CN109134594B - 一种酶法制备谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法制备谷胱甘肽的方法,包括以下步骤:(1)利用GshF酶、ATP再生酶和AK酶在反应器中生成谷胱甘肽;(2)在反应器中分离固定化的GshF酶、ATP再生酶和AK酶,或使用过滤设备分离游离的GshF酶;(3)将步骤(2)得到的滤出液进行分离,得粗产物GSH以及少量的ATP、ADP和AMP;(4)将步骤(3)得到的GSH通过浓缩、结晶、干燥制备成品GSH。本发明具有以下优点:使用腺苷替代ATP或AMP,为工业生产节约了大量成本;优化了GSH生产的反应条件,反应速率快;建立了稳定的酶回收体系,节能环保;副产物可直接用于循环反应,或集中收集用于生产ATP,操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及谷胱甘肽的制备方法,特别涉及一种酶法制备谷胱甘肽的方法,具体为使用腺苷代替ATP的酶法制备谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽广泛存在于动植物和微生物中,是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一,具有还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG),生物体内大量存在并起主要作用的是GSH,广泛用于治疗肝脏疾病、肿瘤、氧中毒、衰老和内分泌疾病,并作为生物活性添加剂及抗氧化剂用于食品、化妆品领域。
GSH由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)经肽键缩合而成的三肽。相对分子质量为307.32,等电点为5.93,常温下为白色晶体,易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺等溶剂。
目前谷胱甘肽的主要制备方法有:溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。萃取法从谷物胚芽中提取GSH,由于GSH得率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高,而且消耗大量粮食,现已较少使用。化学合成法合成GSH,由于活性产物不易分离,需要化学拆分,产品纯度不高,难以推广。目前国内外GSH生产基本采用发酵法,原理是将编码GSH合成酶系的基因克隆到细菌或酵母中,使用微生物发酵生产GSH。发酵法,尤其是酵母发酵法工艺较成熟,但生产周期长,产量偏低,且过多的副产物使下游工艺处理复杂,需使用铜盐法沉淀GSH,环境污染较大。
近年来酶法生产GSH技术有较大提高。新型的双功能谷胱甘肽合成酶(GshF,EC6.3.2.-)逐渐取代原有的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh I,EC 6.3.2.2)和谷胱甘肽合成酶(Gsh II,EC 6.3.2.2)两种酶,用来酶法催化生产GSH,反馈抑制作用较小,非常适合应用于大规模生产。
理论上,无论使用Gsh I和Gsh II酶组合或者使用单一GshF酶合成GSH都需要三磷酸腺苷(ATP)作为能量供体,现阶段工业化生产GSH的难题是如何提高ATP利用率,降低ATP的使用量。通常生产1kg GSH至少需使用3-5kg的ATP,成本过高。专利CN201210201691.2使用酵母糖酵解再生ATP,效果稳定。但使用酵母会在反应体系中引入色素等杂质,给进一步纯化增加难度。专利CN201510762184.X与CN201610167664.6中使用酶法再生ATP,取得了很好的效果。ATP再生酶包括多聚磷酸激酶(PPK,EC 2.7.4.1)、腺苷酸激酶(ADK,EC 2.7.4.3)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP,EC 2.7.4.-)。其中,PPK酶催化ADP与多聚磷酸或其盐反应生成ATP,ADK酶催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP,PAP酶则催化AMP与多聚磷酸或其盐反应生成ADP。PPK、ADK及PAP三种酶的合理组合均可再生ATP。但使用此方法仍需加入一定量的ATP进行酶促反应。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种酶法制备谷胱甘肽的方法,其在原有含有GshF及ATP再生酶的反应体系中添加腺苷激酶(AK,EC 2.7.1.20),该酶可催化腺苷生成AMP,组合上述其它ATP再生酶,可不使用ATP,仅添加少量腺苷即可规模化生产GSH。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
一种酶法制备谷胱甘肽的方法,包括以下步骤:
(1)利用GshF酶、ATP再生酶和AK酶在反应罐中生成谷胱甘肽:
通过基因工程改造、发酵、纯化获得GshF酶、ATP再生酶和AK酶,或以自然提取等其它方式获得GshF酶、ATP再生酶和AK酶。上述所有酶可以以游离酶的形式制成酶液;也可进一步固定于固定化载体上,制得固定化酶。
在反应体系中按比例添加GshF酶、ATP再生酶和AK酶,反应生成GSH,其中,所述反应体系为含有底物谷氨酸(Glu)或其盐、半胱氨酸(Cys)或其盐、甘氨酸(Gly)或其盐、腺苷、多聚磷酸或其盐以及镁离子和锰离子的一种或两种的水溶液。
