CN1687134A - 幽门螺杆菌HpaA和ureB单克隆抗体、免疫测定法和诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了以杂交瘤技术制备单克隆抗体,抗体针对的抗原为抗幽门螺杆菌HpaA及尿素酶B亚单位。本发明提供了以针对两种抗原的单克隆抗体为基础制成的诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒,通过它可快速而经济的诊断幽门螺杆菌感染,取材简单并且不对病人造成任何痛苦,不需借助任何特殊装置。本发明提供的两种单克隆抗体,可实现高特异性检测,并且也可实现检测的高敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及两种识别作为抗原的幽门螺杆菌HpaA和UreB(尿素酶B亚单位)的单克隆抗体,一种免疫测定法和诊断试剂盒。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)自1983年被澳大利亚学者从胃炎病人的活体标本中分离出来后,国内外学者对Hp及其与胃肠病的关系,进行了广泛而深入研究,业已证实HP是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因子,并且是胃腺癌及胃黏膜相关恶性淋巴瘤(MALT)的诱发因素之一,国际癌症研究中心(IARC)于1994年将HP列为I类致癌因子。
自Hp发现以来,随着人们对Hp研究的不断深入,Hp感染在胃和十二指肠疾病中的重要作用逐渐被认识,同时Hp感染的检测方法也得到迅速发展。目前,Hp感染的检测有多种方法,其中侵入性方法需胃镜检查及胃粘膜活检,患者依从性差,并易引起交叉感染,特别是对Hp根除治疗后的随访难以进行,因而其应用受到一定限制。在非侵入性方法中,尿素呼气试验已经证实具有很高的敏感性和特异性,且能反映Hp的活动性感染,可用于根除Hp治疗后的随访,但13C尿素呼气试验需用价格昂贵的质谱仪或红外分析仪,14C是放射性同位素,对人体有一定的影响,临床应用受限。而血清学方法在病人根除性治疗很长一段时间内抗体持续阳性,不能及时反映患者HP感染的现状。因而有必要寻找一种准确性高、无创、简便、价廉的诊断Hp感染新方法。
胃上皮细胞每1~3d更新1次,在更新过程中,这些脱落的上皮细胞及其在表面定植的Hp经过胃肠道,最后随粪便排出。因此,粪便有可能作为诊断Hp感染的检测标本。因为粪便是一种易得标本,很早就有粪便HP培养和PCR检测的研究。90年代初期即从粪便中培养和分离出HP,但培养阳性率较低。PCR方法检测粪便HP费用较高,操作复杂,并且粪便中存在一些抑制物质可干扰检测结果。
HpSA检测方法首先见于1997年美国胃肠病周会议摘要,同年美鼎公司开始推出免疫微孔板检测粪便中的Hp抗原试剂盒(PremierPlatimumHpSA),美国FDA于1988年正式批准这一试验用于临床。HpSA试验用于Hp感染的诊断国外已有很多报道,其敏感性和特异性一般在90%~98%。可与13C-或14C-尿素呼气试验相媲美。(HpSA免疫快检卡检测幽门螺杆菌粪便抗原的临床价值李宜辉,郭红,重庆医学2004年01期)
