CN101104862B - 非均相酶催化水解5-芳基海因合成d-芳基甘氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化工制药领域，尤其涉及一种非均相酶催化水解5-芳基海因合成D-芳基甘氨酸的方法，本发明以海因酶产生菌Arthrobacter aurescensLZ98的突变菌UV-LZ98和氨甲酰胺水解酶产生菌Agrobacteriumradiobacter LZ99的突变菌UV-LZ99发酵制备的酶制剂为催化剂，投入高出均相反应3-10倍以上量的5-芳基海因进行非均相催化反应，使产物D-芳基甘氨酸在底物被水解的过程中直接以固体方式析出，从而提高了合成效率，降低了蒸发能耗，并且产品质量稳定。
Description
技术领域
本发明涉及化工制药领域，尤其涉及一种非均相酶催化水解5-芳基海因合成D-芳基甘氨酸的方法。
背景技术
D-芳基甘氨酸是一类十分重要的非天然氨基酸，由于其构型与天然氨基酸正好相反而主要用于药物、肽以及甜味剂等的合成和制备，近年来随着对其应用价值的进一步开发，市场的需求量在迅猛增长。
传统的D-芳基甘氨酸的制备方法，包括了化学合成及拆分法和生物催化D-芳基海因水解法，其中所有报道的技术均为液-液均相过程，而均相生物催化水解法合成D-芳基甘氨酸因其溶解度小而导致反应体积庞大、产能低、能耗高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种非均相酶催化水解5-芳基海因制备D-芳基甘氨酸的方法，以克服现有技术中存在的问题。
本发明的构思是这样的：
在应用化学合成的方法制备底物5-芳基海因的基础上，以海因酶产生菌Arthrobacter aurescens LZ98的突变菌UV-LZ98和氨甲酰胺水解酶产生菌Agrobacterium radiobacter LZ99的突变菌UV-LZ99混合发酵制备的酶制剂为催化剂，投入高出均相反应3-10倍以上量的5-芳基海因进行非均相催化反应，使产物D-芳基甘氨酸以固体的方式随底物被水解直接获得，以提高生产效率和降低蒸发能耗。
本发明中D-芳基甘氨酸包括D-苯甘氨酸、D-氟苯甘氨酸、D-氯苯甘氨酸、D-溴苯甘氨酸、D-碘苯甘氨酸、D-烷氧苯甘氨酸、D-吡啶甘氨酸、D-萘甘氨酸、D-喹啉甘氨酸、D-嘧啶甘氨酸、D-吡嗪甘氨酸、D-哒嗪甘氨酸、D-吲哚甘氨酸、D-噻吩甘氨酸、D-呋喃甘氨酸、D-吡咯甘氨酸、D-吡唑甘氨酸、D-咪唑甘氨酸、D-噻唑甘氨酸、D-噁唑甘氨酸和D-异噁唑甘氨酸等，其中D-喹啉甘氨酸系列中大部分为新化合物，甘氨酸α碳可连在芳环的不同环碳上。
本发明根据酶制剂酶活的高低，调整反应温度和反应压力，可以控制反应速度和产品结晶速度，避免底物海因被包夹。
本发明的技术解决方案为：
本发明非均相酶催化水解5-芳基海因合成D-芳基甘氨酸的方法，包括以下步骤：
①在生物催化水解反应器中，依次投入溶剂水、5-芳基海因、酶制剂、酸或碱等，搅拌形成悬浮液，5-芳基海因的投入量为反应体系物料总量的5～21％(w/w)，加酸调pH值为6.5～7.8；
②按反应液质量总量的2～8％、酶活为0.28U/mL以上的酶制剂投入到上述生物催化水解反应器中，控制温度在25～40℃，开始搅拌反应；