另外,反应体系中还可包含钾离子、钠离子、铵离子的一种或几种,Tris和磷酸根离子的一种或几种。
上述添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系,也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。
(2)在反应罐中分离固定化的GshF酶、ATP再生酶和AK酶,或使用过滤设备分离游离的GshF酶:
固定化的GshF酶、ATP再生酶和AK酶在反应罐中直接分离。上述分离可通过滤袋分离,也可在反应柱中直接分离。
游离的GshF酶、ATP再生酶和AK酶通过过滤器中超滤膜分离。其中,过滤器具有进料口、出料口和回流口,内设截留分子量不大于20kDa的超滤膜。经过过滤器的截留液为回收的酶液,滤出液为分离出酶之后含产物的反应液。
(3)通过离子交换法将步骤(2)得到的滤出液进行分离,分离得粗产物GSH以及少量的ATP、ADP和AMP:
通过离子交换法,从上述步骤(2)的滤出液中分离粗产物GSH,经离子交换后的穿出液中主要含有少量ATP、ADP、AMP。
(4)将步骤(3)得到的GSH通过浓缩、结晶、干燥制备成品GSH。
优选地,上述技术方案中,所述酶法制备谷胱甘肽的方法还包括以下步骤:
(5)所述步骤(2)中分离的GshF酶、ATP再生酶和AK酶循环利用:即将分离的GshF酶、ATP再生酶和AK酶添加至反应罐中生成GSH的连续反应;
(6)GshF、ATP再生酶和AK酶的连续分离:即连续分离固定化的GshF酶、ATP再生酶和AK酶或使用过滤设备连续分离游离的GshF酶、ATP再生酶和AK酶。
优选地,上述技术方案中,所述酶法制备谷胱甘肽的方法还包括以下步骤:
(7)产物GSH的连续分离:反应生成的GSH通过过滤和/或离子交换方法分离。
(8)ATP、ADP和AMP的连续分离:反应生成的ATP、ADP和AMP通过过滤或离子交换方法分离,分离后的产物可直接添加至反应体系或进一步分离纯化后制成纯品。
优选地,上述技术方案中,所述步骤(1)至步骤(4)可以重复至少一次;优选重复多次,例如重复2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50次。
优选地,上述技术方案中,所述步骤(1)中在反应罐中生成谷胱甘肽的反应条件如下:
反应温度为25-55℃,优选温度为30-50℃;
反应pH为5-10,优选pH为6-9;
反应体系为含有底物氨基酸或其盐;腺苷;多聚磷酸或其盐;镁离子或锰离子的一种或多种组合;
在反应体系中添加GshF酶、ATP再生酶和AK酶,反应生成谷胱甘肽。
优选地,上述技术方案中,所述步骤(1)中在反应罐中生成谷胱甘肽的反应体系中还包括:钠离子、钾离子或铵离子的一种或多种组合;Tris或磷酸盐的水溶液的一种或两种组合;钾离子浓度为0.01-0.5M;钠离子浓度为0.01-0.5M;铵离子浓度为0.01-0.3M;Tris浓度为0.01-0.1M;磷酸盐浓度为0.01-0.1M。
优选地,上述技术方案中,所述氨基酸或其盐为L型氨基酸或其盐,优选为谷氨酸或其盐(Glu)、半胱氨酸或其盐(Cys)、甘氨酸或其盐(Gly)。按其经济成本及反应最优条件计算,三种氨基酸添加质量比优选为Glu:Cys:Gly=(1-2.5):1:(0.5-1.5),更优选为Glu:Cys:Gly=(1.2-2):1:(0.8-1.5);半胱氨酸(Cys)添加浓度优选为1-50g/L。
优选地,上述技术方案中,所述腺苷浓度为0.01-20g/L;多聚磷酸或其盐的浓度为0.01-0.3M;镁离子浓度为0.01-0.2M;锰离子浓度为0.005-0.15M。
优选地,上述技术方案中,所述镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种;锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种;钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的一种或多种;钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的一种或多种;铵离子选自于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的一种或多种;多聚磷酸或其盐选自于多聚磷酸钠、多聚磷酸钾和多聚磷酸铵中的一种或多种。
优选地,上述技术方案中,所述GshF酶、ATP再生酶和AK酶为游离或者固定化的酶;GshF酶浓度为0.01-10000U/L、AK酶浓度为0.01-8000U/L,其中将1μM底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。ATP再生酶为多聚磷酸激酶(PPK)、腺苷酸激酶(ADK)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP)中的任意两种或三种组合,PPK酶浓度为0.01-5000U/L,ADK酶浓度为0.01-5000U/L,PAP酶浓度为0.01-5000U/L。上述的GshF酶、ATP再生酶和AK酶可来源于任何生物,或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
优选地,上述技术方案中,所述固定化GshF酶、ATP再生酶和AK酶通过下列方式固定于固定化载体:吸附、交联、共价结合、包埋或其组合;固定化载体选自于高分子载体、无机载体和磁性高分子微球载体的一种或多种;其中,高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙和合成高聚物的一种或多种组合;无机载体选自多孔玻璃、氧化硅、活性炭、硅胶和硅藻土的一种或多种组合。