早先出现的粪便Hp检测试剂盒是利用免疫亲和纯化的兔抗幽门螺杆菌多克隆抗体检测HP感染,如Premier Platinum HpSA。然而,多克隆抗体通常有交叉反应,特异性较低,其特异性还可以随抗血清的批次而变化。敏感性较低,总体准确性不令人满意。尔后以FemtoLab H.pylori为代表的单克隆抗体夹心ELISA试剂盒也问世。其敏感性和特异性及根除治疗早期诊断优于前者,有报道FemtoLab检测Hp的敏感性为98-100%,特异性为76%。(X.Calvet,Digestive and Liver Disease Volume 36,Issue 7.July 2004,Pages450-454,Diagnosis of Helicobacter pylori infection in dyspeptic patients by stool antigendetection Usefulness of a new monoclonal enzyme immunoassay test)因此,以单克隆抗体为基础的检测越来越受到人们关注。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足,本发明目的是提供一种幽门螺杆菌的诊断方法,它成本低,取材无创性,无需特别检测装置。检测时使用的单克隆抗体,无交叉反应,特异性强,灵敏度良好。
本发明提供了一种识别幽门螺杆菌HpaA抗原的单克隆抗体及一种识别幽门螺杆菌尿素酶B亚单位抗原的单克隆抗体。
以识别幽门螺杆菌HpaA抗原及幽门螺杆菌尿素酶B亚单位抗原的单克隆抗体为基础制备的诊断幽门螺杆菌试剂盒为本发明的创新点之一,至今国内外尚无将两种单克隆抗体联合制备诊断试剂盒的相关文献报道。
本发明的诊断试剂盒主要有三种创新形式(以ELISA夹心法为例):一种以权利要求1所述的任一种抗幽门螺杆菌单克隆抗体为包被抗体和酶标夹心抗体;一种以抗幽门螺杆菌多克隆抗体为包被抗体,抗HpaA单克隆抗体或抗尿素酶B亚单位单克隆抗体为酶标夹心抗体;一种以抗幽门螺杆菌多克降抗体为包被抗体,抗HpaA单克隆抗体和抗尿素酶B亚单位单克隆抗体为酶标夹心抗体。
由于幽门螺杆菌HpaA抗原及尿素酶B亚单位抗原在幽门螺杆菌不同菌株及临床分离株含量较高,且在球形变的幽门螺杆菌中稳定存在(见实施例2),因此使以针对两种抗原的单克隆抗体制备的诊断试剂盒成为可能。以两种单克隆抗体为夹心抗体(第一种方法),提高了检测的准确性;由于抗HpaA单克隆抗体,抗尿素酶B亚单位单克隆抗体与肠道常见菌均无交叉反应(见实施例2),因此使以抗幽门螺杆菌多克隆抗体为包被抗体,以抗HpaA单克隆抗体或抗尿素酶B亚单位单克隆抗体为酶标夹心抗体的检测方法(其余两种方法)具有相当的可行性。
以下对本发明内容技术详细描述:
本发明的单克隆抗体以识别幽门螺杆菌为抗原。
本发明的单克隆抗体可通过采用目前成熟的杂交瘤技术产生,但产生单抗的方法不受特别限制,其它方法产生的抗体如能与幽门螺杆菌的HpaA或尿素酶B亚单位特异结合,也在本发明范围之内。
关于免疫原的优选:本发明采用的HpaA抗原为本申请人采用基因工程方法制备;本发明采用的尿素酶B亚单位抗原也为本申请人采用基因工程方法制备。(声明:本发明的HpaA抗原和尿素酶B亚单位抗原已由本申请人已通过文献形式对外公开,外界人员可以通过购买或惠赠方法得到此抗原,后附声明附件)。
HpaA的全称为神经氨酰乳糖结合原纤维血凝素,是HP多种黏附素中的一种,有研究表明,与健康对照组相比,大多数HP感染个体血清和胃液中存在明显较高水平的抗HpaA特异性抗体。Dolores检测不同胃病患者分离的HP菌株基因序列,发现变异很少,从而推定氨基酸序列变异程度很小,不会对HtpaA蛋白产生影响。此外,有实验证明HpaA在所有实验的HP菌株中表达,针对该蛋白产生的抗体不与人体内的正常菌群和胃黏膜组织发生交叉反应。(Evans DG,Evans DJ JR,MouldsTJ,N-acetylneuraminyllactose-binding fibrillar hemagglutinin of Campylobacter pylori:aputative colomization factor antigen[J].Infect Immun,1998,56:2896-2906)本发明制备的抗HpaA单抗经实验证明与所有幽门螺杆菌菌株反应良好,相反与其它肠道常见菌不发生交叉反应,如实施例2所示。