③在反应过程中，控制反应***压力在0.09～0.03Mpa之间，间隔6h取样，用液相色谱法检测反应情况，当反应进行到8h左右时，则有D-芳基甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中检不出底物5-芳基海因时，反应基本结束；
④筛分分离得到的粗晶经过重结晶便可获得产品D-芳基甘氨酸。
所述酶制剂溶液的制备方法为：Arthrobacter aurescens LZ98的突变菌UV-LZ98和Agrobacterium radiobacter LZ99的突变菌UV-LZ99混合发酵制得含有海因酶和氨甲酰胺水解酶的酶制剂，即“两菌两酶”。
进一步的，所述D-芳基甘氨酸为D-苯甘氨酸、D-氟苯甘氨酸、D-氯苯甘氨酸、D-溴苯甘氨酸、D-碘苯甘氨酸、D-甲氧苯甘氨酸、D-吡啶甘氨酸、D-萘甘氨酸、D-喹啉甘氨酸、D-嘧啶甘氨酸、D-吡嗪甘氨酸、D-哒嗪甘氨酸、D-吲哚甘氨酸、D-噻吩甘氨酸、D-呋喃甘氨酸、D-吡咯甘氨酸、D-吡唑甘氨酸、D-咪唑甘氨酸、D-噻唑甘氨酸、D-噁唑甘氨酸和D-异噁唑甘氨酸等D-氨基酸中的一种，其中甘氨酸α碳可连在芳环不同位置的碳原子上。
进一步的，所述D-芳基甘氨酸为D-苯甘氨酸，其合成方法包括以下步骤：
①在10L酶催化反应罐中，加入水7kg、5-苯基海因0.9～1kg、加盐酸或硫酸调整pH到6.8；
②在搅拌的条件下再加入湿的酶活为0.62U/ml的酶制剂溶液酶活为0.3L，控制温度为25～38℃下，搅拌反应；
③间隔6h取样，用液相色谱法检测反应情况，当反应进行到8h左右时，则有D-苯甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中检不出底物5-苯基海因，且N-氨甲酰苯甘氨酸0.25％以下时，反应基本结束；
④分离得到的粗晶经过重结晶便可获得合格产品D-苯甘氨酸；
⑤透析过筛孔的料液，分别采用膜过滤、浓缩等提炼过程可获得溶液中另一部分D-苯甘氨酸。
进一步的，所述D-芳基甘氨酸为D-吡啶甘氨酸，其合成方法包括以下步骤：
①在10L酶催化反应罐中，加入水6.5kg，搅拌下投入5-吡啶基海因1kg，加盐酸或硫酸调整pH到6.5；
②再加入湿的酶活为0.58U/ml的酶制剂溶液约0.4L，控制温度为28～36℃下搅拌反应；
③间隔8h取样，用液相色谱法检测反应情况，当反应进行到9h左右时，则有D-吡啶甘氨酸晶体开始析出。待反应体系中检不出底物5-吡啶基海因，且N-氨甲酰-D-吡啶甘氨酸0.20％以下时，反应基本结束；
④分离得到的粗晶经过重结晶便可获得合格产品D-吡啶甘氨酸。
⑤透析过筛孔的料液，分别采用膜过滤、浓缩等提炼过程可获得溶液中另一部分D-吡啶甘氨酸。
进一步的，所述D-芳基甘氨酸为D-萘甘氨酸，其合成方法包括以下步骤：
①在10L酶催化反应罐中，加入水7.5kg，搅拌下投入5-萘基海因0.8kg、加盐酸或硫酸调整pH到7.0；
②在搅拌的条件下再加入湿的酶活为0.62U/ml的酶制剂溶液酶活为0.4L，控制温度为30～40℃下，搅拌反应；
③间隔8h取样，用液相色谱法检测反应情况，当反应进行到7h左右时，则有D-萘甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中检不出底物5-萘基海因以及对应的中间体时，反应基本结束；
④筛分分离得到的粗晶经过重结晶便可获得合格产品D-萘甘氨酸。
⑤透析过筛孔的料液，分别采用膜过滤、浓缩等提炼过程可获得溶液中另一部分D-萘甘氨酸。
进一步的，所述D-芳基甘氨酸为D-喹啉甘氨酸，其合成方法包括以下步骤：
