CN114317647A - 一种利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法。该利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法为将基因工程大肠杆菌接种至种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将种子液按一定的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，培养到一定阶段加入乳糖进行诱导，诱导后继续培养一定阶段加入用于合成谷胱甘肽的前体物质，继续培养一段时间，得到谷胱甘肽。本发明具有操作简便，反应条件温和，且产物易于分离、反应规模可放大的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽(L-γ-谷氨酰-L-半胱胺酰-甘氨酸，GSH)作为一种三肽化合物，广泛存在于各种动物、植物和微生物中。谷胱甘肽在生物体中具有非常重要的生理意义，尤其对维持生物体的氧化还原平衡起着至关重要的作用,因此也被广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。
生产谷胱甘肽的方法有提取法、化学合成法，酶催化法以及发酵法，其中酶催化法和发酵法作为生物合成法，因其反应条件温和、成本低产率高，成为了最常用的生产方法。
谷胱甘肽的生物合成包括了两步催化反应，依次由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)完成催化，两步催化均需要ATP的参与。通过基因工程的方法过表达γ-GCS以及GS是一种有效的提升产量的方法，但是在绝大多数菌株中，γ-GCS受到产物谷胱甘肽的反馈抑制，这大大限制了谷胱甘肽生产菌株的生产能力。有文献报道双功能谷胱甘肽合成酶受产物谷胱甘肽的反馈抑制不明显，这非常有利于菌株积累更高浓度的谷胱甘肽，对生产具有非常重要的价值。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法，将基因工程大肠杆菌接种至种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将种子液按一定的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，培养到一定阶段加入乳糖进行诱导，诱导后继续培养一定阶段加入用于合成谷胱甘肽的前体物质，继续培养一段时间，得到谷胱甘肽。
在一些实施方式中，所述基因工程大肠杆菌包含双功能谷胱甘肽合成酶基因，且所述双功能谷胱甘肽合成酶基因能够在所述基因工程大肠杆菌胞内表达。
在一些实施方式中，所述双功能谷胱甘肽合成酶基因来自于丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的gshAB基因，所述基因工程大肠杆菌源自于大肠杆菌(Escherichia coli)BL21。
在一些实施方式中，所述gshAB基因的序列为NCBI中GeneID为66381177所示的核酸序列。
在一些实施方式中，使用PCR方法扩增丁酸梭菌基因组中的gshAB基因，连接至载体pET-28a的Nco I和EcoR I位点之间，得到重组质粒pET-28a-gshAB。
在一些实施方式中，采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌。
在一些实施方式中，使用热激转化的方式将重组质粒转化至大肠杆菌。
在一些实施方式中，诱导剂乳糖加入的终浓度为1～5g/L；诱导培养的温度为25～35℃。
本发明的有益效果是，通过基因工程大肠杆菌发酵制备谷胱甘肽，该方法操作简便，反应条件温和。此外，产物易于分离、反应规模可放大。
附图说明
图1为重组质粒pET-28a-gshAB构建示意图。
图2为gshAB基因PCR扩增产物示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
双功能谷胱甘肽合成酶基因的获取
培养丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，培养基成分(g/L):葡萄糖8、胰蛋白胨10、牛肉膏10、酵母粉3，pH 7.20±0.20。将丁酸梭菌在氮气保护下接种至装有培养基的厌氧瓶中，37℃、100rpm培养12小时左右。离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组。以丁酸梭菌基因组为模板，PCR扩增gshAB基因片段的引物序列如下：
上游引物
(含Nco I酶切位点)5’-CATGCCATGGATGTTAGAAAAAATTAAAG-3’
下游引物
(含EcoR I酶切位点)5’-CGGAATTCTCAGTTTATAAAACC-3’
PCR条件为：预变性94℃，5min；变性94℃，1min，退火56℃，1min，延伸72℃，3min，循环数30；72℃延伸10min。得到长度约2.3kb左右的DNA片段。PCR产物的电泳图如图2所示。
实施例2
基因工程大肠杆菌的构建
