CN109112175A - 一种构建微生物共培养体系高产虎奶菇胞外多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种构建微生物共培养体系高产虎奶菇胞外多糖的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过采用虎奶菇菌丝体与乳酸菌共培养，并优化了共培养时乳酸菌的接种量及共培养时间，提高了多糖产量，并改进其溶解性。本发明所用菌种均是食用菌株，安全可靠，所用培养基原料廉价易得，无污染，易于实现。本发明方法工序简便、操作性强，可实现规模化、工业化生产。

Description

一种构建微生物共培养体系高产虎奶菇胞外多糖的方法
技术领域
本发明涉及一种构建微生物共培养体系高产虎奶菇胞外多糖的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
虎奶菇(Pleurotus tuber-regium)，学名菌核侧耳，又名虎奶菌、核耳菇、茯苓侧耳、南洋茯苓等，属于担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属，是一类主要分布于热带及亚热带地区的珍稀食药用真菌。虎奶菇不仅具有极高的营养价值，还富含多种生物活性成分，多糖作为其中含量最高的成分，近年来备受关注。研究表明，虎奶菇多糖能显著提高机体免疫功能，在医学、保健品、食品、药物载体等领域有良好的应用前景。虎奶菇菌丝体经液态发酵会产生胞外多糖，该多糖虽基本结构与菌核及子实体多糖有差异，但均具有高度支化的形态，因此具有巨大的潜在研究和应用价值。目前生产虎奶菇菌丝体胞外多糖的方法大多是仅通过虎奶菇菌丝体液态发酵，但是得到的胞外多糖存在产率较低、溶解性较差等缺陷。这些问题严重限制了其进一步的基础及应用研究。
乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，广泛存在于人体的肠道中，其对人体肠道微生态的调节作用和人体健康的促进作用日益受到关注，也成为近年来的研究热点。不同的微生物之间具有复杂的相互作用，常被应用于食品及农业生产中，相应的共培养体系也常被构建以用于已知生物活性物质的增产或未知代谢产物的增加。但目前还未发现利用乳酸菌与大型真菌混合发酵提高多糖产量的应用实例。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种高产虎奶菇胞外多糖的方法，是利用乳酸菌和虎奶菇菌丝体两种微生物构建共培养体系。具体包括以下步骤：
(1)将虎奶菇菌丝体加入到种子培养液中预培养；将乳酸菌加入到液体培养基中进行预培养；
(2)将虎奶菇菌丝体预培养后得到的培养液接入到发酵培养基中液态发酵7d；
(3)在步骤(2)的发酵进行至第3-6d时，将乳酸菌预培养后得到的培养液接种到虎奶菇菌丝体发酵液中，进行共培养；
(4)发酵结束后离心、过滤，所得滤液即为发酵液，向发酵液中加入乙醇，搅拌，静置后收集沉淀，溶解沉淀，冷冻干燥，获得虎奶菇胞外多糖。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的虎奶菇菌丝体的预培养是将虎奶菇菌丝加入到种子培养液中，在160-200rpm，26-32℃条件下预培养2-4d。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的乳酸菌的预培养是将乳酸菌加入到MRS培养基中，在100-120rpm，30-40℃条件下预培养18-36h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的液态发酵是指虎奶菇菌丝体培养液的接种量为5-10％，接入发酵培养基，在150-200rpm，25-32℃下发酵7d。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中虎奶菇菌丝体的种子培养液和步骤(2)中发酵培养基配方为：葡萄糖20-40g/L，酵母浸粉3-5g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5-1.5g/L，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.4-1.0g/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述的共培养是指在发酵至第3-6d时，将乳酸菌接种到虎奶菇菌丝体发酵液中，接种量为2.5-10％，在150-200rpm，26-35℃条件下共培养1-4d。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中离心指的是3000-5000g离心5-10min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中所述的获得胞外多糖的方法为：向离心、过滤后的发酵滤液中加入发酵液3-5倍体积的95％乙醇，搅拌，静置5-8h，将沉淀物用水溶解后冷冻干燥。
本发明是针对现有的产虎奶菇胞外多糖的方法产量低、溶解性差等问题，采用虎奶菇菌丝体与乳酸菌共培养的方式提高多糖产量，并改进其溶解性。通过调整共培养时乳酸菌的接种量及共培养时间，所得虎奶菇胞外多糖的得率可以达到522.60mg/L，较之对照组1(仅使用虎奶菇菌丝体液态发酵)产量提高至3.7倍。两种微生物共培养能实现互利共生，所得胞外多糖产量显著提高。本发明所涉及的方法，工序简便、操作性强，可实现规模化、工业化生产。
具体实施方式
(一)测多糖含量的方法：