优选地,上述技术方案中,所采用的超滤膜选自于醋酸纤维素膜、聚砜膜、聚丙烯腈膜、聚氯乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜或陶瓷膜。
与现有技术相比,本发明技术具有以下有益效果:
1)使用腺苷替代ATP或AMP,为工业生产节约了大量成本,腺苷售价仅为ATP的10%或AMP的30%左右,价格低廉,来源广泛,且其在反应中的用量还可优化降至之前ATP用量的10%以下。
2)优化了GSH生产的反应条件,使GSH生成浓度达到30-50g/L,反应速率快,效率高;
3)建立了稳定的酶回收体系,整个反应过程中无论固定化酶还是游离酶都可以循环利用,应用于大规模连续生产后成本低,节能环保;
4)少量生成的副产物ATP、ADP及AMP或直接用于循环反应,或集中收集用于生产ATP,或通过过滤、离子交换等方法进行纯化,操作简单,纯化后成品可作为附加产品,有一定的经济效益;
附图说明
图1为本发明所使用的GshF酶、ATP再生酶和AK酶的SDS-PAGE图。
图2为本发明中使用游离酶制备GSH的工艺流程图。
图3为本发明中使用固定酶制备GSH的工艺流程图。
图4为本发明实施例2的HPLC图谱。
图5为对比例1的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细描述,以便于进一步理解本发明。
本发明以下实施例及对比例中使用的各种物质,如无特殊说明,均可通过商业途径获得。
实施例1粗酶的制备
本发明方法中的GshF酶、ATP再生酶和AK酶可以商购获得,或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
酶的制备过程如下:
根据GshF酶、PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶各酶基因序列设计引物,通过PCR分别扩增出基因片段,并将其分别连接至pET22b载体(市售),经测序正确后,分别转入E.coliBL21(DE3)菌株(市售)。
将转化后的E.coli BL21(DE3)单克隆接入LB培养基,培养至对数期后,加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导,诱导5小时收集菌体,使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。
将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基,培养至对数生长期后扩大培养,最终接入含500L发酵培养基的发酵罐中,培养至OD600值大于20时加入1mM IPTG诱导5小时后,离心收集菌体。
其中LB培养基成分为:1%蛋白胨、0.5%酵母粉和1%NaCl;种子培养基成分为:1%蛋白胨、0.5%酵母粉和1%氯化钠;发酵培养基成分为:1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化钠、5%磷酸氢二钠、1%磷酸二氢钠、0.01%硫酸镁和1%甘油。
图1为大肠杆菌表达的GshF酶、PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的SDS-PAGE图。如图1所示:泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(市售);泳道2为GshF酶,85kDa;泳道3为PPK酶,40kDa;泳道4为ADK酶,25kDa;泳道5为PAP酶,55kDa;泳道6为AK酶,40kDa。
收获的菌体经超声或高压匀浆破菌后,离心收集上清。通过沉淀和过滤方法制得粗酶。粗酶液中同时含有微量的ATP,不需要额外增加ATP即可启动反应,操作更加便捷。
实施例2使用游离酶制备GSH
图2为本发明方法使用游离酶制备GSH的工艺流程图。如图2所示:,根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备GSH:
(1)在反应罐中生成GSH:
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物2.5kg谷氨酸、2.5kg半胱氨酸和1.5kg甘氨酸、0.3kg腺苷,以及2.5kg六偏磷酸钠、0.2kg硫酸铵、0.3kg氯化钠、0.5kg六水氯化镁、0.1kg一水氯化锰和0.5kg磷酸氢二钠的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.0,在反应体系中添加GshF酶800U/L、PPK酶500U/L、ADK酶500U/L、PAP酶200U/L以及AK酶600U/L开始反应,所添加酶均为粗酶液。反应期间控制pH值为7.0,温度为37℃。
图4为本发明实施例2的HPLC图谱。如图4所示,在反应5小时后,高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量为35g/L,图中未标出峰为氨基酸等物质。
HPLC检测条件为:Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm),检测波长210nm,检测温度25℃。流动相为含有6.8g/L磷酸二氢钾、2.0g/L庚烷磺酸钠和3%甲醇的水溶液,pH=3.0。
(2)在过滤器中分离酶:
