JPWO2016017631A1

JPWO2016017631A1 - γ−グルタミルシステイン及びグルタチオンの製造方法

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Publication number: JPWO2016017631A1
Application number: JP2016538361A
Authority: JP
Inventors: 増俊野尻; 八十原　良彦; 良彦八十原
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2017-04-27
Also published as: US20170211117A1; CN106536744A; WO2016017631A1

Abstract

本発明は、グルタチオン及びその前駆体であるγ−グルタミルシステインを高収率で製造する方法を提供することを解決課題とする。本発明のグルタチオンの製造方法は、上記課題を解決する手段として、低酸素雰囲気下でＬ−システインとＬ−グルタミン酸とを反応させてγ−グルタミルシステインを生成する工程Ａ’と、低酸素雰囲気下でγ−グルタミルシステインとグリシンとを反応させてグルタチオンを生成する工程Ｂ’とを含む。

Description

本発明はγ−グルタミルシステインを製造する方法に関する。

本発明はまたグルタチオンを製造する方法に関する。

グルタチオンは、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物など多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸代謝など、生体にとって重要な化合物である。

グルタチオンは生体内で、Ｌ−システイン残基のチオール基が還元されたＳＨの形態である還元型のグルタチオン（Ｎ−（Ｎ−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル）グリシン、以下「ＧＳＨ」と称することがある）と、Ｌ−システイン残基のチオール基が酸化されグルタチオン２分子間でジスルフィド結合を形成した形態である酸化型グルタチオン（以下「ＧＳＳＧ」と称することがある）とのいずれかの形態で存在する。

グルタチオンの製造方法としてはサッカロマイセス・セレビジエやキャンディダ・ユーティリスを用いた発酵法（非特許文献１）、及びＬ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシン及び界面活性剤や有機溶媒の存在下、γ−グルタミルシステイン合成酵素やグルタチオン合成酵素を組換え生産させたエシェリヒア・コリやサッカロマイセス・セレビジエの菌体を酵素源として用いる酵素法（特許文献１、２）（非特許文献１、２）等が一般的である。

特開昭６０−２７３９６号公報特開昭６０−２７３９７号公報

Appl. Microbial. Biotechnol., 66, 233 (2004) Appl. Environ. Microbial., 44, 1444 (1982)

本発明者らは、大気雰囲気下において、酵素を用いてＬ−システインとＬ−グルタミン酸とからγ−グルタミルシステインを製造する工程を行う場合に、γ−グルタミルシステインだけでなく、副生成物として、Ｌ−システイン残基のチオール基が酸化されて２分子のγ−グルタミルシステインがジスルフィド結合を介して結合してなる化合物である酸化型γ−グルタミルシステインが相当量生じ、γ−グルタミルシステインの収率が低下するという課題があることを見出した。

更に本発明者らは、大気雰囲気下において、酵素を用いてγ−グルタミルシステインとグリシンとからグルタチオンを合成する工程を行う場合に、還元型であるグルタチオンだけでなく、副生成物として酸化型グルタチオンが相当量生じ、グルタチオンの収率が低下するという課題があることを見出した。

反応を酵素を用いて行わない場合にも同様の課題があると考えられる。

本発明は、酸化型γ−グルタミルシステインの副生成が抑制された、γ−グルタミルシステインの製造方法を提供することを解決すべき課題とする。また本発明は、酸化型グルタチオンの副生成が抑制された、グルタチオンの製造方法を提供することを解決すべき課題とする。

なお、本発明において「グルタチオン」又は「ＧＳＨ」は専ら「還元型グルタチオン」を意味し、酸化型のグルタチオンは「酸化型グルタチオン」又は「ＧＳＳＧ」と表現する。また本発明において「γ−グルタミルシステイン」は専ら「還元型γ−グルタミルシステイン」を意味し、２分子のγ−グルタミルシステインが酸化して−Ｓ−Ｓ−結合により結合した化合物は「酸化型γ−グルタミルシステイン」と表現する。

本明細書では上記課題を解決するための手段として、以下の発明を開示する。
（１）Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、γ−グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ，アデノシン５’−三リン酸ともいう）の存在下での作用により反応させて、γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａを含むことを特徴とする、γ−グルタミルシステインの製造方法。

当該（１）の方法では、副生物である酸化型γ−グルタミルシステインの生成が抑制され、γ−グルタミルシステインを高効率で製造することができる。

（２）前記工程Ａが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ，アデノシン５’−二リン酸ともいう）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、（１）に記載の方法。

当該（２）の方法では、工程Ａで消費されるＡＴＰを再生できＡＴＰの添加量を低減することができる。

（３）前記γ−グルタミルシステイン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）由来である、（１）又は（２）に記載の方法。

当該（３）の方法で用いられるγ−グルタミルシステイン合成酵素は、Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸からγ−グルタミルシステインを生成する活性が特に高いため好ましい。

（４）前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、（１）又は（２）に記載の方法。

当該（４）の方法で用いられる２機能性グルタチオン合成酵素は、Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸からγ−グルタミルシステインを生成する活性が特に高いため好ましい。

（５）γ−グルタミルシステインとグリシンとを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、グルタチオン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、グルタチオンを生成する工程Ｂを含むことを特徴とする、グルタチオンの製造方法。

当該（５）の方法では、副生物である酸化型グルタチオンの生成が抑制され、グルタチオンを高効率で製造することができる。

（６）前記工程Ｂが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、（５）に記載の方法。

当該（６）の方法では、工程Bで消費されるＡＴＰを再生できＡＴＰの添加量を低減することができる。

（７）前記グルタチオン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）由来である、（５）又は（６）に記載の方法。

当該（７）の方法で用いられるグルタチオン合成酵素は、γ−グルタミルシステインとグリシンとからグルタチオンを生成する活性が特に高いため好ましい。

（８）前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、（５）又は（６）に記載の方法。

当該（８）の方法で用いられる２機能性グルタチオン合成酵素は、γ−グルタミルシステインとグリシンとからグルタチオンを生成する活性が特に高いため好ましい。

（９）Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、γ−グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａを更に含み、
前記工程Ｂに用いられるγ−グルタミルシステインが、前記工程Ａにより生成されたものである、
（５）〜（８）のいずれかに記載の方法。

当該（９）の方法によれば、Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸とから、副生成物である酸化型γ−グルタミルシステイン及び酸化型グルタチオンの生成量が少なく効率よくグルタチオンを製造することができる。

（１０）前記工程Ａが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、（９）に記載の方法。

当該（１０）の方法によれば、工程Ａで消費されるＡＴＰを再生できＡＴＰの添加量を低減することができる。

（１１）前記γ−グルタミルシステイン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）由来である、（９）又は（１０）に記載の方法。

当該（１１）の方法に用いられるγ−グルタミルシステイン合成酵素は、Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸からγ−グルタミルシステインを生成する活性が特に高いため好ましい。

（１２）前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、（９）又は（１０）に記載の方法。

当該（１２）の方法に用いられる２機能性グルタチオン合成酵素は、Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸からγ−グルタミルシステインを生成する活性が特に高いため好ましい。

（１３）Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を含むことを特徴とする、γ−グルタミルシステインの製造方法。

当該（１３）の方法では、副生物である酸化型γ−グルタミルシステインの生成が抑制され、γ−グルタミルシステインを高効率で製造することができる。本方法では、より好ましくは前記工程Ａ’が（１）に記載の前記工程Ａである。

（１４）γ−グルタミルシステインとグリシンとを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、グルタチオンを生成する工程Ｂ’を含むことを特徴とする、グルタチオンの製造方法。

当該（１４）の方法では、副生物である酸化型グルタチオンの生成が抑制され、グルタチオンを高効率で製造することができる。本方法では、より好ましくは前記工程Ｂ’が（５）に記載の前記工程Ｂである。

（１５）Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を更に含み、
前記工程Ｂ’に用いられるγ−グルタミルシステインが、前記工程Ａ’により生成されたものである、（１４）に記載の方法。