尿素酶B亚单位(以下简称UreB)是HP的外膜蛋白,约占菌体总蛋白的5%,HP各菌株间相对保守,同源性在98%以上(幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆、表达及免疫原性研究 李明峰1 世界华人消化杂志 ISSN1007-9319)。变形杆菌,肺炎克雷白菌,大肠杆菌等常见肠道细菌中的部分氨基酸序列与HP的尿素酶有较高的同源性,但本发明获得的单抗与上述几种细菌均无交叉反应。见实施例2。
上述免疫原不受特别限制,可以是任何含有幽门螺杆菌HpaA或UreB的免疫原。例如培养获得的幽门螺杆菌的螺旋形细胞、球形细胞,破碎产物、裂解产物或这些细胞的抽提物。用作免疫原的幽门螺杆菌菌株不受特别限制,可以是标准菌株,可以是感染病人的分离菌株。用作免疫原的幽门螺杆菌基因型不受特别限制,可以含有或不含有vacA或cagA。
上述提到的免疫原中,优选球菌的破碎产物。因为在体外,幽门螺杆菌形态从原来的螺旋形变成球形,不能被培养,在低温、营养缺陷、氧缺陷等不良环境条件下不能被培养,因此认为它转化成球菌型,不能培养分离,在消化道***物中也一样。还认为幽门螺杆菌在消化道中以破碎形式存在。
经免疫产生本发明的杂交瘤的动物不受特别限制,但包括如小鼠、大鼠、山羊、豚鼠、家兔,其中优选是小鼠。
可用任何本领域已知的方法免疫上述要免疫的动物。优选50-100微克/只的免疫抗原乳化在等体积(0.25毫升)生理盐水和完全弗氏佐剂,将该乳液注射给上述动物,在背部及四肢皮下注射免疫,每隔2-3周免疫2-3次。
选取免疫后抗体效价高的个体,最后一次加强免疫3-5日后切下脾脏经研磨后与骨髓瘤细胞通过本领域已知的融合方法,在融合剂存在下融合。
上述融合剂不受特别限制,包括如聚乙二醇(PEG),仙台病毒等,但PEG优选。
上述骨髓瘤细胞不受特别限制,但包括如AG1和AG2细胞,P3U1、NS-1、SP2/0细胞。
上述融合方法包括以1∶1-10∶1之比例混合脾细胞和骨髓瘤细胞,加入分子量为1,000-6,000的PEG至浓度10-80%融合。
融合后的杂交瘤细胞以HAT为选择培养基37℃,5-10%CO2培养箱内培养,以ELISA法测定个杂交瘤培养上清抗体效价,选取高效价克隆株,以有限稀释法重复亚克隆产生单抗的杂交瘤,从而得到高效价分泌特异性针对幽门螺杆菌HpaA或UreB的单抗的杂交瘤细胞。
大量制备本发明的单克隆抗体的方法不受特别限制,可以是:将分泌单克隆抗体的杂交瘤注射到预先注射石蜡油的小鼠腹腔中,回收腹水并从中获得抗体。用蛋白A柱或蛋白B柱等纯化腹水中的单克隆抗体。
本发明的单充隆抗体的家族和亚家族不受特别限制,可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA1、IgA2和IgD。L链也不受特别限制,可以是κ链或λ链。
本发明的单克隆抗体不受特别限制,但可以是任何与幽门螺杆菌HpaA或UreB特异性结合的抗体。如F(ab’)2、Fab’或Fab,它是本发明单抗的降解产物,或嵌和抗体。
虽然已知存在各种幽门螺杆菌突变株,单克隆抗体A2与所有幽门螺杆菌菌株的HpaA抗原反应良好;单克隆抗体6E6与所有幽门螺杆菌的UreB抗原反应良好,如实施例2所示。由此可以说明,被本发明的单抗识别的表位似乎是在突变株内的HpaA和UreB非常保守的位点。
用单抗A2和6E6对粪便样品进行免疫测定。两株单克隆抗体都仅与感染有幽门螺杆菌的个体的粪便反应。因此揭示了幽门螺杆菌的HpaA抗原及UreB抗原存在于感染有幽门螺杆菌的个体的粪便中。
通常作为由于免疫测定方法的单克隆抗体,考虑以灵敏度高的单克隆抗体作为优选抗体,因为与特异性低而背景高的多克隆抗体比较,其特异性高而背景低。