①在10L酶催化反应罐中，加入水8kg，在搅拌的条件下投入5-喹啉海因0.85kg，调整pH到6.5；
②然后加入湿的酶活为0.68U/ml的酶制剂溶液约0.35L，于35～38℃下搅拌反应；
③间隔6h取样，用液相色谱法检测反应情况，当反应进行到8h左右时，则有D-喹啉甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中检不出底物5-喹啉海因，且N-氨甲酰-D-喹啉甘氨酸低于0.30％时，反应基本结束；
④筛分分离得到的粗晶经过重结晶便可获得合格产品D-2-喹啉甘氨酸。
⑤透析过筛孔的料液，分别采用膜过滤、浓缩等提炼过程可获得溶液中另一部分D-喹啉甘氨酸。
本发明的非均相催化是在微生物为催化剂的前提下实现的，更重要的是反应物和大部分的产物在整个过程中均为固相，通过条件的控制避免了固体的包夹，使转化率达到了99.5％以上。
本发明中，5-芳基海因生物催化制备D-芳基甘氨酸经过两步反应。第一步是底物5-芳基海因在海因酶催化下被水解为中间产物D-N-氨甲酰-芳基甘氨酸；第二步是中间产物在氨甲酰胺水解酶催化下被水解为产物D-芳基甘氨酸。
酶的催化作用是一个复杂的过程，受酶分子的结构、酶与底物分子相互作用、酶与底物的定向效应、酶与底物的手性选择结合和与反应过渡态的结合等作用的影响。在实际应用中金属离子对酶催化能力产生着重要的作用，Ni、Cu等二价离子有抑制作用，而Mn、Mg等二价离子则有明显的激活作用。
酶催化5-芳基海因水解制备D-芳基甘氨酸的动力学研究表明，在酶浓度固定、基本条件不变的前提下，底物浓度较低时，反应基本表现出一级反应，然而当反应物浓度增大到饱和后，反应速度趋于恒定，达到最大。如果能保证体系中底物5-芳基海因的浓度在相当长时间里处于饱和状态，那么就可以使酶催化反应速度在相当长的时间里维持最大值。在酶制剂的酶活达到足够高的前提下，在水存在的反应***中，固态(没有完全形成溶液)底物5-芳基海因随着溶液中溶质底物被催化水解生成产物的同时快速溶解以使溶液始终处于饱和态而保证酶促反应以最高速度进行。与此同时，生成的产物随着浓度的增加达到饱和后，将以晶体的形式结晶出来，打破了溶解平衡，使酶促反应能顺利地进行，从而实现非均相生物催化水解5-芳基海因合成D-芳基甘氨酸的过程。
传统的“一菌两酶”法可在一个细胞内完成整个转化、水解过程，而“两菌两酶”法则是在两个不同细胞中完成的。因此，底物、中间体和产物在不同细胞之间的传质过程是本技术的关键。为了降低传质对反应速度的影响，加入阳离子表面活性剂于反应体系则可取得良好的结果。
非均相生物催化过程有别于化学催化过程，但生物催化剂的催化活性同样随着反应时间的延长存在下降的问题。因此，控制底物的总投料量是必要的。本发明中确定底物5-芳基海因的量占反应物系总量的5～18％比较合适，而不同芳基有不同的理想值。这里的量值比例为质量比，反应物体系包含水、酶制剂、酸(硫酸或盐酸、磷酸等)、碱(氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或其他碳酸盐等)、5-芳基海因和其他助剂等。