当該（１５）の方法では、副生物である酸化型γ−グルタミルシステイン及び酸化型グルタチオンの生成が抑制され、グルタチオンを高効率で製造することができる。本方法では、より好ましくは前記工程Ａ’が（１）に記載の前記工程Ａである。

なお、本明細書において「Ｌ−システイン」、「Ｌ−グルタミン酸」、「グリシン」「γ−グルタミルシステイン」、「グルタチオン」、「Ｌ−シスチン」、「酸化型γ−グルタミルシステイン」、「酸化型グルタチオン」、「アデノシン三リン酸」、「アデノシン二リン酸」、「アデノシン一リン酸」、「縮合リン酸」、「ポリリン酸」等の各用語は、それぞれ、各化合物の形態を限定するものではなく、フリー体の形態であってもよいし、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩の形態や、水和物等の溶媒和物の形態や、電離したイオンの形態である場合も包含する。

本発明において大気とは地上の大気、すなわち空気を指す。

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１４−１５４０２６号の開示内容を包含する。

本発明は、酸化型γ−グルタミルシステインの副生成が抑制された、γ−グルタミルシステインの製造方法を提供する。本発明はまた、酸化型グルタチオンの副生成が抑制された、グルタチオンの製造方法を提供する。

＜本発明で用いる酵素＞
本明細書では、γ−グルタミルシステイン合成酵素を「ＧＳＨＩ」、グルタチオン合成酵素を「ＧＳＨＩＩ」、２機能性グルタチオン合成酵素を「ＧＳＨＦ」、アデニル酸キナーゼを「ＡＤＫ」、ポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼを「ＰＡＰ」とそれぞれ略記する場合がある。

＜ＧＳＨＩ＞
本発明に用いられるγ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）は、ＡＴＰの存在下でＬ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）を基質として認識し、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）と結合させることでγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性を、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのγ−グルタミルシステインを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。

（測定条件）
１０ｍＭＡＴＰ、１５ｍＭＬ−グルタミン酸、１５ｍＭＬ−システイン、１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のγ−グルタミルシステインを定量する。

上記高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。この条件では、グルタチオン（ＧＳＨ）、γ−グルタミルシステイン（γ−ＧＣ）、酸化型γ−ＧＣ、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の順で溶出する。

［ＨＰＬＣ条件］
カラム：ＯＤＳ−ＨＧ−３（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、野村化学社製）；
溶離液：リン酸２水素カリウム１２．２ｇ及びヘプタンスルホン酸ナトリウム３．６ｇを蒸留水１．８Ｌで溶解した後、該溶液をリン酸でｐＨ２．８に調整し、メタノール１８６ｍｌを追加して溶解した液；
流速：１．０ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
測定波長：２１０ｎｍ

ＧＳＨＩとしてはタンパク質１ｍｇあたりのγ−グルタミルシステイン合成酵素活性（比活性）が０．５Ｕ以上のものを使用することが好ましい。

ＧＳＨＩの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨＩが好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌等の細菌、酵母等の真核微生物等に由来するＧＳＨＩが好ましい。

エシェリヒア・コリ由来のＧＳＨＩの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１及び配列番号９に示す。

ＧＳＨＩとしてはまた、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨＩに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＧＳＨＩ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＧＳＨＩ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨＩを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＧＳＨＩ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号９に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号９に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示すアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＧＳＨＩ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは２５０以上、より好ましくは３００以上、より好ましくは４００以上、より好ましくは５００以上のポリペプチドを用いることができる。本明細書において「複数個」とは、例えば、２〜２０個、２〜１５個、２〜１０個、２〜７個、２〜５個、２〜４個又は２〜３個をいう。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号９に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。アミノ酸同一性は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質の検索システムを用いて算出することができる（Karlin，S．et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877；Altschul，S．F．et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410；Pearson，W．R．et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448）。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換をいう。性質の類似するアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）等に分類することができる。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。

ＧＳＨＩの調製に用いることができる、ＧＳＨＩをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列には限定されず、目的とするＧＳＨＩのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。

＜ＧＳＨＩＩ＞
本発明に用いられるグルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）は、ＡＴＰの存在下でγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓを基質として認識し、グリシン（Ｇｌｙ）と結合させることでγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性をグルタチオン合成酵素活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのグルタチオンを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。

（測定条件）
１０ｍＭＡＴＰ、１５ｍＭ γ−グルタミルシステイン、１５ｍＭグリシン、１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のグルタチオンを定量する。

高速液体クロマトグラフィーの条件は、ＧＳＨＩの活性測定法に関して上述したのと同じ条件を用いる。

ＧＳＨＩＩとしてはタンパク質１ｍｇあたりのグルタチオン合成酵素活性（比活性）が０．５Ｕ以上のものを使用することが好ましい。

ＧＳＨＩＩの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨＩＩが好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌等の細菌、酵母等の真核微生物等に由来するＧＳＨＩＩが好ましい。

エシェリヒア・コリ由来のＧＳＨＩＩの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号４及び配列番号１０に示す。

ＧＳＨＩＩとしてはまた、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨＩＩに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＧＳＨＩＩ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＧＳＨＩＩ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨＩＩを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＧＳＨＩＩ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１０に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１０に示すアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＧＳＨＩＩ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは１５０以上、より好ましくは２００以上、より好ましくは３００以上のポリペプチドを用いることができる。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１０に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。ここで「複数個」の好適な範囲、アミノ酸同一性の算出方法、保存的アミノ酸置換についてはＧＳＨＩに関して説明した通りである。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。

ＧＳＨＩＩの調製に用いることができる、ＧＳＨＩＩをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号４に示す塩基配列には限定されず、目的とするＧＳＨＩＩのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。

＜ＧＳＨＦ＞
本発明に用いられる２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＦ）は、ＡＴＰ存在下でＬ−Ｃｙｓを基質として認識し、Ｌ−Ｇｌｕと結合させることでγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓを生成する反応を触媒する活性及びＡＴＰ存在下でγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓを基質として認識し、Ｇｌｙと結合させることでγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙを生成する反応を触媒する活性を併せ持つ酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性を、２機能性グルタチオン合成酵素活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）を生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。

（測定条件）
１０ｍＭＡＴＰ、１５ｍＭＬ−グルタミン酸、１５ｍＭＬ−システイン、１５ｍＭグリシン、１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のグルタチオンを定量する。

ＧＳＨＦとしてはタンパク質１ｍｇあたりの２機能性グルタチオン合成酵素活性（比活性）が０．５Ｕ以上のものを使用することが好ましい。

ＧＳＨＦの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨＦが好ましい。特に細菌由来ＧＳＨＦが好ましく、具体的には、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｕｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌；ラクトバシルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）等のラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌；デスルフォタレア・サイクロフィラ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）等のデスルフォタレア（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ）属細菌；クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）等のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌；リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等のリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ）等のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌；パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）等のパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属細菌；マンハイミア・スクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｅｃｅｎｓ）等のマンハイミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌；及び、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｓｏｍｎｕｓ）等のヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌からなる群から選択される少なくとも１種に由来するＧＳＨＦが好ましい。

ストレプトコッカス・アガラクチエ由来のＧＳＨＦの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示す。また、配列番号７の第４塩基〜第２２５３塩基からなる塩基配列は、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるストレプトコッカス・アガラクチエ由来ＧＳＨＦをコードする塩基配列であって、大腸菌でのコドン使用頻度に適合させた塩基配列の例である。

ＧＳＨＦとしてはまた、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨＦに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＧＳＨＦ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＧＳＨＦ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨＦを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＧＳＨＦ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号１２に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１２に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１２に示すアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＧＳＨＦ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは４００以上、より好ましくは５００以上、より好ましくは６００以上、より好ましくは７００以上、より好ましくは７３０以上のポリペプチドを用いることができる。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１２に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。ここで「複数個」の好適な範囲、アミノ酸同一性の算出方法、保存的アミノ酸置換についてはＧＳＨＩに関して説明した通りである。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。