本发明的免疫测定方法,例如酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹、免疫层析等技术。上述各种免疫测定法可用于以竞争法或夹心法。
在上述各种免疫测定方法中,ELISA和免疫胶体金技术是优选的。
为了用上述竞争方法进行本发明的免疫测定法,在本发明的单克隆抗体通过已知方法物即或化学结合的固相中加入含有未知量的幽门螺杆菌HpaA或UreB标本,使反应进行。同时,加入用标记剂标记的预定量的幽门螺杆菌HpaA或UreB,使反应进行。
用上述夹心法实施本发明的免疫测定法中,将本发明的单克隆抗体通过已知物理或化学方法结合于固相上加入含有未知量的幽门螺杆菌HpaA或UreB的标本中,使反应进行。然后,加入用标记剂标记的本发明的单克隆抗体,使反应进行。
对于上述标记剂,提到使用放射形同位素,例如125I、磷光物质、荧光物质、生物素等。可使用马来酰亚胺法,活化生物素法或疏水键法。
对于上述标记物,提到使用的酶,可以是过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。对于底物可选择适用于该场合所用的酶的底物,例如:ABTS、邻苯二胺-H2O2、磷酸对硝基苯酯等。
本发明的诊断试剂盒含有至少一种本发明的单克隆抗体。此单克隆抗体不受特别限制,可以是任何识别幽门螺杆菌HpaA或UreB的单克隆抗体,还可以是单克隆抗体的分解产物,如F(ab’)2、Fab’或Fab等。
在本发明的诊断试剂盒中,本发明的单克隆抗体可预先固定在固相上,本发明的固相不受特别限制,可包括如聚苯乙烯、玻璃珠、磁性颗粒、免疫层析用滤纸或其他不溶性载体。
本发明的诊断试剂盒还可含有其他组件。包括例如标记用的酶、其底物、放射性同位素、磷光物质、荧光物质、稀释液等。
本发明的诊断试剂盒可以是以ELISA为基础的试剂盒,其中以夹心法为优选。其具有灵敏度高,反应时间短,准确率高等优点。而使用免疫胶体金技术为基础的试剂盒使得测试方法简单,而且可通过肉眼判断结果。
本发明诊断试剂盒所检测的标本不受特别限制,可包括胃内容物、胃液、消化道***物,其中以消化道***物为优选。
本发明的诊断试剂盒可以在幽门螺杆菌根除性治疗前用于检测感染是否存在,还可以用于判断幽门螺杆菌根除性治疗成功与否(一般在治疗4周以后)。
具体实施方式
实施例1
[单克隆抗体的制备]
(1)幽门螺杆菌HpaA及UreB抗原的制备:为本教研室采用基因工程方法制备并纯化。
(i)鞭毛粘附素HpaA抗原的制备及纯化:采用PCR技术从幽门螺杆菌基因组中扩增hpaA基因,克隆至表达载体pET-28a(+)中,IPTG诱导表达重组蛋白HpaA(rHpaA),粗纯化后的rHpaA免疫家兔获得了高效价的兔抗HpaA抗血清,(幽门螺杆菌粘附素基因hpaA研究,洪愉,消化外科2003,2(5).-331-335)将表达HpaA蛋白的工程菌经高压均质机破菌获得包涵体,经洗涤、变性、复性,Q Sepharose High Performance阳离子交换层析和亲和层析二步分离纯化。采用SDS-PAGE和HPLC检测纯度高达95%以上,用Westem blot检测纯化后蛋白具有良好的抗原性。(重组幽门螺杆菌粘附素的纯化工艺 刘正祥 中国生物制品学杂志-2004.17(3).-145-148)
(ii)UreB抗原的制备及纯化:用PCR技术从临床分离的Hp菌株基因组中扩增出UreB基因,将其克隆于质粒PinPointXaIII上进行IPTG诱导蛋白表达,通过亲和层析得到纯化的重组UreB蛋白,其纯度可达90%并保持较好的免疫原性。(幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因克隆表达及临床应用/吴超《中华检验医学杂志》2001年9月第24卷第5期)