通过超滤方法,将步骤(1)的反应液经过过滤器分离混合酶,过滤器内装膜包(购于Pall公司,截留分子量20kDa),滤出液为分离出酶之后的反应液。
(3)分离产物GSH和其它物质:
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0,在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂,溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附,穿出液中主要含有ATP、ADP以及AMP。收集穿出液,用以生产ATP或进一步纯化为纯品ATP、ADP及AMP。
使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH,GSH产量3.2kg,收率90%。
(4)反应罐中生成GSH的连续反应,即步骤(1)的连续反应:
将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐,并添加原酶量5-10%的新酶进行反应。反应液配制方法同上述步骤(1)。
在37℃、pH为7.0的条件下进行生成GSH的连续反应;5小时后,HPLC检测GSH的生成量为32g/L。
HPLC检测条件同上述步骤(1)。在该步骤中,酶被循环利用。
实施例3使用游离酶制备GSH
如图2所示,根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备GSH:
(1)在反应罐中生成GSH:
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物2.0kg谷氨酸、2.0kg半胱氨酸盐酸盐和2.0kg甘氨酸、0.2kg腺苷,以及1.5kg六偏磷酸钠、0.2kg氯化铵、0.2kg氯化钾、0.8kg六水氯化镁和0.3kg Tris的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.4,在反应体系中添加GshF酶1000U/L、PPK酶300U/L、ADK酶300U/L以及AK酶500U/L开始反应,所添加酶均为粗酶液。反应期间控制pH值为7.4,温度为40℃。
反应6小时后,高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量为30g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
(2)在过滤器中分离酶:
通过超滤方法,将步骤(1)的反应液经过过滤器分离混合酶,过滤器内装膜包(购于Pall公司,截留分子量20kDa),滤出液为分离出酶之后的反应液。
(3)分离产物GSH和其它物质:
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0,在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂,溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附,穿出液中主要含有ATP、ADP以及AMP。
使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH,GSH产量2.7kg,收率90%。
(4)反应罐中生成GSH的连续反应,即步骤(1)的连续反应:
将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐,并添加原酶量5-10%的新酶进行反应。将步骤(3)中离子交换穿出液加入至反应罐配制溶液,反应液配制方法同上述步骤(1),腺苷加入量减少至0.03kg。
在40℃、pH为7.4的条件下进行生成GSH的连续反应;6小时后,HPLC检测GSH的生成量为30g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。在该步骤中,酶被循环利用,上一循环生成的ATP等副产物被循环利用。
实施例4使用固定酶制备GSH
图3为本发明方法使用固定酶制备GSH的工艺流程图。如图3所示,根据本发明制备GSH的工艺流程图使用固定酶按照如下步骤制备GSH:
(1)酶的固定
催化用GshF酶、ADK酶、PAP酶以及AK酶以商业化的含氨基合成高聚物载体LX1000HA固定。
将上述实施例1中所述粗酶GshF酶4000U/L在恒温搅拌反应罐中加入LX1000HA湿载体2kg,在20℃条件下,150rpm搅拌12小时。过滤收集载体,用0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0)清洗2遍,即得固定化GshF酶。
将1000U/L ADK酶、1200U PAP酶以及3000U/L AK酶以同样方式分别固定于LX1000HA载体。
(2)在反应柱中生成谷胱甘肽GSH:
配制反应液,每100L含有底物2.5kg谷氨酸、2.5kg半胱氨酸和2.0kg甘氨酸、0.3kg腺苷,以及2.2kg多聚磷酸钠、0.3kg氯化铵、0.6kg六水氯化镁、0.1kg一水氯化锰和0.6kg磷酸二氢钾的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.3,温度升为42-45℃。
将步骤(1)中的固定酶20kg装入反应柱设备,排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱,反应期间控制温度为42-45℃。反应6小时后,收集反应液,高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量为33g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