ＧＳＨＦの調製に用いることができる、ＧＳＨＦをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号１１に示す塩基配列には限定されず、目的とするＧＳＨＦのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。

＜ＡＤＫ＞
本発明に用いられるアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）は、２分子のＡＤＰからＡＴＰ、ＡＭＰを１分子ずつ生成する反応を触媒する活性を有する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性をＡＤＫ活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのＡＭＰを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。

（測定条件）
１０ｍＭＡＤＰ、７０ｍＭ硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のＡＭＰを定量した。

上記高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。この条件ではアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン一リン酸（５’−アデニル酸）（ＡＭＰ）の順で溶出する。

ＡＤＫとしてはタンパク質１ｍｇあたりのＡＤＫ活性（比活性）が２０Ｕ以上のものを使用することが好ましい。

ＡＤＫの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来ＡＤＫが好ましい。特に細菌由来ＡＤＫが好ましく、具体的には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）由来ＡＤＫが好ましい。

エシェリヒア・コリ由来のＡＤＫの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示す。

ＡＤＫとしてはまた、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるＡＤＫに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＡＤＫ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＡＤＫ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるＡＤＫを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＡＤＫ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号１４に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１４に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１４に示すアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＡＤＫ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは１００以上、より好ましくは１５０以上、より好ましくは２００以上のポリペプチドを用いることができる。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１４に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。ここで「複数個」の好適な範囲、アミノ酸同一性の算出方法、保存的アミノ酸置換についてはＧＳＨＩに関して説明した通りである。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。

ＡＤＫの調製に用いることができる、ＡＤＫをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号１３に示す塩基配列には限定されず、目的とするＡＤＫのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。

＜ＰＡＰ＞
本発明に用いられるポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）は、ポリリン酸をリン酸ドナーとしてＡＭＰをリン酸化してＡＤＰを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性をＰＡＰ活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのＡＤＰを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。

（測定条件）
５ｍＭメタリン酸ナトリウム、１０ｍＭＡＭＰ、７０ｍＭ硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のＡＤＰを定量した。

高速液体クロマトグラフィーの条件は、ＡＤＫの活性測定法に関して上述したのと同じ条件を用いる。

ＰＡＰとしてはタンパク質１ｍｇあたりのＰＡＰ活性（比活性）が２０Ｕ以上のものを使用することが好ましい。

ＰＡＰの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来ＰＡＰが好ましい。特に細菌由来ＰＡＰが好ましく、具体的にはアシネトバクター・ジョンソニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）由来ＰＡＰが好ましい。

アシネトバクター・ジョンソニ由来のＰＡＰの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６に示す。また、配列番号８の第４塩基〜第１４２８塩基からなる塩基配列は、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるアシネトバクター・ジョンソニ由来ＰＡＰをコードする塩基配列であって、大腸菌でのコドン使用頻度に適合させた塩基配列の例である。

ＰＡＰとしてはまた、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるＰＡＰに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＰＡＰ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＰＡＰ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるＰＡＰを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＰＡＰ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号１６に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１６に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１６に示すアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＰＡＰ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは２５０以上、より好ましくは３００以上、より好ましくは４００以上、より好ましくは４５０以上のポリペプチドを用いることができる。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１６に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。ここで「複数個」の好適な範囲、アミノ酸同一性の算出方法、保存的アミノ酸置換についてはＧＳＨＩに関して説明した通りである。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。

ＰＡＰの調製に用いることができる、ＰＡＰをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号１５に示す塩基配列には限定されず、目的とするＰＡＰのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。

＜酵素の調製＞
本発明で用いる上記の各酵素を取得する方法は特に限定されない。上記各酵素は該酵素の活性を有する生物、例えば微生物の野生株又は変異株から調製することができる。目的とする酵素の活性を有する生物としては、本来的に該酵素の活性を有する生物と、該酵素の活性が増強された生物とのどちらでもよい。酵素の活性が増強された生物としては、遺伝子工学の手法により上記各酵素をコードする遺伝子の発現が増強された組換え生物細胞が挙げられる。なお「酵素の活性が増強された生物」とは、本来的に該酵素の活性を有する生物において該酵素の活性が増大された生物と、本来的には該酵素の活性を有さない生物において該酵素の活性が付与された生物との両方を包含する。

遺伝子工学の手法を用いて得られる組換え生物細胞とは、典型的には、目的の酵素をコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を適当なベクターに挿入して組換えベクターとし、該組換えベクターにより適当な宿主生物細胞を形質転換して得られる、該酵素を生産する能力を有する組換え生物細胞である。該組換え生物細胞を培養することにより目的とする上記各酵素を製造することができる。宿主生物細胞としては細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率の観点から細菌が好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）が好ましい。

＜工程Ａ及び工程Ａ’＞
本発明によるγ−グルタミルシステインの製造方法は、Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）及び２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＦ）からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａを含むことを特徴とする。工程Ａは、前記酵素とＡＴＰとの存在下でＬ−システインとＬ−グルタミン酸とを反応させてγ−グルタミルシステインを生成する工程であり、前記酵素が作用し上記反応を触媒する際にはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が消費される。

本発明によるγ−グルタミルシステインの製造方法はまた、Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を含むことを特徴とする。工程Ａ’は酵素反応により行ってもよいし、酵素を用いず化学的な反応により行ってもよいが、好ましくは酵素反応により行う工程であり、特に好ましくは前記工程Ａである。酵素反応によれば基質化合物の官能基による保護等が不要であることや、反応の特異性が高いことなどの理由で化学的合成反応よりも有利である。

酵素を用いない化学的な反応による工程Ａ’としては、特に限定されないが、例えば、カルボキシル基を適当な保護基で保護したＬ−システインと、α−カルボキシル基及びアミノ基を適当な保護基で保護したＬ−グルタミン酸とを反応させて、Ｌ−システイン１分子中のアミノ基に対し１分子のＬ−グルタミン酸のγ−カルボキシル基を脱水縮合させてペプチド結合を形成する工程が挙げられる。該工程では脱水縮合反応後に必要に応じて保護基の１つ以上を脱保護する。カルボキシル基に対する保護基としてはベンジル基等の公知のカルボキシル基用保護基が使用でき、アミノ基に対する保護基としてはｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基等の公知のアミノ基用保護基が使用できる。

工程ＡにおいてＧＳＨＩ及び／又はＧＳＨＦは、ＧＳＨＩ及び／又はＧＳＨＦ活性を有する生物の細胞を生細胞のまま用いてもよいし、死滅しているが損傷していない前記細胞の形態で用いてもよいし、ＧＳＨＩ及び／又はＧＳＨＦが細胞外に存在する形態、具体的には、前記生物の細胞の破砕物の形態で用いてもよいし、前記細胞から分離され、必要に応じて適宜精製されたタンパク質の形態で用いてもよい。ここでＧＳＨＩ及び／又はＧＳＨＦ活性を有するタンパク質の精製の程度は特に限定されず、粗精製であってもよい。

工程Ａで用いる酵素としては、好ましくは、ＧＳＨＩ及び／又はＧＳＨＦ活性を有する生細胞を用いず、より好ましくは、ＧＳＨＩ及び／又はＧＳＨＦ活性を有する生細胞及び損傷していない死滅細胞を用いない。工程Ａで用いる酵素としては特に、細胞外に存在するＧＳＨＩ及び／又はＧＳＨＦ、具体的には、前記細胞の破砕物の形態のＧＳＨＩ及び／又はＧＳＨＦ、又は、前記細胞から分離されたタンパク質の形態のＧＳＨＩ及び／又はＧＳＨＦを用いることが好ましい。ＧＳＨＩ及び／又はＧＳＨＦを、当該活性を有する生細胞の形態で工程Ａに用いる場合は反応系中でアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）が分解され易い（実施例４参照）。ＡＭＰは後述するＡＴＰ再生反応の中間体の１つであるため、ＡＭＰが分解されると、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることが難しい。一方、ＧＳＨＩ及び／又はＧＳＨＦを、細胞外に存在する形態で工程Ａに用いる場合はＡＭＰの分解が生じ難く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることができるため好ましい。なお、生細胞を用いずに工程Ａの反応を行う場合、生細胞による還元作用が存在しないために、酸素を多く含む雰囲気下においては酸化が進み易く酸化型γ−グルタミルシステインが生じやすいという問題があるが、本発明では工程Ａの反応を大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で行うことによって、γ−グルタミルシステインの酸化を抑制し、還元型のγ−グルタミルシステインを高収率で得ることが可能となる。すなわち、ＧＳＨＩ及び／又はＧＳＨＦを、細胞外に存在する形態、具体的には、当該活性を有する細胞の破砕物の形態、又は、当該細胞から分離されたタンパク質の形態で用いて本発明の工程Ａを行うことにより、ＡＭＰの分解抑制とγ−グルタミルシステインの酸化抑制を両立させることが可能となる。

