Tween20 液洗涤后，加入辣根过氧化物酶（HRP) 标记的羊抗小鼠 Ig (Sigma 公司产品）， 37 °C孵育 1小时；再经 PBS-0. 1% Tween20 液充分洗涤后，加入邻苯二胺（0PD) -0. 1% 0₂底物液显色 10-15min,以 0. 1M HC1 终止反应。在 MK3 Multiskan酶标仪（Thermo Scientific公司产品）中读取 492nm 处 0D值。测得的 0D 492值比阴性对照高 5-10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存。步骤 5、阳性杂交瘤细胞的克隆化 -有限稀释法

将上述初筛得到的阳性细胞以 RPMI- 1640-10% FCS培养基稀释至每孔 1-10 个细胞，铺于 96-孔细胞培养板，于 37 V , 5% C02培养箱中培养 2-3周。待克隆长成，取上清液以 ELISA再次检测鉴定抗 VEGF抗体的分泌。经检测鉴定，获得多个抗体分泌阳性细胞株。其中，经再次亚克隆鉴定，获得了一株代号为 M23 的稳定分泌抗 VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。图 1为以 ELISA 法鉴定检测 M23杂交瘤细胞上清液与重组 VEGF165蛋白结合，结果证明该杂交瘤细胞上清液含高效价抗 VEGF165蛋白的单克隆抗体。该单克隆抗体经鉴定为 IgGl类。该杂交瘤细胞株再经大量扩增、长期传代培养并冻存，于 2008年 11月 14日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCC NO. 2743。

实施例 2. 抗 VEGF单克隆抗体的体外制备及纯化

将建立的 M23杂交瘤细胞于无血清培养基中扩增培养，待细胞浓度达 10⁵/ml 以上时停止加液，再持续培养直至细胞培养液变黄。收集培养液， 1500rpm离心 10分钟，上清液再经 0. 45 μ ηι滤膜过滤后于 4 °C或 -20 Ό保存备用或直接用于下一步的单克隆抗体的分离纯化。

在本实施例中，抗 VEGF单克隆抗体（M23 ) 的分离纯化采用亲合层析法。其纯化步骤为：将含 M23单克隆抗体的杂交瘤细胞滤液上清上样于预先填充有共价交联了重组人 VEGF165蛋白（由实施例 1制备）的 4%琼脂糖微粒珠 (agarose beads, 美国 Sigma 公司产品）的亲合层析柱中（lL/lOml层析柱）；上样完毕，亲合层析柱以 PBS洗脱去除杂蛋白，再以低 pH (2. 7) 甘氨酸 (0. 1M) 液洗脱被吸附的抗体蛋白。洗脱液以 1 mol/L Tris (pH 9. 0)调节 pH至 7. 0，再对 10倍的体积的 lx PBS透析 12〜16小时后（期间换液 2-3次），透析后的样品再经 0. 45 μ m滤膜过滤后即获得纯化的抗 VEGF单克隆抗体。

将纯化的抗体按常规方法进行 SDS-PAGE电泳（分离胶为 10%，浓缩胶 5%) 鉴定。图 2为在 DTT还原条件下的 SDS- PAGE电泳结果，其中处于上面的条带代表 M23抗体重链，处于下面的条带代表 M23抗体轻链。实施例 3. 免疫印迹（Western blot) 鉴定分析 M23 单克隆抗体与重组人 VEGF165蛋白的结合

图 3 为免疫印迹（Western blot)实验检测纯化的 M23 单克隆抗体与人 VEGF165蛋白的特异结合反应的实验结果。本实施例中用于鉴定分析 M23单克隆抗体特异性的 VEGF蛋白来源于大肠杆菌表达的重组人 VEGF165蛋白（购自于美国 R and D Systems公司）。该 VEGF165蛋白先溶于 PBS-1% BSA液中（50 μ g/ml )，每道上样 10 μ 1进行 15% SDS-PAGA电泳，按常规方法将凝胶蛋白带转移到 PVDF 膜上（Mil lipore公司产品），用 5%脱脂奶粉在 4 °C封闭过夜，加入由实施例 2 制备的 M23 单抗，阳性对照加入兔抗人 VEGF 多克隆抗体（美国 Santa Cruz Biotechnology 公司产品），室温反应 2 小时，用 TBS-T (pH 7. 5， 0. 05mol/l Tris-Hcl, 0. 15mol/l NaCl, 0. 05% Tween-20) 洗涤 3次，随后加入辣根过氧化物酶（HRP) 标记的羊抗小鼠 IgG或羊抗兔 IgG (Sigma公司产品），室温反应 lh，用 TBS- T洗涤三次。最后加 DAB- 0. 1% 0₂底物液显色 10-15min。结果如图 3所示， M23单抗与还原的（泳道 1 ) 及未还原的重组 VEGF165蛋白（泳道 2) 都有很强的特异性反应；而与泳道中的 BSA等其他蛋白无交叉反应。此免疫印迹结果与使用兔抗人 VEGF多克隆抗体为阳性对照的检测结果（泳道 3及泳道 4)一致。