(3)分离产物GSH和其它物质:
使用盐酸调节反应液的pH值至3.0,在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂,溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附,穿出液中主要含有ATP、ADP以及AMP。收集穿出液,用以生产ATP或进一步纯化为纯品ATP、ADP及AMP。
使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH,GSH产量3.0kg,收率90%。
(3)反应柱生成GSH的连续反应,即步骤(2)的连续反应:
配制步骤(2)中所述相同反应液,连续以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱,反应期间控制温度为42-45℃。
反应6小时后,HPLC检测GSH的生成量为33g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。在该步骤中,酶被循环利用。
固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上,酶活性降低10%,需按比例补加或更换部分新酶。
实施例5使用固定酶制备GSH
如图3所示,根据本发明制备GSH的工艺流程图使用固定酶按照如下步骤制备GSH:
(1)酶的固定
催化用GshF酶、PPK酶、PAP酶以及AK酶以商业化的环氧基固定化载体LX1000EP固定。
将上述实施例1中所述粗酶GshF酶8000U/L、PPK酶2000U/L、PAP酶2000U/L和AK酶5000U/L混合配成混合酶液。在恒温搅拌反应罐中加入LX1000EP湿载体与上述酶液按照固定化载体与酶质量比为30:1混合,在20℃条件下,150rpm搅拌12小时。过滤收集载体,用0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0)清洗2遍,即得固定化混合酶。
(2)在反应柱中生成谷胱甘肽GSH:
配制反应液,每100L含有底物3.5kg谷氨酸、3.2kg半胱氨酸和3.3kg甘氨酸、0.5kg腺苷,以及3.0kg六偏磷酸钠、0.3kg氯化钠、0.8kg六水氯化镁和0.6kg磷酸二氢钾的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.5,温度升为37-40℃。
将步骤(1)中的混合固定酶20kg装入反应柱设备,排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱,反应期间控制温度为37-40℃。反应6小时后,收集反应液,高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量为40g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
(3)分离产物GSH和其它物质:
使用盐酸调节反应液的pH值至3.0,在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂,溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附,穿出液中主要含有ATP、ADP以及AMP。收集穿出液,用以生产ATP或进一步纯化为纯品ATP、ADP及AMP。
使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH,GSH产量3.5kg,收率85%。
(3)反应柱生成GSH的连续反应,即步骤(2)的连续反应:
配制步骤(2)中所述相同反应液,连续以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱,反应期间控制温度为37-40℃。
反应6小时后,HPLC检测GSH的生成量为40g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。在该步骤中,酶被循环利用。
固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上,酶活性降低10%,需按比例补加或更换部分新酶。
实施例6
如图2所示,根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备GSH:
(1)在反应罐中生成GSH:
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物0.1kg谷氨酸、0.1kg半胱氨酸和0.05kg甘氨酸、0.001kg腺苷,以及0.47kg四聚磷酸、0.066kg硫酸铵、0.074kg氯化钾、0.2kg六水氯化镁和0.12kg Tris的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至10.0,在反应体系中添加GshF酶0.01U/L、PPK酶0.01U/L、ADK酶0.01U/L、PAP酶0.01U/L以及AK酶0.01U/L开始反应,所添加酶均为粗酶液。反应期间控制pH值为10.0,温度为25℃。
反应8小时后,高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量为0.6g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