本明細書において細胞の「破砕」とは、細胞内で形成された酵素が細胞外からアクセス可能な程度に細胞の表面構造に損傷を与える処理を指し、必ずしも細胞が断片化される必要はない。本明細書において細胞の「破砕物」は、破砕処理された細胞の処理物を指す。細胞の破砕処理は、１つ又は複数の破砕処理を適当な順序で行うことにより実施できる。細胞の破砕処理としては、物理的処理、化学的処理、酵素的処理等を挙げることができる。物理的処理としては、例えば、高圧ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー、フレンチプレス、ボールミル等の使用、或いは、これらの組み合わせを挙げることができる。上記化学的処理としては、例えば、塩酸、硫酸等の酸（好ましくは強酸）を用いる処理、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等の塩基（好ましくは強塩基）を用いる処理等や、これらの組み合わせを挙げることができる。上記酵素的処理としては、例えば、リゾチーム、ザイモリアーゼ、グルカナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ等を用いる方法や、これらの組み合わせを挙げることができる。

工程ＡにおいてＬ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、工程Ａ’においてＬ−システイン、Ｌ−グルタミン酸はそれぞれ塩の形態、フリー体の形態、水和物等の溶媒和物等の各種の形態で反応系中に添加することができる。

工程Ａ及び／又は工程Ａ’において原料として用いるＬ−システインは、Ｌ−シスチンを実質的に含まないものが好ましく、具体的には、Ｌ−シスチンとＬ−システインとの総モル量に対してＬ−システインが７０モル％以上、より好ましくは８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、更に好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９８モル％以上、最も好ましくは１００モル％のＬ−システインを用いる。Ｌ−システインとＬ−シスチンとの総モル量に対するＬ−システインの割合が前記範囲内であるという要件は、少なくとも工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応開始時において満足されることが好ましく、工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応開始時から反応後までの期間に満足されることがより好ましい。

工程Ａ及び／又は工程Ａ’では反応を「大気よりも酸素濃度が低い雰囲気」下において行うことを特徴とする。当該雰囲気としては、酸素濃度１０体積％以下の雰囲気が好ましく、更に好ましくは５体積％以下の雰囲気である。下限は特に限定されるものではなく、酸素濃度が０体積％でもよい。「大気よりも酸素濃度が低い雰囲気」としては不活性ガスの雰囲気が例示できる。不活性ガスとしては、酸素が含まれていなければ特にガスは限定しないが、窒素、希ガス（アルゴン等）、二酸化炭素ガス等の不活性ガスの雰囲気が好ましい。ここで不活性ガスに酸素が含まれていないとは、実質的に酸素が含まれていないことも包含する。気相が前記不活性ガスにより置換された反応容器中で反応を行うことで、上記酸素濃度の雰囲気下での反応を実現することができる。「気相が前記不活性ガスにより置換された反応容器中で反応を行う」は、必要に応じて前記不活性ガスの流通下で反応を行うことも包含する。なお、雰囲気圧は特に限定されないが、通常は常圧付近、典型的には０．０８〜０．１２ＭＰａとすることができる。この雰囲気下でγ−グルタミルシステインの生成を行うと、酸化型γ−グルタミルシステインの副生が抑制され、効率的にγ−グルタミルシステインを製造することができる。工程Ａ及び／又は工程Ａ’での基質Ｌ−システインに対するγ−グルタミルシステインの収率は典型的には８０モル％以上、好ましくは８５モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、特に好ましくは９５モル％以上である。工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応後の反応系（例えば反応混合液）中には酸化型γ−グルタミルシステインは実質的に含まれず、具体的には、工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応後の反応系中には、γ−グルタミルシステインと酸化型γ−グルタミルシステインとの総モル量に対してγ−グルタミルシステインが８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、更に好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９７モル％以上、最も好ましくは１００モル％含まれる。

工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応は適当なｐＨに調整された水等の溶媒を含む反応混合液中で行うことができる。このときの条件としては特に限定されないが、基質濃度（Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸との合計濃度）は好ましくは約０．１〜９９重量％、より好ましくは１〜２０重量％とすることができる。反応開始時の基質中のＬ−システインとＬ−グルタミン酸との量比は、Ｌ−システイン１モルに対してＬ−グルタミン酸を１モル前後とすることができ、例えばＬ−システイン１モルに対してＬ−グルタミン酸を０．５〜２モル、好ましくは０．７〜１．３モルとすることができる。反応温度は好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜５０℃とすることができる。反応のｐＨは好ましくは４〜１１、より好ましくは６〜９とすることができる。反応時間は好ましくは１〜１２０時間、より好ましくは１〜７２時間とすることができる。

反応混合液中の各酵素の濃度は適宜調整することができ、例えば各酵素のタンパク質濃度として下限が１μｇ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが好ましくは１００ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で適宜調整することができる。工程ＡにＧＳＨＩが用いられる場合、工程Ａ反応混合液中のＧＳＨＩ活性は特に限定されないが下限は０．０５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は５０００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。工程ＡにＧＳＨＦが用いられる場合、工程Ａ反応混合液中のＧＳＨＦ活性は特に限定されないが下限は０．０５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は５０００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。

反応混合液中のＡＴＰの濃度は、基質であるＬ−システインの濃度やＡＴＰ再生系の有無に応じて適宜調整することができる。工程Ａにおいて、ＡＴＰはＬ−システインに対し等モル量消費される。工程ＡをＡＴＰ再生反応と共役させて実施する場合は、Ｌ−システインに対するＡＴＰの添加量を大幅に低減することができる。そこで、工程Ａにおける反応混合液中のＡＴＰ濃度の上限は特に限定されないが、Ｌ−システイン濃度に対してモル濃度比で２倍以下が好ましく、１．２倍以下がより好ましい。また、工程Ａにおける反応混合液中のＡＴＰ濃度の下限は特に限定されないが、Ｌ−システイン濃度に対してモル濃度比で０．０００１倍以上が好ましく、０．００１倍以上がより好ましく、０．０１倍以上が更に好ましい。

＜工程Ｂ及び工程Ｂ’＞
本発明によるグルタチオン（ＧＳＨ）の製造方法は、γ−グルタミルシステインとグリシンとを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）及び２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＦ）からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、グルタチオンを生成する工程Ｂを含むことを特徴とする。工程Ｂは、前記酵素とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）との存在下でγ−グルタミルシステインとグリシンとを反応させてグルタチオンを生成する工程であり、前記酵素が作用し上記反応を触媒する際にはＡＴＰが消費される。

本発明によるグルタチオンの製造方法はまた、γ−グルタミルシステインとグリシンとを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、グルタチオンを生成する工程Ｂ’を含むことを特徴とする。工程Ｂ’は酵素反応により行ってもよいし、酵素を用いず化学的な反応により行ってもよいが、好ましくは酵素反応により行う工程であり、特に好ましくは前記工程Ｂである。酵素反応によれば基質化合物の官能基による保護等が不要であることや、反応の特異性が高いことなどの理由で化学的合成反応よりも有利である。