两菌两酶非均相法实施的过程中，未反应的固体底物5-芳基海因、中间产物N-氨甲酰-芳基甘氨酸固体和产品D-芳基甘氨酸固体共处同一反应器中，整个过程存在多相。而且固体中间产物D-N-氨甲酰-芳基甘氨酸和固体产品D-芳基甘氨酸是在大量底物存在的条件下形成的，极易出现相互包裹或包夹而导致转化率降低的问题。但有利的是底物的固体为粉末，而D-芳基甘氨基酸则为晶体。控制D-芳基甘氨基酸晶体析出的速度，将能避免固体相互包裹，转化率能达到99.6％以上。具体的方法是反应条件的优化、控制以及酶制剂酶活的调整。
pH的影响。根据催化反应原理，在转化过程中有氨气、二氧化碳及D-芳基甘氨酸产生。生成的氨易与氨基酸形成盐而在反应***中积累，使反应后期的pH快速升高到8.5，从而强烈地抑制了N-氨甲酰胺水解酶的催化活性，导致反应速度减慢，甚至停止。所以适时控制酸碱性对反应十分重要，6.5-7.8是适宜的pH。
温度对反应的影响。在浓度、pH固定的条件下，温度对酶催化反应速度也有较大的影响。温度在25℃时，反应速度较慢，但产品晶体析出速度也较慢，有利于晶核的长大，包裹现象几乎观测不到；随着反应温度的提高反应速度也加快，当达到41℃时，反应速度很快，在过饱和体系中晶核形成速度也随着加快，包裹现象趋于明显。适宜的温度为25-40℃。
本发明与现有技术相比具有以下显著优点：
1、选用两株不同的菌，使其各产生一种酶，形成“两菌两酶”催化体系，不仅可最大限度地加快反应速度，同时也使两步催化水解一次完成。较原有“一菌两酶”技术极大地提高了反应速度。
2、5-芳基海因的投入量为传统工艺的3-10倍，且远高于其溶解度。随着反应的进行，产物D-芳基甘氨酸将积累直至晶体析出，一次晶体产出率可达到总产物量的40-75％(w/w)，减少了浓缩蒸发蒸汽的消耗量，节能率在40％以上。
3、产品质量稳定，减少一次水的用量，产率高出原有工艺4个百分点以上。
附图说明
图1为D-氨基酸的结构图；
图2为5-芳基海因酶催化水解制备D-芳基甘氨酸的反应原理图。
说明：图1中的R为芳基；图2中R与图1中R相同。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明。
首先以海因酶产生菌Arthrobacter aurescens LZ98的突变菌UV-LZ98和氨甲酰胺水解酶产生菌Agrobacterium radiobacter LZ99的突变菌UV-LZ99混合发酵制备得酶制剂。然后完成本发明过程。
实施例1，D-苯甘氨酸的制备
在10L酶催化反应罐中，先加入7kg水，然后投入5-苯基海因1kg，加盐酸或硫酸调整pH到6.8，在搅拌的条件下再加入湿的酶活为0.62U/ml的酶制剂溶液约0.3L，控制温度为28℃，搅拌反应。间隔6h取样，用液相色谱法检测反应情况，当反应进行到8h左右时，则有D-苯甘氨酸晶体开始析出，反应液中产品浓度基本恒定在2.45％。待反应体系中检不出底物5-苯基海因，且N-氨甲酰苯甘氨酸0.25％以下时，反应基本结束，其转化率在99.6％以上。筛分分离得到的粗晶，经过重结晶便可获得合格产品D-苯甘氨酸446.2g；透析过筛孔的物料则采用膜过滤、浓缩等提炼过程获得另一部分D-苯甘氨酸产品240.2g。共得到产品686.4g，收率为80％。
D-对氟苯甘氨酸可由5-对氟苯基海因水解获得，制法与实施例1相似，收率77％。
D-对氯苯甘氨酸可由5-对氯苯基海因水解获得，制法与实施例1相同，收率81％。
D-对溴苯甘氨酸可由5-对溴苯基海因水解获得，制法与实施例1相似，相同，收率73％。
D-对碘苯甘氨酸制可由5-对碘苯基海因水解获得，制法与实施例1相似，收率69％。
D-对甲氧苯甘氨酸制法可由5-对碘苯基海因水解获得，制法与实施例1相同，收率75％。