因此，与 ELISA结果相符合，免疫印迹 (Western blot) 实验结果再次证明 M23细胞株产生的单克隆抗体能与人 VEGF165蛋白结合。

实施例 4、 M23单克隆抗体的反应特异性测定

鉴于人胎盘生长因子（placental growth factor, PLGF)蛋白与人 VEGF165 蛋白同族，且两者具有 50%以上相同的序列；在本实施例中，用分别包被了重组人 VEGF165 蛋白（实施例 1制备）或重组 PLGF蛋白（购自美国 R and D Systems 公司）的 96-孔板，采用 ELISA方法来鉴定 M23单克隆抗体的反应特异性。 ELISA 试验步骤同实施例 2。 ELISA检测结果如图 4: 在包被 VEGF165 蛋白（5 μ g/ml， 50 μ 1/孔）的样品孔中，加入 Μ23单克隆抗体及 HRP标记的羊抗小鼠 Ig与底物后，显色反应呈明显阳性，且显色强度（0D 492值）与加入孔中的 M23单克隆抗体的溶度呈明显正相关；而在包被相同量（5 μ g/ml， 50 μ ΐ/孔）的 PLGF蛋白样品组，无明显显色。此结果证明 M23单克隆抗体能与 VEGF蛋白结合，但不能与 PLGF蛋白结合。

实施例 5. 免疫组化检测 M23单克隆抗体与 VEGF121、 VEGF165 及 VEGF189 蛋白的结合

在本实施例中， M23单克隆抗体作为第一抗体试剂用于免疫组化来检测表达在转染细胞中的各种 VEGF蛋白（如 VEGF121、 165 及 189等）。为此，取对数生长期的 CH0细胞，胰酶 /5mM EDTA常规消化后，以 1 X 10⁵细胞 /孔接种 24 -孔培养板， 37°C， 5% C02培养过夜；第 2天，在 IOO L无血清、无抗生素的 DMEM 加入 2 L fugen6 (购自 Roche-上海公司）与含重组人 VEGP基因（VEGF121、 VEGF 165 及 VEGF189) 的质粒 DNA或对照空载体质粒 DNA (1-2 u g) 混匀，制备成 fugen6- DNA混合液，室温放置 15 min后，滴加至 CH0细胞中；在转染 48h 后， CH0细胞经 lx PBS液漂洗及 90% methanol 4 V 20 min 固定后，加入 M23 单克隆抗体（1： 100稀释， 200 ul/孔）， 37 1 h，以 PBS液洗脱，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 Ig (1： 200 稀释， 200 ul/孔）， 37 °C 1 h，再以 PBS液洗脱，然后加入显色液（DAB- 3% H₂0₂)室温 5_10 min。 PBS液漂洗终止反应，置于显微镜下观察显色反应。结果如图 5所示：在分别转染有 VEGF121 (图 5A)、 VEGF165 (图 5B)及 VEGF 189 (图 5C)表达质粒的样品孔，有近 5_10%的细胞显色阳性，而转染有空载体对照（图 5D) 的样品无显色阳性细胞。此实验结果证明 M23 单克隆抗体不但能识别用于免疫的 VEGF165 蛋白，而且也能识别 VEGF121及 VEGF189蛋白。