多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法。将5mg多糖样品分散于1mL浓度为12M的硫酸溶液中，于40℃水浴反应10min。然后加5mL去离子水，将稀释后样品溶液置于沸水浴中继续反应60min，反应结束后冷却至室温。取1mL反应液以浓度为2M的硫酸稀释10倍，再取1mL稀释液，加入1mL的5％苯酚溶液，震荡混匀，再加入5mL浓硫酸(18M)溶液，反应30min后，于490nm处测定吸光度值。标准曲线由葡萄糖配制，线性浓度分别为12.5μg/mL,25μg/mL,50μg/mLand 100μg/mL，以2M的硫酸溶液溶解，测定方法与样品一致。测定后，将样品的吸光度值代入标准品曲线中，得到多糖浓度，计算总糖含量。
(二)培养基
虎奶菇种子培养液和液体发酵培养基：葡萄糖20-40g/L，酵母浸粉3-5g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5-1.5g/L，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.4-1.0g/L。
MRS培养基：蛋白胨10.0g/mL；牛肉膏10.0g/mL；酵母膏5.0g/mL；柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0g/mL；葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g/mL；吐温80 1.0mL/L；乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g/mL；磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g/mL；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g/mL；硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g/mL；琼脂18.0g/mL；pH 6.2-6.6。
实施例1
将长满虎奶菇菌丝的PDA固体培养基切成1cm2小块后加入到灭菌后的种子培养液中，180rpm，30℃培养3d，接入灭菌后的液态发酵培养基进行液态发酵，接种量为5.0％，180rpm，温度30℃，发酵时间为7天。其中种子液装液量为100mL/250mL三角瓶，发酵液装液量为190mL/500mL。
乳酸菌种子液于MRS培养基中100rpm，37℃，预培养18h。取虎奶菇发酵液总体积5.0％的乳酸菌种子液接种于虎奶菇发酵液，接种时间为虎奶菇液态发酵的第6d，共培养温度为30℃，共培养转速为180rpm。在虎奶菇总发酵时间7d时结束发酵，即共培养时间为1d。
发酵结束后，采用3000g转速离心15min，并采用定量滤纸过滤以除去悬浮物，获得的滤液即为虎奶菇-乳酸菌共培养发酵液。
所得的发酵液中加入4倍体积的95％乙醇，搅拌，静置8h，将沉淀物以2倍体积的水溶解后冷冻干燥，即得胞外多糖。
实施例2
将长满虎奶菇菌丝的PDA固体培养基切成1cm2小块后加入到灭菌后的种子培养液中，180rpm，30℃培养3d，接入灭菌后的液态发酵培养基进行液态发酵，接种量为10％，160rpm，温度30℃，发酵时间为7天。其中种子液装液量为90mL/250mL三角瓶，发酵液装液量为180mL/500mL。
乳酸菌种子液于MRS培养基中预培养24h，培养温度为37℃，摇床转速为100rpm。取虎奶菇发酵液总体积2.5％的乳酸菌种子液接种于虎奶菇发酵液，接种时间为虎奶菇发酵时间的第5d，共培养温度为30℃，共培养转速为180rpm。在虎奶菇总发酵时间7d时结束发酵，即共培养时间为2天。
发酵结束后，采用4000g转速离心10min，并采用定量滤纸过滤以除去悬浮物，获得的滤液即为虎奶菇-乳酸菌共培养发酵液。
所得的发酵液中加入4倍体积的95％乙醇，搅拌，静置5h，将沉淀物以2倍体积的水溶解后冷冻干燥，即得胞外多糖。
实施例3
将长满虎奶菇菌丝的PDA固体培养基切成1cm2小块后加入到灭菌后的种子培养液中，180rpm，30℃培养3d，接入灭菌后的液态发酵培养基进行液态发酵，接种量为5.0％，180rpm，温度30℃，发酵时间为7天。其中种子液装液量为100mL/250mL三角瓶，发酵液装液量为190mL/500mL。
乳酸菌种子液于MRS培养基中100rpm，37℃，预培养18h。取虎奶菇发酵液总体积5.0％的乳酸菌种子液接种于虎奶菇发酵液，接种时间为虎奶菇液态发酵的第5d，共培养温度为30℃，共培养转速为180rpm。在虎奶菇总发酵时间7d时结束发酵，即共培养时间为2d。
发酵结束后，采用3000g转速离心15min，并采用定量滤纸过滤以除去悬浮物，获得的滤液即为虎奶菇-乳酸菌共培养发酵液。
所得的发酵液中加入4倍体积的95％乙醇，搅拌，搅拌，静置8h，将沉淀物以2倍体积的水溶解后冷冻干燥，即得胞外多糖。
实施例4
将长满虎奶菇菌丝的PDA固体培养基切成1cm2小块后加入到灭菌后的种子培养液中，180rpm，30℃培养3d，接入灭菌后的液态发酵培养基进行液态发酵，接种量为10％，160rpm，温度30℃，发酵时间为7天。其中种子液装液量为90mL/250mL三角瓶，发酵液装液量为180mL/500mL。
乳酸菌种子液于MRS培养基中预培养24h，培养温度为37℃，摇床转速为100rpm。取虎奶菇发酵液总体积7.5％的乳酸菌种子液接种于虎奶菇发酵液，接种时间为虎奶菇发酵时间的第5d，共培养温度为30℃，共培养转速为180rpm。在虎奶菇总发酵时间7d时结束发酵，即共培养时间为2天。