实施例2，D-3-吡啶甘氨酸制备
在10L的酶催化反应罐中，先加入6.5kg水，在搅拌的条件下投入5-(3-吡啶基)海因1kg，调整pH到6.5，然后加入湿的酶活为0.58U/ml的酶制剂溶液约0.4L，于32～36℃下搅拌反应。间隔8h取样，用液相色谱法检测反应情况，当反应进行到9h左右时，则有D-吡啶甘氨酸晶体开始析出。待反应体系中检不出底物5-(3-吡啶基)海因，且N-氨甲酰吡啶甘氨酸0.20％以下时，反应基本结束，其转化率在99.5％左右。筛分分离得到的粗晶经过重结晶便可获得合格产品D-3-吡啶甘氨酸391.6g；透析过筛孔的物料则采用膜过滤、浓缩等提炼过程获得另一部分产品261.1g。共计产品652.7g，收率为76％。
其它D-吡啶甘氨酸制法基本相同。
实施例3，D-2-萘甘氨酸的制备
在10L的酶催化反应罐中，先加入7.5kg水，在搅拌的条件下投入5-(2-萘基)海因0.8kg，调整pH到7.0，然后加入湿的酶活为0.65U/ml的酶制剂溶液约0.4L，于30-40℃下搅拌反应。间隔8h取样，用液相色谱法检测反应情况，当反应进行到7h左右时，则有D-2-萘甘氨酸晶体开始析出。待反应体系中检不出5-(2-萘基)海因以及对应的中间体时，反应基本结束，其转化率在99％左右。筛分分离得到的粗晶经过重结晶便可获得合格产品D-2-萘甘氨酸327.3g；透析过筛孔的物料则采用膜过滤、浓缩等提炼过程获得另一部分D-2-萘甘氨酸192.2g。产品共计519.5g，收率为73％。
其它D-萘甘氨酸制法基本相同。
实施例4，D-2-喹啉甘氨酸的制备
在10L的酶催化反应罐中，先加入8kg水，在搅拌的条件下投入5-(2-喹啉基)海因0.85kg，调整pH到6.5，然后加入湿的酶活为0.68U/ml的酶制剂溶液约0.35L，于35～38℃下搅拌反应。间隔6h取样，用液相色谱法检测反应情况，当反应进行到8h左右时，则有D-2-喹啉甘氨酸晶体开始析出。待反应体系中检不出底物5-(2-喹啉基)海因，且N-氨甲酰-D-2-喹啉甘氨酸低于0.30％时，反应基本结束，其转化率在99％左右。筛分分离得到的粗晶经过重结晶便可获得合格产品D-2-喹啉甘氨酸346.1g；透析过筛孔的物料则采用膜过滤、浓缩等提炼过程获得另一部分产品D-2-喹啉甘氨酸221.2g。产品共计567.3g，收率为75％。
其它D-喹啉甘氨酸制法与之基本相同。
Claims (1)
1.非均相酶催化水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法，其特征在于所述D-芳基甘氨酸为D-萘甘氨酸，其合成方法包括以下步骤：
①在酶催化反应罐中，加入水7.5kg，搅拌下投入5-萘基海因0.8kg，加盐酸或硫酸调整pH到7.0；
②在搅拌的条件下再加入含有海因酶和氨甲酰胺水解酶的湿的酶活为0.62U/ml的酶制剂溶液0.4L，控制温度为36～40℃下搅拌反应；
③间隔8h取样，用液相色谱法检测反应情况，当反应进行到7h时，则有D-萘甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中检不出底物5-萘基海因以及对应的中间体时，反应结束；
④筛分分离得到的粗晶，经过重结晶便可获得合格产品D-萘甘氨酸。
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