(2)在过滤器中分离酶:
通过超滤方法,将步骤(1)的反应液经过过滤器分离混合酶,过滤器内装膜包(购于Pall公司,截留分子量20kDa),滤出液为分离出酶之后的反应液。
(3)分离产物GSH和其它物质:
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0,在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂,溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附,穿出液中主要含有ATP、ADP以及AMP。收集穿出液,用以生产ATP或进一步纯化为纯品ATP、ADP及AMP。
使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH,GSH产量0.05kg,收率90%。
(4)反应罐中生成GSH的连续反应,即步骤(1)的连续反应:
将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐,并添加原酶量30-50%的新酶进行反应。反应液配制方法同上述步骤(1)。
在25℃、pH为10.0的条件下进行生成GSH的连续反应;8小时后,HPLC检测GSH的生成量为0.6g/L。
HPLC检测条件同上述步骤(1)。在该步骤中,酶被循环利用。
实施例7
如图2所示,根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备GSH:
(1)在反应罐中生成GSH:
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物8.0kg谷氨酸、5.0kg半胱氨酸和7.5kg甘氨酸、2.0kg腺苷,以及14.1kg四聚磷酸、2.93kg氯化钠、4.07kg六水氯化镁和1.75kg磷酸氢二钾的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至5.0,在反应体系中添加GshF酶5000U/L、PPK酶2500U/L、ADK酶2500U/L、PAP酶2500U/L以及AK酶4000U/L开始反应,所添加酶均为粗酶液。反应期间控制pH值为5.0,温度为50℃。
反应8小时后,高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量为29g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
(2)在过滤器中分离酶:
通过超滤方法,将步骤(1)的反应液经过过滤器分离混合酶,过滤器内装膜包(购于Pall公司,截留分子量20kDa),滤出液为分离出酶之后的反应液。
(3)分离产物GSH和其它物质:
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0,在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂,溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附,穿出液中主要含有ATP、ADP以及AMP。收集穿出液,用以生产ATP或进一步纯化为纯品ATP、ADP及AMP。
使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH,GSH产量2.6kg,收率90%。
(4)反应罐中生成GSH的连续反应,即步骤(1)的连续反应:
将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐,并添加原酶量15-30%的新酶进行反应。反应液配制方法同上述步骤(1)。
在50℃、pH为5.0的条件下进行生成GSH的连续反应;8小时后,HPLC检测GSH的生成量为29g/L。HPLC检测条件同上述步骤(1)。在该步骤中,酶被循环利用。
实施例8
如图3所示,根据本发明制备GSH的工艺流程图使用固定酶按照如下步骤制备GSH:
(1)酶的固定
催化用GshF酶、PPK酶、ADK酶、PAP酶以及AK酶以商业化的含氨基合成高聚物载体LX1000HA固定。
将上述实施例1中所述粗酶GshF酶10000U/L在恒温搅拌反应罐中加入LX1000HA湿载体2kg,在20℃条件下,150rpm搅拌12小时。过滤收集载体,用0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0)清洗2遍,即得固定化GshF酶。将5000U/L PPK酶、5000U/L ADK酶、5000U PAP酶以及8000U/L AK酶以同样方式分别固定于LX1000HA载体。
(2)在反应柱中生成谷胱甘肽GSH:
配制反应液,每100L含有底物5.0kg谷氨酸、2.0kg半胱氨酸和3.0kg甘氨酸、2.0kg腺苷,以及3.0kg六偏磷酸钠、3.73kg氯化钾、2.16kg一水氯化锰、和1.56kg二水磷酸二氢钠的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至6.0,温度升为55℃。
将步骤(1)中的固定酶20kg装入反应柱设备,排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱,反应期间控制温度为55℃。反应6小时后,收集反应液,高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量为28g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