实施例 6 M23单克隆抗体的体外生物素标记处理

在本实施例中，用 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS) 酯酰活化的生物素（Biotin ) (购自美国 Pierce公司）作为化学标记试剂来标记 M23单克隆抗体蛋白。在 pH 7-9的缓冲液中， NHS活化的生物素能够非常有效的与蛋白质的伯氨基（-NH2 ) 反应，形成稳定的酰胺键。在本实施例中，采用的生物素标记试剂与 M23单克隆抗体蛋白的反应摩尔比为 50: 1；其标记步骤如下：

1 )、溶解 M23单克隆抗体于 PBS中； 2)、按上述计算结果，加入适量的标记试剂（NHS-生物素）与 M23单克隆抗体样品混合，并混匀；室温反应 30-60分钟；

3 )、通过透析或脱盐去除未反应的过量生物素，即得到生物素标记的 M23 单克隆抗体（Biotin- M23 )。

生物素标记的 M23单克隆抗体（Biotin-M23)如与辣根过氧化物酶或荧光等标记的 Avidin合并使用，可组成试剂盒，用于定性或定量检测 VEGF蛋白。图 6 为用包被人 VEGF165蛋白（5 w g/ml， 50ul/孔）的酶标版，以生物素标记的 M23 单克隆抗体（Biotin-M23，起始稀释度为 1： 8000， ) 为第一抗体，以辣根过氧化物酶标记的 Avidin (购自美国 Vector Laboratories公司，稀释度为 1： 5000) 为检测试剂，测得的稀释度 -反应曲线。结果表明生物素标记的 M23抗体在很高的稀释度（1： 8000至 1： 80000之间）下还保持与 VEGF蛋白的高亲合力结合。

实施例 7 竞争性 ELISA实验检测 M23单克隆抗体与 VEGF受体竞争结合 VEGF M23单克隆抗体与 VEGF受体蛋白竞争结合 VEGF的实验采用竞争性 ELISA 法来测试。

该竞争性 ELISA法检测步骤如下：

1 ) 用重组人 VEGF165蛋白包被 96-wel l 板（2 μ g/ml， 50 μ 1/孔）， 4 °〇过夜；

2 ) 经 PBS液漂洗及 2% BSA (in PBS-0. 1% tween20液）室温封闭后，分别加入固定溶度（1 : 8000)的生物素标记的 M23单克隆抗体（Bio_M23)与不同溶度的 VEGF受体蛋白（该受体蛋白代号为 F2K3Fc，是由 VEGF受体胞膜外区与人免疫球蛋白 Fc段相连的融合蛋白，采用申请号为 20081001915922，发明名称为 "可结合血管内皮细胞生长因子及胎盘生长因子的重组蛋白及其制备方法与应用 "的中国发明专利申请记载的方法制备）；或固定溶度（1 : 8000)的生物素标记的 M23 单克隆抗体（Bio-M23 ) 与不同溶度的对照蛋白（为 PLGF), 37 °C孵育 2 h_;

3) 经 PBS- T洗脱后，加入辣根过氧化物酶标记的（1 : 5000)， 37 °C孵育 1 h_;

4) 经 PBS-T洗脱后，加入显色液（邻苯二胺） -3% 双氧水，室温 10min，至显色；

5)加入 HCL终止反应，以酶联免疫仪测定测定 492nm波长处各孔的吸光值。竞争性 ELISA结果如图 7所示:在加入生物素标记的 M23单克隆抗体与不同溶度的未标记的 VEGF 受体蛋白（即 F2K3Fc & Bio- M23) 样品组中，其 0D值与加入的未标记 VEGF 受体蛋白的量成反比关系：即加入的未标记 VEGF受体蛋白的量越高，其 0D值越低。而在加入生物素标记的 M23单克隆抗体与不同溶度的未标记的 PLGF蛋白（即 PLGF & Bio_M23)样品组中，其 0D值与加入的未标记的 PLGF蛋白量关系不大。此结果表明 M23单克隆抗体与 VEGF受体蛋白竞争结合 VEGF。

实施例 8 23单克隆抗体用于免疫组化检测病理组织切片中的 VEGF 本发明的 M23 单克隆抗体还用于免疫组化检测各种病理组织切片样品中的 VEGF蛋白。

免疫组化检测病理组织切片中的 VEGF蛋白的步骤如下：

1) 病理组织切片（购自陕西西安超英生物技术有限公司）在 60Ό中烤片 30 分钟，常规脱蜡水化

2) 抗原修复：高压修复抗原 2分钟，冷却至室温， PBS洗 5分钟 X 2次；

3) 滴加过氧化物酶阻滞剂（Peroxidase Blocking Solution)室温 30分钟；

4)滴加 1抗：检测抗体 M23单克隆抗体和阴性对照抗体（均为 1 : 10稀释） 4 °C冰箱过夜；

5) 0. l%Tween— PBS洗 5分钟 X 3次;