酵素を用いない化学的な反応による工程Ｂ’としては、特に限定されないが、例えば、Ｌ−グルタミン酸残基中のα−カルボキシル基及びアミノ基を適当な保護基で保護したγ−グルタミルシステインと、カルボキシル基を適当な保護基で保護したグリシンとを反応させて、γ−グルタミルシステイン１分子中のカルボキシル基に対して１分子のグリシンのアミノ基を脱水縮合させてペプチド結合を形成する工程が挙げられる。該工程では脱水縮合反応後に必要に応じて保護基の１つ以上を脱保護する。カルボキシル基に対する保護基としてはベンジル基等の公知のカルボキシル基用保護基が使用でき、アミノ基に対する保護基としてはｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基等の公知のアミノ基用保護基が使用できる。

工程ＢにおいてＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦは、ＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦ活性を有する生物の細胞を生細胞のまま用いてもよいし、死滅しているが損傷していない前記細胞の形態で用いてもよいし、ＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦが細胞外に存在する形態、具体的には、前記生物の細胞の破砕物の形態で用いてもよいし、前記細胞から分離され、必要に応じて適宜精製されたタンパク質の形態で用いてもよい。ここでＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦ活性を有するタンパク質の精製の程度は特に限定されず、粗精製であってもよい。細胞の「破砕物」については既述の通りである。

工程Ｂで用いる酵素としては、好ましくは、ＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦ活性を有する生細胞を用いず、より好ましくは、ＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦ活性を有する生細胞及び損傷していない死滅細胞を用いない。工程Ｂで用いる酵素としては特に、細胞外に存在するＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦ、具体的には、前記細胞の破砕物の形態のＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦ、又は、前記細胞から分離されたタンパク質の形態のＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦを用いることが好ましい。ＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦを、当該活性を有する生細胞の形態で工程Ｂに用いる場合は反応系中でＡＭＰが分解され易く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることが難しい（実施例４参照）。一方、ＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦを、細胞外に存在する形態で工程Ｂに用いる場合はＡＭＰの分解は生じ難く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることができるため好ましい。なお、生細胞を用いず工程Ｂの反応を行う場合、生細胞による還元作用が存在しないために、酸素を多く含む雰囲気下においては酸化が進み易く酸化型グルタチオンが生じやすいという問題があるが、本発明では工程Ｂの反応を大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で行うことによって、グルタチオンの酸化を抑制し、還元型のグルタチオンを高収率で得ることが可能となる。すなわち、ＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦを、細胞外に存在する形態、具体的には、当該活性を有する細胞の破砕物の形態、又は、当該細胞から分離されたタンパク質の形態で用いて本発明の工程Ｂを行うことにより、ＡＭＰの分解抑制とグルタチオンの酸化抑制を両立させることが可能となる。

工程Ｂにおいてγ−グルタミルシステイン、グリシン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、工程Ｂ’においてγ−グルタミルシステイン、グリシンはそれぞれ塩の形態、フリー体の形態、水和物等の溶媒和物の形態等の各種の形態で反応系中に添加することができる。

工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’において原料として用いるγ−グルタミルシステインは、酸化型γ−グルタミルシステインを実質的に含まないものが好ましく、具体的には、γ−グルタミルシステインと酸化型γ−グルタミルシステインとの総モル量に対してγ−グルタミルシステインが７０モル％以上、より好ましくは８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、更に好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９８モル％以上、最も好ましくは１００モル％のγ−グルタミルシステインを用いる。

工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’では反応を「大気よりも酸素濃度が低い雰囲気」下において行うことを特徴とする。当該雰囲気としては、酸素濃度１０体積％以下の雰囲気が好ましく、更に好ましくは５体積％以下の雰囲気である。下限は特に限定されるものではなく、酸素濃度が０体積％でもよい。「大気よりも酸素濃度が低い雰囲気」としては不活性ガスの雰囲気が例示できる。不活性ガスとしては、酸素が含まれていなければ特にガスは限定しないが、窒素、希ガス（アルゴン等）、二酸化炭素ガス等の不活性ガスの雰囲気が好ましい。ここで不活性ガスに酸素が含まれていないとは、実質的に酸素が含まれていないことも包含する。気相が前記不活性ガスにより置換された反応容器中で反応を行うことで、上記酸素濃度の雰囲気下での反応を実現することができる。「気相が前記不活性ガスにより置換された反応容器中で反応を行う」は、必要に応じて前記不活性ガスの流通下で反応を行うことも包含する。なお、雰囲気圧は特に限定されないが、通常は常圧付近、典型的には０．０８〜０．１２ＭＰａとすることができる。この雰囲気下でグルタチオンの生成を行うと、酸化型グルタチオンの副生が抑制され、効率的にグルタチオンを製造することができる。工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’での基質γ−グルタミルシステインに対するグルタチオンの収率は典型的には８０モル％以上、好ましくは８５モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、特に好ましくは９５モル％以上である。工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’の反応後の反応系（例えば反応混合液）中には酸化型グルタチオンは実質的に含まれず、具体的には、工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’の反応後の反応系中には、グルタチオンと酸化型グルタチオンとの総モル量に対してグルタチオンが８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、更に好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９７モル％以上、最も好ましくは１００モル％含まれる。

工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’での反応は適当なｐＨに調整された水等の溶媒を含む反応混合液中で行うことができる。このときの条件としては特に限定されないが、基質濃度（γ−グルタミルシステインとグリシンとの合計濃度）は好ましくは約０．１〜９９重量％、より好ましくは１〜２０重量％とすることができる。反応開始時の基質中のγ−グルタミルシステインとグリシンとの量比は、γ−グルタミルシステイン１モルに対してグリシンを１モル前後とすることができ、例えばγ−グルタミルシステイン１モルに対してグリシンを０．５〜２モル、好ましくは０．７〜１．３モルとすることができる。反応温度は好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜５０℃とすることができる。反応のｐＨは好ましくは４〜１１、より好ましくは６〜９とすることができる。反応時間は好ましくは１〜１２０時間、より好ましくは１〜７２時間とすることができる。

工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’で原料となるγ−グルタミルシステインは上記工程Ａ及び／又は工程Ａ’により得ることができる。この場合、工程Ａ及び／又は工程Ａ’の出発原料であるＬ−システインから、酸化型γ−グルタミルシステイン及び酸化型グルタチオンの副生を抑制しながらグルタチオンを製造することが可能であり、基質Ｌ−システインに対するグルタチオンの収率は典型的には７５モル％以上、好ましくは８０モル％以上、より好ましくは８５モル％以上、特に好ましくは９０モル％以上とすることができる。

工程Ｂにおいて工程Ａで得られたγ−グルタミルシステインを原料とする場合、工程Ａの反応と工程Ｂの反応を順次行うことができる。この場合、工程Ａ終了後の反応混合液からγ−グルタミルシステインを分離し工程Ｂに用いてもよいし、工程Ａを、ＧＳＨＩＩ及び／又はＧＳＨＦとグリシンの各要素のうち少なくとも１つが不足し工程Ｂが進行しない条件で行い、次いで工程Ａ終了後の反応混合液からγ−グルタミルシステインを分離することなく前記不足していた要素を反応混合液に追加して工程Ｂを行ってもよい。

また工程Ａの反応と工程Ｂの反応とは順次行う必要はなく同時に行ってもよい。すなわち、Ｌ−システインと、Ｌ−グルタミン酸と、グリシンとを含む原料混合物を、工程Ａに用いる上記酵素と工程Ｂに用いる上記酵素とＡＴＰとの存在下で反応させてもよい。この実施形態もまた、工程Ｂに原料として用いられる酸化型γ−グルタミルシステインが工程Ａにより生成されたものである本発明の実施形態の１つである。ただし、ＧＳＨＩはグルタチオンによりフィードバック阻害を受けることが知られており、工程Ａにおいて酵素としてＧＳＨＩを用いる場合には、工程Ａの反応と工程Ｂの反応とは順次行うことが好ましい。工程Ａ及びＢにおいて酵素としてＧＳＨＦを用いる場合には、ＧＳＨＦのみの作用により工程ＡとＢを同時に行うことができる。