(2)免疫和细胞融合
将(1)制备的等量免疫原与弗氏完全佐剂混合,得到油状乳液。将该乳液以0.5毫升的剂量皮下注射给BALB/c小鼠背部及四肢。每隔两周注射一次,共计三次。二、三次免疫使用弗氏不完全佐剂。第四次免疫以液体抗原腹腔注射,3-5天后取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)以10∶1混合,用50%聚乙二醇4000融合。以HAT选择培养基培养杂交瘤。
(3)杂交瘤的选择
在融合后第12天,用ELISA法测定培养上清中抗体效价。取100微升的融合细胞的培养上清加到96孔ELISA板中,其中每孔包被有2微克/毫升的免疫原,37℃孵育30分钟,用含有0.05%Tween20的Tris碱洗涤,于各孔中加入100微升过氧化物酶标记的抗小鼠IgG。37℃孵育30分钟,洗涤,每孔加入100微升底物溶液(0.04%OPD和0.05%过氧化氢溶液),室温反应10分钟。每孔加入2M硫酸终止反应,492纳米测量吸光度。选择吸光度大于1的杂交瘤克隆。用有限稀释法对克隆进行3-4次克隆,直到阳性克隆孔100%分泌单抗。克隆后的杂交瘤以106-7浓度移植到预先注射石蜡油的BALB/c小鼠中,结果发现21个杂交瘤克隆产生各种可以作为腹水回收的单抗。
(4)单抗的纯化
采用辛酸-硫酸铵法,即:取8ml腹水,2500r/min离心去杂质,加入0.06mol/L,PH4.0NaAc-Hac缓冲液8ml,调PH至4.8;加入264ul正辛酸(33ul/ml腹水),室温搅拌30min,4℃搅拌60min,逐滴加完,4℃澄清2小时;取出15000r/min,离心30min(4℃),去沉淀,上清加入1/10体积的10×PBS(0.01mol/L,PH7.4)用1mol/L NaOH调PH至7.2;上清滴加等量饱和硫酸铵(PH7.2-7.4)溶液,使硫酸铵的饱和度为50%,继续搅拌10-30min,静置30min;10000r/min(4℃)离心30min,弃上清,将沉淀溶于1.2ml,0.01mol/L,PH7.4PBS中;0.01mol/L,PH7.4 PBS透析过夜(4℃),其间换液3次,收集透析袋内液体,-20℃保存备用。
实施例2
[菌株间反应性比较和与其它种类细菌的反应性]
(1)幽门螺杆菌细胞悬液的制备
在补充有5%去纤维蛋白牛血的脑心滴注琼脂培养基上分步划线培养各种幽门螺杆菌菌株(国际标准菌株NCTC11637、中国重庆临床分离株CCS9801、CCS9802、CCS9803、CCS9806)平板在微氧环境中37℃培养2-3天,得到螺旋形细胞菌落,或在无氧环境下37℃培养7天,导致细胞变成球形。用L棒刮下各菌落,悬浮在PBS中。10,000×g 4℃离心10分钟,收集细胞,悬浮在4℃保持4天灭活。然后,悬浮在PBS中,在10,000×g 4℃离心10分钟,收集细胞,再悬浮于PBS中重复三次,洗涤细胞。以此获得了幽门螺杆菌螺旋细胞悬液和球形细胞悬液。
(2)其它幽门螺杆菌细胞悬液的制备
猫螺杆菌(CCSC01、CCSC02)在补充有5%去纤维蛋白兔血的脑心滴注琼脂培养基上用(1)中相同的方法培养获得。
(3)其它肠道杆菌细胞悬液的制备
将大肠杆菌,伤寒杆菌,变形杆菌,志贺杆菌,肺炎克雷伯菌,接种于普通琼脂培养基上,37℃培养1天。挑取典型菌落于LB培养基中培养4小时获得各肠道菌。
(4)细胞破碎产物的制备
用超声碎菌仪(JY92-II型)超声打碎细胞。
(5)western blot检测特异性
用实施例2(1-3)制备的细菌分别Tricine电泳(10%浓度),然后在70V电压下转膜,以10%脱脂奶粉37℃封闭1小时,以TBS摇晃洗涤3次,每次10分钟,分别与抗HpaA单抗及抗UreB单抗37℃反应一小时,以TBS摇晃洗涤3次,用羊抗鼠酶标二抗(北京中山)以1∶10,000稀释37℃反应一小时,以TBS摇晃洗涤3次,以0.4ug/ml DAB和0.5ul/ml过氧化氢显色,2M硫酸终止。