用限制性内切酶Nco I及EcoR I分别酶切pET-28a以及gshAB基因片段，回收纯化后用T4连接酶进行连接反应，得到重组质粒pET-28a-gshAB。采用氯化钙法制备感受态大肠杆菌。转化大肠杆菌BL21：连接液取10微升，加入到100微升大肠杆菌BL21感受态细胞悬浮液中，冰上放置30min，42℃热激90s。冰上放置2min后加入600微升LB培养基，震荡培养1h。培养完毕后涂布含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养12h，得到基因工程大肠杆菌。
实施例3
挑取实施例2中得到的基因工程大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养过夜，得到种子液。将种子液按照体积比2％的接种量接种到装有自诱导培养基的三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养过夜，得到发酵液。经液相色谱法检测，发酵液中谷胱甘肽含量为0.98g/L。
实施例4
挑取实施例2中得到的基因工程大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养过夜，得到种子液。将种子液按照体积比2％的接种量接种到含有6L发酵培养基(葡萄糖60g，酵母浸粉60g，蛋白胨117g，(NH4)2SO4 24g，K2HPO4·3H2O 108g，KH2PO418g，MgSO4 7.2g，微量元素溶液6mL，微量元素溶液成分为：FeSO4·7H2O 2.8g/L，MnCl2·4H2O 2g/L，CoSO4·7H2O 2.8g/L，CaCl2 1.1g/L，CuCl2·2H2O 0.2g/L，ZnSO4·7H2O0.3g/L)的15L发酵罐中，培养温度37℃，培养至葡萄糖消耗完毕后，向培养体系中以适当速率流加葡萄糖，使得发酵过程中发酵体系的葡萄糖含量低于1g/L。流加葡萄糖后的10小时，将培养温度降至30℃，并同时添加乳糖至终浓度5g/L进行诱导，诱导6小时后，分别添加3种前体物质谷氨酸、半胱氨酸以及甘氨酸至终浓度60mM，继续培养2小时，结束培养。经液相色谱法检测，发酵液中谷胱甘肽含量达到5.57g/L。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，步骤为：将基因工程大肠杆菌接种至种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养；加入乳糖进行诱导，诱导后继续培养；加入用于合成谷胱甘肽的前体物质继续培养，得到谷胱甘肽。
2.根据权利要求1所述的利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述基因工程大肠杆菌包含双功能谷胱甘肽合成酶基因，且所述双功能谷胱甘肽合成酶基因能够在所述基因工程大肠杆菌胞内表达。
3.根据权利要求2所述的利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述双功能谷胱甘肽合成酶基因来自于丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的gshAB基因，所述基因工程大肠杆菌源自于大肠杆菌(Escherichia coli)BL21。
4.根据权利要求3所述的利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述gshAB基因的序列为NCBI中GeneID为66381177所示的核酸序列。
5.根据权利要求2所述的利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，使用PCR方法扩增丁酸梭菌基因组中的gshAB基因，连接至载体pET-28a的Nco I和EcoRI位点之间，得到重组质粒pET-28a-gshAB。
6.根据权利要求5所述的利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌。
7.根据权利要求5所述的利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，使用热激转化的方式将重组质粒转化至大肠杆菌。
8.根据权利要求1所述的利用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，诱导剂乳糖加入的终浓度为1～5g/L；诱导培养的温度为25～35℃。
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| Title |
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| 张松;王德正;李娓;李志敏;叶勤;: "重组大肠杆菌表达双功能谷胱甘肽合成酶的发酵工艺研究", 化学与生物工程, no. 08, 25 August 2013 (2013-08-25), pages 43 - 46 * |
| 赵翔;孙超;汤利文;向洁;赵士敏;许岗;: "新型谷胱甘肽合成酶重组菌的发酵工艺优化", 中国新技术新产品, no. 08, 25 April 2020 (2020-04-25), pages 1 - 3 * |
| 陈永露;吴绵斌;林建平;杨立荣;岑沛霖;: "GshF在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究", 中国生物工程杂志, no. 12, 15 December 2013 (2013-12-15), pages 21 - 28 * |
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