同様に、工程Ｂ’で原料となるγ−グルタミルシステインは上記工程Ａ’により得ることができる。工程Ａ’終了後の反応混合物からγ−グルタミルシステインを分離し、工程Ｂ’に用いてもよいし、γ−グルタミルシステインを分離することなく、工程Ａ’終了後の反応混合物にグリシンを追加し適宜反応条件を調整して工程Ｂ’を行ってもよい。また、工程Ａ’の反応と工程Ｂ’の反応とは順次行う必要はなく同時に行ってもよい。すなわち、Ｌ−システインと、Ｌ−グルタミン酸と、グリシンとを含む原料混合物を反応させてもよい。この実施形態もまた、工程Ｂ’に原料として用いられるγ−グルタミルシステインが工程Ａ’により生成されたものである本発明の実施形態の１つである。

反応混合液中の各酵素の濃度は適宜調整することができ、例えば各酵素のタンパク質濃度として下限が１μｇ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが好ましくは１００ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で適宜調整することができる。工程ＢにＧＳＨＩＩが用いられる場合、工程Ｂの反応混合液中のＧＳＨＩＩ活性は特に限定されないが下限は０．０５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は５０００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。工程ＢにＧＳＨＦが用いられる場合、工程Ｂ反応混合液中のＧＳＨＦ活性は特に限定されないが下限は０．０５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は５０００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。

反応混合液中のＡＴＰの濃度は、基質である、γ−グルタミルシステインの濃度やＡＴＰ再生系の有無に応じて適宜調整することができる。工程Ｂにおいて、ＡＴＰは、γ−グルタミルシステインに対し等モル量消費される。工程ＢをＡＴＰ再生反応と共役させて実施する場合は、γ−グルタミルシステインに対するＡＴＰの添加量を大幅に低減することができる。そこで、工程Ｂにおける反応混合液中のＡＴＰ濃度の上限は特に限定されないが、γ−グルタミルシステイン濃度に対してモル濃度比で２倍以下が好ましく、１．２倍以下がより好ましい。また、工程Ｂにおける反応混合液中のＡＴＰ濃度の下限は特に限定されないが、γ−グルタミルシステイン濃度に対してモル濃度比で０．０００１倍以上が好ましく、０．００１倍以上がより好ましく、０．０１倍以上が更に好ましい。

＜ＡＴＰ再生反応＞
工程Ａ及びＢはいずれもＡＴＰを消費しＡＤＰを生成する工程である。ＡＴＰは比較的高価な原料であるため、工程Ａ及び／又はＢを、該工程で生じたＡＤＰからＡＴＰを再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行うことが好ましい。

ＡＴＰ再生反応としては、リン酸基供給源とホスホトランスフェラーゼとを用いてＡＤＰをＡＴＰへと再生する反応が挙げられる。

ＡＴＰ再生反応の一例として、リン酸基供給源として縮合リン酸（ポリリン酸）を用い、ホスホトランスフェラーゼとして、ポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）とアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）との組み合わせを用いるＡＴＰ再生反応のスキームを以下に示す。

スキームにおいて、ＡＭＰはアデノシン一リン酸を示し、ＰＡＰはポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼを示し、ＡＤＫはアデニル酸キナーゼを示し、ＰｏｌｙＰ_ｎはリン原子がｎ個の縮合リン酸（本明細書では「ポリリン酸」という）を示し、ＰｏｌｙＰ_ｎ-1はリン原子がｎ−１個の縮合リン酸（ポリリン酸）を示し、「反応原料」は工程Ａ又はＢでの反応原料を示し、「生成物」は工程Ａ又はＢでの生成物を示す。

すなわち、工程Ａ及び／又はＢを縮合リン酸（ポリリン酸）とＰＡＰとＡＤＫとの存在下で行うことにより、ＡＴＰが消費されて生じたＡＤＰはＡＤＫの作用によりＡＴＰとＡＭＰとに変換され、ＡＤＫの作用により生じたＡＭＰはＰＡＰの作用によりＡＤＰに変換される。このＡＴＰ再生反応は工程Ａ及び／又はＢの反応と共役することができる。

ＡＤＫ及びＰＡＰとしては、各酵素の活性を有する生物の細胞を生細胞のまま用いてもよいし、死滅しているが損傷していない前記細胞の形態で用いてもよいし、ＡＤＫ及び／又はＰＡＰが細胞外に存在する形態、具体的には、前記生物の細胞の破砕物の形態で用いてもよいし、前記細胞から分離され、必要に応じて適宜精製されたタンパク質の形態で用いてもよい。ここでＡＤＫ及び／又はＰＡＰ活性を有するタンパク質の精製の程度は特に限定されず、粗精製であってもよい。細胞の「破砕物」については既述の通りである。

ＡＴＰ再生反応で用いる酵素としては、好ましくは、ＡＤＫ及び／又はＰＡＰ活性を有する生細胞を用いず、より好ましくは、ＡＤＫ及び／又はＰＡＰ活性を有する生細胞及び損傷していない死滅細胞を用いない。工程Ｂで用いる酵素としては特に、細胞外に存在するＡＤＫ及び／又はＰＡＰ、具体的には、前記細胞の破砕物の形態のＡＤＫ及び／又はＰＡＰ、又は、前記細胞から分離されたタンパク質の形態のＡＤＫ及び／又はＰＡＰを用いることが好ましい。ＡＤＫ及び／又はＰＡＰを、当該活性を有する生細胞の形態でＡＴＰ再生反応に用いる場合はＡＭＰが分解され易く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることが難しい（実施例４参照）。一方、細胞外に存在する形態でＡＴＰ再生反応に用いる場合はＡＭＰの分解は生じ難く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることができるため好ましい。なお、生細胞を用いず工程Ａ及び／又は工程Ｂを行う場合、生細胞による還元作用が存在しないために、酸素を多く含む雰囲気下においては酸化が進み易く酸化型γ−グルタミルシステイン及び／又は酸化型グルタチオンが生じやすいという問題があるが、本発明では工程Ａ及び／又は工程Ｂの反応を大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で行うことによって、γ−グルタミルシステイン及び／又はグルタチオンの酸化を抑制し、還元型のγ−グルタミルシステイン及び／又はグルタチオンを高収率で得ることが可能となる。すなわち、ＡＤＫ及び／又はＰＡＰを、細胞外に存在する形態、具体的には、当該活性を有する細胞の破砕物の形態、又は、当該細胞から分離されたタンパク質の形態で用いて本発明の工程Ａ及び／又は工程Ｂを行うことにより、ＡＭＰの分解抑制とγ−グルタミルシステイン及び／又はグルタチオンの酸化抑制を両立させることが可能となる。

ＡＴＰ再生反応に用いる各酵素の反応混合液中での濃度は適宜調整することができ、例えば各酵素のタンパク質濃度として下限が１μｇ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが好ましくは１００ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で適宜調整することができる。工程Ａ又はＢにＡＴＰ再生反応を共役させる場合、反応混合液中のＡＤＫ活性は特に限定されないが下限は２Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は２０００００Ｕ／ｍｌ以下とすることができ、反応混合液中のＰＡＰ活性は特に限定されないが下限は０．５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は５００００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。

縮合リン酸（ポリリン酸）の添加量は反応基質の量に応じて適宜調節すればよい。縮合リン酸（ポリリン酸）はナトリウム塩、カリウム塩等の塩の形態、フリー体の形態、水和物等の溶媒和物の形態等の各種の形態で添加することができる。縮合リン酸（ポリリン酸）の重合度（１分子あたりのリン原子数）は特に限定されない。なお、実施例及び比較例で使用したメタリン酸Ｎａは種々の重合度の縮合リン酸ナトリウム塩の混合物であった。