检测结果如下:
表1
菌株 | 抗HpaA单抗 | 抗UreB单抗 |
幽门螺杆菌NCTC11637号螺旋形细胞 | 阳性 | 阳性 |
幽门螺杆菌CCS9801号螺旋形细胞 | 阳性 | 阳性 |
幽门螺杆菌CCS9802号螺旋形细胞 | 阳性 | 阳性 |
幽门螺杆菌CCS9803号螺旋形细胞 | 阳性 | 阳性 |
幽门螺杆菌CCS9806号螺旋形细胞 | 阳性 | 阳性 |
幽门螺杆菌CCS98101号球形细胞 | 阳性 | 阳性 |
幽门螺杆菌CCS98102号球形细胞 | 阳性 | 阳性 |
猫螺杆菌CCSC01号螺旋形细胞 | 阴性 | 阴性 |
猫螺杆菌CCSC02号螺旋形细胞 | 阴性 | 阴性 |
大肠杆菌 | 阴性 | 阴性 |
伤寒杆菌 | 阴性 | 阴性 |
志贺杆菌 | 阴性 | 阴性 |
变形杆菌 | 阴性 | 阴性 |
肺炎克雷白菌 | 阴性 | 阴性 |
如表1所示,发现抗HpaA单抗和抗UreB单抗显示针对各种幽门螺杆菌的螺旋形和球形有高度的反应性,而与肠道杆菌,猫螺杆菌无反应。显示此两种单抗与幽门螺杆菌的螺旋形及球形的反应特异性。
实施例3
[兔抗幽门螺杆菌多抗的制备]
用等份的弗氏完全佐剂(总免疫原是1.0ml)等份稀释实施例2中所得到的细菌上清夜使得每毫升含1×108个细胞。把该溶液研磨成油包水状,于四肢***、背部皮下免疫,2-3周以弗氏不完全佐剂同法免疫2次,其间以ELISA检测抗体效价,取效价大于1万者液体加强免疫,3-5天后心脏取血。多抗的纯化同前。
实施例4
[用夹心ELISA法检测消化道***物中的幽门螺杆菌]
以夹心ELISA检测粪便幽门螺杆菌方法有四:以抗HpaA单抗包被ELISA板,抗幽门螺杆菌多抗作酶标二抗;以抗UreB单抗包被ELISA板,抗幽门螺杆菌多抗作酶标二抗;以抗HpaA单抗和抗UreB单抗等体积包被ELISA板,抗幽门螺杆菌多抗作酶标二抗;以抗HpaA单抗包被ELISA板,以抗UreB单抗作酶标二抗。
(1)抗体的固定
将抗HpaA单抗,抗尿素酶单抗及抗HpaA单抗与抗UreB单抗等体积混合液分别以5ug/ml稀释于抗体稀释液中,以每孔100ul加入ELISA板,4℃过夜,以Tris盐缓冲液洗涤板。
(2)辣根过氧化物酶标记抗体的制备
用改良过碘酸钠法(沈关心:现代免疫学实验技术,第五章,免疫标记技术,1998年,湖北科学技术出版社出版)制备了过氧化物酶标记的单抗。取5mgHRP溶于1ml0.3mol/L,PH8.1NAHCO3,加入1%DNFB无水乙醇0.1ml,室温搅拌1小时;加1ml0.06ml/LnaIO4,室温避光轻搅30分钟,溶液呈黄绿色;加1m10.16mol/L乙二醇,室温轻搅1小时终止氧化反应;装入透吸袋,以0.01mol/L,PH9.5碳酸盐缓冲液1000ml,4℃透析过夜;于3ml醛化HRP溶液中加入含5mg抗UreB单抗/抗幽门螺杆菌多抗的碳酸盐缓冲液1ml,室温避光结合2-3小时;加入5mgNaHB4,放4℃3小时;装入透析袋,对0.01mol/L,PH7.2 PBS,4℃透析24小时;3000r/min离心30分钟,除去沉淀,上清液通过Sephadex G-200凝胶柱层析,PBS洗脱。于结合物中加入BSA至蛋白浓度为10mg/ml,低温保存备用。
(3)以夹心ELISA法检测粪便中幽门螺杆菌
将以金标准13C诊断为阳性的病人10例和诊断为阴性的正常对照10例的粪便标本(各100毫克)悬浮在400微升0.1%脱脂牛奶-PBS中,各混合物旋涡振荡20s,每孔加入100ul稀释杆品,并于每孔加入100ul酶标抗体,室温放置1小时,洗涤后,加入100微升底物显色液,室温10分钟,以100微升终止液终止, 492nm测量OD值。