(3)分离产物GSH和其它物质:
使用盐酸调节反应液的pH值至3.0,在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂,溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附,穿出液中主要含有ATP、ADP以及AMP。收集穿出液,用以生产ATP或进一步纯化为纯品ATP、ADP及AMP。
使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH,GSH产量2.6kg,收率90%。
(3)反应柱生成GSH的连续反应,即步骤(2)的连续反应:
配制步骤(2)中所述相同反应液,连续以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱,反应期间控制温度为55℃。
反应6小时后,HPLC检测GSH的生成量为28g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。在该步骤中,酶被循环利用。
固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上,酶活性降低40%,需按比例补加或更换部分新酶。
对比例1
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物2.5kg谷氨酸、2.5kg半胱氨酸和1.5kg甘氨酸、16.0kg ATP,以及0.2kg硫酸铵、0.3kg氯化钠、0.5kg六水氯化镁、0.1kg一水氯化锰和0.5kg磷酸氢二钠的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.0,在反应体系中添加GshF酶800U/L开始反应,所添加酶为粗酶液。反应期间控制pH值为7.0,温度为37℃。
图5为对比例1的HPLC图谱。如图5所示,在反应5小时后,高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量为32g/L,90%左右ATP耗尽,转化为ADP及AMP。图中未标出峰为氨基酸。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
从结果可以看出:对比例1中没有偶联ATP再生酶和AK酶,需使用大量ATP进行反应。且相同时间内GSH生成量降低,原料成本是本专利的百倍以上。
与对比例1比较,本专利添加ATP再生酶与AK酶,使用少量腺苷代替大量ATP作为能量供体,为工业生产节约了大量成本。反应中生成的副产物或循环利用;或分离纯化为纯品,操作简单;或用于生产ATP,均非常适于大规模连续生产。
虽然本发明已以实施例公开如上,然其并非用于限定本发明,任何本领域技术人员,在不脱离本发明的精神和范围内,均可作各种不同的选择和修改,因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (1)
1.一种酶法制备谷胱甘肽的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)在反应罐中生成GSH:
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物2.5kg谷氨酸、2.5kg半胱氨酸和1.5kg甘氨酸、0.3kg腺苷,以及2.5kg六偏磷酸钠、0.2kg硫酸铵、0.3kg氯化钠、0.5kg六水氯化镁、0.1kg一水氯化锰和0.5kg磷酸氢二钠的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀;调节pH值至7.0,在反应体系中添加GshF酶800U/L、PPK酶500U/L、ADK酶500U/L、PAP酶200U/L以及AK酶600U/L开始反应,所添加酶均为粗酶液;反应期间控制pH值为7.0,温度为37℃;在反应5小时后,高效液相色谱检测谷胱甘肽的生成量;
(2)在过滤器中分离酶:
通过超滤方法,将步骤(1)的反应液经过过滤器分离混合酶,过滤器内装膜包,滤出液为分离出酶之后的反应液;
(3)分离产物GSH和其它物质:
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0,在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂,溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附,穿出液中主要含有ATP、ADP以及AMP;收集穿出液,用以生产ATP或进一步纯化为纯品ATP、ADP及AMP;
使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH;
(4)反应罐中生成GSH的连续反应,即步骤(1)的连续反应:
将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐,并添加原酶量5-10%的新酶进行反应,反应液配制方法同上述步骤(1);
在37℃、pH为7.0的条件下进行生成GSH的连续反应;
HPLC检测条件同上述步骤(1),在该步骤中,酶被循环利用。
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