＜実験１＞
大腸菌Ｋ１２株由来γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）の調製
大腸菌Ｋ１２株に由来するＧＳＨＩ遺伝子（配列番号１）のＮ末端部分の塩基配列に制限酵素ＳａｃＩの切断部位及びＳＤ配列を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１：配列番号２）と、Ｃ末端部分の塩基配列に制限酵素ＫｐｎＩ切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−２：配列番号３）を調製した。このＤＮＡプライマーを用いて、この配列の間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することでＧＳＨＩ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得した。このときＰＣＲ増幅に用いた鋳型は大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡである。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、ＧＳＨＩ遺伝子の全長（配列番号１）が含まれていることを確認した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０９１３６）のｌａｃプロモーターの下流のＳａｃＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＵＣＧＳＨＩを構築した。この組換えベクターｐＵＣＧＳＨＩを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＵＣＧＳＨＩ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると、ＧＳＨＩ活性は５Ｕ／ｍｌ、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性は９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。

＜実験２＞
大腸菌Ｋ１２株由来グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）の調製
大腸菌Ｋ１２株に由来するＧＳＨＩＩ遺伝子（配列番号４）のＮ末端部分の塩基配列に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３：配列番号５）と、Ｃ末端部分の塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−４：配列番号６）を調製した。このＤＮＡプライマーを用いて、この配列の間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することでＧＳＨＩＩ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得した。このときＰＣＲ増幅に用いた鋳型は大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡである。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、ＧＳＨＩＩ遺伝子の全長（配列番号４）が含まれていることを確認した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＧＳＨＩＩを構築した。この組換えベクターｐＮＧＳＨＩＩを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＧＳＨＩＩ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると、ＧＳＨＩＩ活性は５Ｕ／ｍｌ、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性は９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。

＜実験３＞
ストレプトコッカス・アガラクチエ由来２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＦ）の調製
大腸菌での発現用にコドンを最適化し、Ｎ末端部分の塩基配列に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位、Ｃ末端部分の塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を結合させたストレプトコッカス・アガラクチエ由来のＧＳＨＦ遺伝子断片（配列番号７）を遺伝子合成法にて取得（ユーロジェンテック社製）した。得られた遺伝子断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＧＳＨＦを構築した。この組換えベクターｐＮＧＳＨＦを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＧＳＨＦ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると、ＧＳＨＦ活性は３Ｕ／ｍｌ、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性は９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。

＜実験４＞
アシネトバクター・ジョンソニ由来ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）の調製
大腸菌での発現用にコドンを最適化し、Ｎ末端部分の塩基配列に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位、Ｃ末端部分の塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を結合させたアシネトバクター・ジョンソニ由来のＰＡＰ遺伝子断片（配列番号８）を遺伝子合成法にて取得（ユーロジェンテック社製）した。得られた遺伝子断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＰＡＰを構築した。この組換えベクターｐＮＰＡＰを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＰＡＰ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると、ＰＡＰ活性は４０Ｕ／ｍｌ、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性は９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。

＜収率の算出＞
本明細書の実験における各化合物の収率の算出方法は以下の通り。

反応生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより定量し、下記式により収率を求めた。
収率：各化合物の生成量（ｍｏｌ）／初発のＬ−システイン（ｍｏｌ）×１００
上記高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。この溶出条件では、グルタチオン（ＧＳＨ）、γ−グルタミルシステイン（γ−ＧＣ）、酸化型γ−ＧＣ、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の順で溶出する。

［収率の分析］
カラム：ＯＤＳ−ＨＧ−３（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、野村化学社製）；
溶離液：リン酸２水素カリウム１２．２ｇ及びヘプタンスルホン酸ナトリウム３．６ｇを蒸留水１．８Ｌで溶解し、該溶液をリン酸でｐＨ２．８に調整し、メタノール１８６ｍｌを追加して溶解した液；
流速：１．０ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
測定波長：２１０ｎｍ。

＜実施例１ＡＴＰ当量添加系，窒素雰囲気下での反応＞
以下に示す実施例１の反応は窒素雰囲気下で実施した。
（γ−グルタミルシステインの生成）

Ｌ−グルタミン酸Ｎａ１水和物０．３６６８ｇ（２．１７ｍｍｏｌ）、Ｌ−システイン塩酸塩１水和物０．３６３６ｇ（２．０７ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物１．０２ｇ、ＡＴＰ１．１９ｇ（２．１６ｍｍｏｌ）、蒸留水１５ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液１．４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験１で調製したγ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）酵素液を１ｇ添加し、反応開始した。反応容器に窒素ライン口、排気口を設け、窒素ライン口から窒素を１０ｍｌ／ｍｉｎで流し、反応容器内の気相部の空気を追い出すことで気相部の酸素濃度を限りなく０体積％に維持した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、γ−グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが生成した。反応６時間後にＬ−システインが消失した。反応６時間後におけるγ−グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインの収率は、対初発Ｌ−システインでそれぞれ、９７ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％であった。

（グルタチオンの生成）

上記の反応６時間後の反応液に、グリシン０．１９２ｇ（２．５６ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物１．０２ｇ、ＡＴＰ１．１９ｇ（２．１６ｍｍｏｌ）を混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液１．４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験２で調製した、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）酵素液１ｇを添加し、反応を開始した。γ−グルタミルシステイン生成工程と同様に窒素雰囲気下で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、反応４時間後にγ−グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが消失し、グルタチオン及び酸化型グルタチオンが生成した。反応４時間後における収率は対初発Ｌ−システインでグルタチオン９４ｍｏｌ％、酸化型グルタチオン２ｍｏｌ％であった。

＜実施例２ＡＴＰ再生系，窒素雰囲気下での反応＞
以下に示す実施例２の反応は窒素雰囲気下で実施した。
（γ−グルタミルシステインの生成）

Ｌ−グルタミン酸Ｎａ１水和物０．３８９ｇ（２．３０ｍｍｏｌ）、Ｌ−システイン塩酸塩１水和物０．３７１４ｇ（２．１１ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．７０６８ｇ、ＡＴＰ０．０５８８ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）、メタリン酸Ｎａ０．８ｇ、蒸留水１４ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．８ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験１で調製したγ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）酵素液を１ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液１ｇを添加し、反応開始した。反応容器に窒素ライン口、排気口を設け、窒素ライン口から窒素を１０ｍｌ／ｍｉｎで流し、反応容器内の気相部の空気を追い出すことで気相部の酸素濃度を限りなく０体積％に維持した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、γ−グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが生成した。反応６時間後にＬ−システインが消失した。反応６時間後におけるγ−グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインの収率は、対初発Ｌ−システインでそれぞれ、９５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％であった。

（グルタチオンの生成）

上記の反応６時間後の反応液に、グリシン０．１９ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）を混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．２ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験２で調製した、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）酵素液１ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液１ｇを添加し、反応を開始した。γ−グルタミルシステイン生成工程と同様に窒素雰囲気下で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、グルタチオン、酸化型グルタチオンが生成した。反応６時間後にγ−グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが消失し。反応６時間後におけるグルタチオン、酸化型グルタチオンの収率は、対初発Ｌ−システインでそれぞれ８２ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％であった。

なお、実験１で調製したＧＳＨＩ酵素液、実験２で調製したＧＳＨＩＩ酵素液、及び、実験４で調製したＰＡＰ酵素液にはそれぞれ宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性が含まれるため、上記の２工程ではＡＤＫ酵素液を別途調製する必要はなかった。

＜実施例３ＡＴＰ再生系，窒素雰囲気下での反応＞
以下に示す実施例の反応は窒素雰囲気下で実施した。
（グルタチオンの生成）

Ｌ−グルタミン酸Ｎａ１水和物０．１８５ｇ（１．０９ｍｍｏｌ）、Ｌ−システイン塩酸塩１水和物０．１７５ｇ（１．００ｍｍｏｌ）、グリシン（１．０９ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．３５ｇ、ＡＴＰ０．０５５ｇ（０．１０ｍｍｏｌ）、メタリン酸Ｎａ０．４ｇ、蒸留水１６ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．４４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験３で調製した２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＦ）酵素液１ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液１ｇを添加し、反応開始した。反応容器に窒素ライン口、排気口を設け、窒素ライン口から窒素を１０ｍｌ／ｍｉｎで流し、反応容器内の気相部の空気を追い出すことで気相部の酸素濃度を限りなく０体積％に維持した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、グルタチオン、酸化型グルタチオンが生成した。反応６時間後にＬ−システインが消失した。反応６時間後におけるグルタチオン、酸化型グルタチオンの収率は、対初発Ｌ−システインでそれぞれ、９０ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％であった。