表2
标本号 | 13C呼出测试*1 | 抗HpaA单抗包被,多抗为酶标二抗*2 | 抗UreB单抗包被,多抗为酶标二抗*2 | 抗HpaA、UreB单抗包被,多抗为酶标二抗*2 | 抗HpaA单抗包被,抗UreB单抗为酶标二抗*2 |
1 | + | + | + | + | + |
2 | + | + | + | + | + |
3 | + | + | + | + | + |
4 | + | + | + | + | + |
5 | + | + | + | + | + |
6 | + | + | + | + | + |
7 | + | + | + | + | + |
8 | + | + | + | + | + |
9 | + | + | + | + | + |
10 | + | + | + | + | + |
11 | - | - | - | - | - |
12 | - | - | - | - | - |
13 | - | - | - | - | - |
14 | - | - | - | - | - |
15 | - | - | - | - | - |
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18 | - | - | - | - | - |
19 | - | - | - | - | - |
20 | - | - | - | - | - |
*1:+阳性(>5每mil)、-阴性
*2:+阳性(>0.1)、-阴性
如表2所示,四种夹心ELISA法检测幽门螺杆菌感染的结果与C13呼出实验测试结果相符。
实施例5
[胶体金免疫层析法检测粪便中幽门螺杆菌]
(1)胶体金的制备:取0.1%的氯金酸适量,搅拌状态下加热回流,沸腾后加入新鲜配制的1.0%的柠檬酸三钠,溶液由黄最终变成葡萄酒红色时,冷却,加水补足100ml,调PH值至8.0-8.2,过滤后4℃保存。
(2)胶体金-本发明抗幽门螺杆菌多抗或抗HpaA单抗结合物的制备:取制备的胶体金溶液100ml,0.2mol/L碳酸钾调PH8.6,边搅拌边加入抗幽门螺杆菌多抗或抗HpaA单抗,加完抗体后5min后加入10ml 20mmol/L硼酸缓冲液,搅拌1小时。加入金标抗体封闭液,继续搅拌30分钟。13,000r/min,离心40分钟,弃上清。以金标抗体洗涤液(2mmol/L硼酸缓冲液,5mmol/LNaCl)洗涤2次,所得沉淀为金标记抗幽门螺杆菌多抗/抗HpaA单抗结合物。沉淀以保护液重悬,4℃保存备用。
(3)试剂条原材料的处理:将结合垫(玻璃纤维膜)、样品垫裁剪成适当尺寸,浸泡在处理液(Na2B4O710H2O100mmol,Triton-1000.3%,BSA0.2%)中至少3小时以上,37℃烘干备用。
(4)喷涂:将金标抗体、单抗(抗HpaA单抗或抗UreB单抗)、羊抗鼠IgG制成工作浓度,喷涂在结合垫和NC膜上,置37℃烘箱30分钟,4℃保存。
(5)免疫测试条的制备:根据Mqller-Bardoff法改进。整个试纸条由吸水玻璃纤维和NC膜、吸水滤纸及白色塑料垫板组成。将吸水纸、包被NC膜(包被有单抗及羊抗鼠IgG)、喷涂玻璃纤维(金标抗体)依次由上而下固定于白色塑料板上,切成0.4cm×5cm条,4℃保存。
(6)以金标记免疫层析法检测粪便中幽门螺杆菌
将以金标准13C诊断为阳性的病人5例和诊断为阴性的正常对照5例的粪便标本(各100毫克)悬浮在1毫升稀释液中,各混合物旋涡振荡20s,以试纸条检测结果如表3
表3
标本号 | 13C呼出测试*1 | 胶体金标记多抗,抗HpaA单抗为检测抗体*2 | 胶体金标记多抗,抗UreB单抗为检测抗体*2 | 胶体金标记多抗,抗HpaA、UreB单抗为检测抗体*2 | 胶体金标记抗HpaA单抗,抗UreB单抗为检测抗体*2 |