6) 滴加辣根过氧化物酶（HRP) 标记的羊抗小鼠 Ig 多克隆抗体，室温 30 分钟；

7) 0. l%Tween一 PBS洗 5分钟 X 3次；

8) DAB显色，蒸馏水洗终止显色；

9) 苏木素复染、水洗、分化后充分水洗返蓝；

10)常规脱水透明，中性树胶封片，于显微镜下观察与摄相纪录结果。图 8为部分病理组织切片检测结果照片。其中图 8A为人胃腺癌组织切片；为人***组织切片；结果表明两组织切片中都检测到 VEGF蛋白的表达。

申请人或代理人档案号 DAPCT-1311

国际申请号 PCT/CN 2008/ 00 1 954 关于微生物保藏的说明

(细则 13之二）

A.对说明书第 3 页，第行所述的已保藏的微生物或其他生物材料的说明

B.保藏事项更多的保藏在附加页说明口保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址

(包括邮政编码和国名）

中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编： 100101 保藏日期 2008年 11月 14日保藏号 CGMCC No.2743

C.补充说明（必要时）更多信息在附加页中口

D.本说明是为下列指定国作的（如果说明不是为所有指定国而作的)

E.补充说明（必要时）

下列说明将随后向国际局提供（写出说明的类别，例如： "保藏的编号")

由受理局填写

S 本页已经和国际申请一起收到

2004年 1月再版）

Claims

权利要求书

1.一种可分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏编号为 CGrtCC No. 2743 ο
2.一种可特异结合 VEGF的单克隆抗体，由权利要求 1所述的杂交瘤细胞系分泌产生。
3.—种如权利要求 2所述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：步骤 1、制备重组人 VEGF蛋白为免疫原；步骤 2、动物免疫：通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗人 VEGF多克隆抗体；步骤 3、从中挑取小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合；步骤 4、酶联免疫吸附试验筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞；步骤 5、阳性杂交瘤细胞经亚克隆鉴定得到多株稳定分泌抗人 VEGF抗体的杂交瘤单克隆细胞；步骤 6、将杂交瘤细胞扩增培养，收集培养液，采用亲合层析法分离纯化抗人 VEGF单克隆抗体。
4.如权利要求 3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤 1具体为： PCR扩增得到编码人 VEGF的基因片断，将其克隆到酵母表达载体中，获得表达质粒，转化酵母菌，筛选出高效表达工程菌株，工程菌株经发酵、诱导表达、分离纯化后，获得纯度达 90%以上的 VEGF蛋白。
5.如权利要求 3所述的制备方法，其特征在于，步骤 2所述小鼠皮下免疫的方法为：将所述纯化的重组 VEGF蛋白与弗氏完全佐剂混合，于皮下多点注射小鼠。
6.如权利要求 3所述的制备方法，其特征在于，步骤 6所述的亲合层析法具体为：将含单克隆抗体的杂交瘤细胞滤液上清上样于填充有共价交联了重组 VEGF蛋白的微粒珠亲合层析柱中；上样完毕，亲合层析柱以 PBS洗脱去除杂蛋白，再以甘氨酸液洗脱被微粒珠吸附的抗体蛋白，再透析，透析后的样品再经过滤后即获得纯化的抗 VEGF单克隆抗体。
7. 一种体外化学标记过的权利要求 2所述的单克隆抗体，其标记步骤如下： 1 )、溶解权利要求 2所述的单克隆抗体于 PBS溶液中； 2 )、加入有效量的标记试剂与单克隆抗体样品混合，并混匀，在室温下反应； 3)、去除未反应的过量标记试剂，即得到体外化学标记过的单克隆抗体。
8.权利要求 2所述的单克隆抗体在检测 VEGF蛋白中的应用。
9.权利要求 7所述的体外化学标记过的单克隆抗体在检测 VEGF蛋白中的应用。
10.权利要求 2所述的单克隆抗体在分离 VEGF蛋白中的应用。