なお、実験３で調製したＧＳＨＦ酵素液、及び、実験４で調製したＰＡＰ酵素液にはそれぞれ宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性が含まれるため、上記工程ではＡＤＫ酵素液を別途調製する必要はなかった。

＜比較例１ＡＴＰ当量添加系，空気雰囲気下での反応＞
以下に示す比較例１の反応は空気雰囲気下で実施した。
（γ−グルタミルシステインの生成）

Ｌ−グルタミン酸Ｎａ１水和物０．３６６８ｇ（２．１７ｍｍｏｌ）、Ｌ−システイン塩酸塩１水和物０．３６３６ｇ（２．０７ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物１．０２ｇ、ＡＴＰ１．１９ｇ（２．１６ｍｍｏｌ）、蒸留水１５ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液１．４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験１で調製したγ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）酵素液を１ｇ添加し、反応開始した。窒素置換は行わず、反応液が反応容器内の空気と接触した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、γ−グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが生成した。反応６時間後にＬ−システインが消失した。反応６時間後におけるγ−グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインの収率は、対初発Ｌ−システインでそれぞれ、７８ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％であった。

（グルタチオンの生成）

上記の反応６時間後の反応液に、グリシン０．１９２ｇ（２．５６ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物１．０２ｇ、ＡＴＰ１．１９ｇ（２．１６ｍｍｏｌ）を混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液１．４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験２で調製した、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）酵素液１ｇを添加し、反応を開始した。窒素置換は行わず、反応液が反応容器内の空気と接触した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、反応４時間後にγ−グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが消失し、グルタチオン及び酸化型グルタチオンが生成した。反応４時間後における収率は対初発Ｌ−システインでグルタチオン５８ｍｏｌ％、酸化型グルタチオン２０ｍｏｌ％であった。

＜比較例２ＡＴＰ再生系，空気雰囲気下での反応＞
以下に示す比較例２の反応は空気雰囲気下で実施した。
（γ−グルタミルシステインの生成）

Ｌ−グルタミン酸Ｎａ１水和物０．３８９ｇ（２．３０ｍｍｏｌ）、Ｌ−システイン塩酸塩１水和物０．３７１４ｇ（２．１１ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．７０６８ｇ、ＡＴＰ０．０５８８ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）、メタリン酸Ｎａ０．８ｇ、蒸留水１４ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．８ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験１で調製したγ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）酵素液を１ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液１ｇを添加し、反応開始した。窒素置換は行わず、反応液が反応容器内の空気と接触した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、γ−グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが生成した。反応６時間後にＬ−システインが消失した。反応６時間後におけるγ−グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインの収率は、対初発Ｌ−システインでそれぞれ、７２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％であった。

（グルタチオンの生成）

上記の反応６時間後の反応液に、グリシン０．１９ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）を混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．２ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験２で調製した、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）酵素液１ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液１ｇを添加し、反応を開始した。窒素置換は行わず、反応液が反応容器内の空気と接触した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、グルタチオン、酸化型グルタチオンが生成した。反応６時間後にγ−グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが消失した。反応６時間後におけるグルタチオン、酸化型グルタチオンの収率は、対初発Ｌ−システインでそれぞれ、５１ｍｏｌ％、２２ｍｏｌ％であった。

＜比較例３ＡＴＰ再生系，空気雰囲気下での反応＞
以下に示す比較例の反応は空気雰囲気下で実施した。
（グルタチオンの生成）

Ｌ−グルタミン酸Ｎａ１水和物０．１８５ｇ（１．０９ｍｍｏｌ）、Ｌ−システイン塩酸塩１水和物０．１７５ｇ（１．００ｍｍｏｌ）、グリシン（１．０９ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．３５ｇ、ＡＴＰ０．０５５ｇ（０．１０ｍｍｏｌ）、メタリン酸Ｎａ０．４ｇ、蒸留水１６ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．４４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験３で調製した２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＦ）酵素液１ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液１ｇを添加し、反応開始した。窒素置換は行わず、反応液が反応容器内の空気と接触した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、グルタチオン、酸化型グルタチオンが生成した。反応６時間後にＬ−システインが消失した。反応６時間後におけるグルタチオン、酸化型グルタチオンの収率は、対初発Ｌ−システインでそれぞれ、３６ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％であった。尚、酸化型γ−グルタミルシステインが収率６ｍｏｌ％で生成していた。

＜実施例４未破砕菌体を使用したＡＴＰ再生系，窒素雰囲気下での反応＞
以下に示す反応は窒素雰囲気下で実施した。
（グルタチオンの生成）

Ｌ−グルタミン酸Ｎａ１水和物０．１８５ｇ（１．０９ｍｍｏｌ）、Ｌ−システイン塩酸塩１水和物０．１７５ｇ（１．００ｍｍｏｌ）、グリシン（１．０９ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．３５ｇ、ＡＴＰ０．０５５ｇ（０．１０ｍｍｏｌ）、メタリン酸Ｎａ０．４ｇ、蒸留水１６ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．４４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへＧＳＨＦを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液１ｇ、ＰＡＰを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液１ｇを添加し、反応開始した。反応容器に窒素ライン口、排気口を設け、窒素ライン口から窒素を１０ｍｌ／ｍｉｎで流し、反応容器内の気相部の空気を追い出すことで気相部の酸素濃度を限りなく０体積％に維持した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応１時間後に反応液を分析したところ、グルタチオン及び酸化型グルタチオンの生成が確認できた。変換率は、対初発Ｌ−システインでそれぞれ７．３ｍｏｌ％、０．６ｍｏｌ％であった。その後反応は進行したものの、反応７時間後でほぼ停止した。変換率は、対初発Ｌ−システインでそれぞれ１０．８ｍｏｌ％、１．２ｍｏｌ％であった。ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰいずれもほぼ消失しており、ＡＭＰの分解物であるアデニン、アデノシン、ヒポキサンチンが確認された。

上記の「ＧＳＨＦを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液」は、実験３における末尾の「続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした」という操作の代わりに、「続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁して、ＧＳＨＦを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液とした」という操作を行った以外は実験３と同じ材料及び手順により調製した。

上記の「ＰＡＰを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液」は、実験４における末尾の「続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした」という操作の代わりに、「続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁して、ＰＡＰを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液とした」という操作を行った以外は実験４と同じ材料及び手順により調製した。

上記の方法で調製した、ＧＳＨＦを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液、及び、ＰＡＰを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液にはそれぞれ宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性が含まれるため、上記工程ではＡＤＫ酵素液を別途調製する必要はなかった。

配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims

Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を含むことを特徴とする、γ−グルタミルシステインの製造方法。
前記工程Ａ’が、Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、γ−グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａである、請求項１に記載の方法。
前記工程Ａが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、請求項２に記載の方法。
前記γ−グルタミルシステイン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）由来である、請求項２又は３に記載の方法。
前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、請求項２又は３に記載の方法。
γ−グルタミルシステインとグリシンとを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、グルタチオンを生成する工程Ｂ’を含むことを特徴とする、グルタチオンの製造方法。
前記工程Ｂ’が、γ−グルタミルシステインとグリシンとを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、グルタチオン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、グルタチオンを生成する工程Ｂである、請求項６に記載の方法。
前記工程Ｂが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、請求項７に記載の方法。
前記グルタチオン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）由来である、請求項７又は８に記載の方法。
前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、請求項７又は８に記載の方法。
Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を更に含み、
前記工程Ｂ’に用いられるγ−グルタミルシステインが、前記工程Ａ’により生成されたものである、
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記工程Ａ’が、Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、γ−グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａである、
請求項１１に記載の方法。
前記工程Ａが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、請求項１２に記載の方法。
前記γ−グルタミルシステイン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）由来である、請求項１２又は１３に記載の方法。
前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、請求項１２又は１３に記載の方法。