1 | + | + | + | + | ±*3 |
2 | + | + | + | + | + |
3 | + | ± | + | + | ± |
4 | + | + | + | + | + |
5 | + | + | + | + | + |
6 | - | - | - | - | - |
7 | - | - | - | - | - |
8 | - | - | - | - | - |
9 | - | - | - | - | - |
10 | - | - | - | ± | - |
*1:+阳性(>5每mil)、-阴性
*2:+阳性(出现两条显色带)、-阴性(只对照线有显色带)
*3:弱阳性(检测线较对照线显色较弱)
由此可见以金标记免疫层析法检测幽门螺杆菌感染的结果与C13呼出实验测试结果基本相符。
本发明的优点:本发明提供了制备能特异性识别存在幽门螺杆菌中的HpaA及UreB抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤技术,从而通过该技术制备的单克隆抗体可以非常专一的识别幽门螺杆菌。以本发明的单克隆抗体为基础的诊断试剂盒特异性高,准确性良好,可用消化道***物为标本,取材方便,病人依从性好,尤其以胶体金免疫层析法制成的诊断试纸条使检测在几分钟完成突出了试剂盒的简单性及省时性的特点。
Claims (13)
1.一种单克隆抗体,其特征在于:一种单克隆抗体识别幽门螺杆菌HpaA作为抗原,另一种单克隆抗体识别幽门螺杆菌尿素酶B亚单位,它们均以杂交瘤技术制备获得,其免疫原是任何含有幽门螺杆菌HpaA或UreB的免疫原。
2.一种免疫测定法,其特征在于,该方法是用至少一种权利要求1所述的抗原针对的单克隆抗体进行的。
3.如权利要求2所述的免疫测定法,其特征在于,用该免疫测定法判断幽门螺杆菌的感染。
4.如权利要求2所述的免疫测定法,其特征在于,标本是消化道***物。
5.如权利要求4所述的免疫测定法,其特征在于,所述测定方法用ELISA技术进行。
6.如权利要求2所述的免疫测定法,其特征在于,所述测定方法用胶体金试纸进行。
7.一种诊断试剂盒,其特征在于,该试剂盒含有至少一种权利要求1所述的抗原针对的单克隆抗体。
8.如权利要求7所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于诊断幽门螺杆菌感染。
9.如权利要求7所述的诊断试剂盒,其特征在于,所检测的标本是消化道***物。
10.如权利要求9所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒采用ELISA技术,以权利要求1所述的任一种抗幽门螺杆菌单克隆抗体为包被抗体和酶标夹心抗体;
11.如权利要求9所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒采用ELISA技术,以权利要求1所述的任一种抗幽门螺杆菌多克隆抗体为包被抗体,抗HpaA单克隆抗体或抗尿素酶B亚单位单克隆抗体为酶标夹心抗体;
12.如权利要求9所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒采用ELISA技术,以权利要求1所述的任一种一种以抗幽门螺杆菌多克隆抗体为包被抗体,抗HpaA单克隆抗体和抗尿素酶B亚单位单克隆抗体为酶标夹心抗体。
13.如权利要求9所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒采用胶体金试纸进行。
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