发酵结束后，采用4000g转速离心10min，并采用定量滤纸过滤以除去悬浮物，获得的滤液即为虎奶菇-乳酸菌共培养发酵液。
所得的发酵液中加入4倍体积的95％乙醇，搅拌，静置5h，将沉淀物以2倍体积的水溶解后冷冻干燥，即得胞外多糖。
实施例5
将长满虎奶菇菌丝的PDA固体培养基切成1cm2小块后加入到灭菌后的种子培养液中，180rpm，30℃培养3d，接入灭菌后的液态发酵培养基进行液态发酵，接种量为10％，160rpm，温度30℃，发酵时间为7天。其中种子液装液量为90mL/250mL三角瓶，发酵液装液量为180mL/500mL。
乳酸菌种子液于MRS培养基中预培养24h，培养温度为37℃，摇床转速为100rpm。取虎奶菇发酵液总体积10％的乳酸菌种子液接种于虎奶菇发酵液，接种时间为虎奶菇发酵时间的第5d，共培养温度为30℃，共培养转速为180rpm。在虎奶菇总发酵时间7d时结束发酵，即共培养时间为2天。
发酵结束后，采用4000g转速离心10min，并采用定量滤纸过滤以除去悬浮物，获得的滤液即为虎奶菇-乳酸菌共培养发酵液。
所得的发酵液中加入4倍体积的95％乙醇，搅拌，静置5h，将沉淀物以2倍体积的水溶解后冷冻干燥，即得胞外多糖。
对比例
为更好验证本发明中所采用的共培养体系对胞外多糖产量的影响，我们进行了如下的对比试验。
对比例1：乳酸菌接种时间为虎奶菇发酵液接种的当天，即共培养时间为7d，其余条件均同本发明实施例1；
对比例2：乳酸菌接种时间为虎奶菇发酵的第1d，即共培养时间为6d，其余条件均同本发明实施例1；
对比例3：乳酸菌接种时间为虎奶菇发酵的第2d，即共培养时间为5d，其余条件均同本发明实施例1。
对比例4：乳酸菌接种量为12％，其余条件均同本发明实施例2；
对比例5：乳酸菌接种量为15％，其余条件均同本发明实施例2；
对比例6：乳酸菌接种量为20％，其余条件均同本发明实施例2。
表1
注：对照组1为仅使用虎奶菇菌丝体液态发酵，不添加乳酸菌共培养；对照组2为仅使用乳酸菌单菌发酵。多糖得率为对乙醇沉淀物采用苯酚-硫酸法法测定其中的多糖含量后，由该多糖含量与发酵液总体积的比值。
应用对比例的方法所得到的胞外多糖产率低。由表1可知，在虎奶菇菌丝体与乳酸菌共培养天数大于4d时，所得胞外多糖得率较对照组1偏低；在乳酸菌接入虎奶菇发酵液的接种量(体积比)超过10％时，胞外多糖得率和菌体量均严重下降。
另外，在28℃下我们测定了共培养所得胞外多糖在100g水中达到饱和状态时所溶解的多糖的质量，即溶解度。与虎奶菇菌丝体单纯发酵(对照组)所得胞外多糖相比，本发明所得胞外多糖溶解度从0.52g/L提高到10.33g/L，初步分析可能与其中甘露糖含量降低有关。
本发明所得虎奶菇胞外多糖的单糖组成，见表2。
表2
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种高产虎奶菇胞外多糖的方法，其特征在于，利用乳酸菌和虎奶菇菌丝体两种微生物构建共培养体系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将虎奶菇菌丝体加入到种子培养液中预培养；将乳酸菌加入到液体培养基中进行预培养；
(2)将虎奶菇菌丝体预培养后得到的培养液接入到发酵培养基中液态发酵7d；
(3)在步骤(2)的发酵进行至第3-6d时，将乳酸菌预培养后得到的培养液接种到虎奶菇菌丝体发酵液中，进行共培养；
(4)发酵结束后离心、过滤，所得滤液即为发酵液，向发酵液中加入乙醇，搅拌，静置后收集沉淀，溶解沉淀，冷冻干燥，获得虎奶菇胞外多糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的虎奶菇菌丝体的预培养是将虎奶菇菌丝加入到种子培养液中，在160-200rpm，26-32℃条件下预培养2-4d。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的乳酸菌的预培养是将乳酸菌加入到MRS培养基中，在100-120rpm，30-40℃条件下预培养18-36h。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的液态发酵是指虎奶菇菌丝体培养液的接种量为5-10％，接入发酵培养基，在150-200rpm，25-32℃下发酵7d。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中虎奶菇菌丝体的种子培养液和步骤(2)中发酵培养基配方为：葡萄糖20-40g/L，酵母浸粉3-5g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5-1.5g/L，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.4-1.0g/L。
7.根据权利要求2或6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的共培养是指在发酵至第3-6d时，将乳酸菌接种到虎奶菇菌丝体发酵液中，接种量为2.5-10％，在150-200rpm，26-35℃条件下共培养1-4d。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中离心指的是3000-5000g离心5-10min。
9.根据权利要求2或8所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的获得胞外多糖的方法为：向离心、过滤后的发酵滤液中加入发酵液3-5倍体积的95％乙醇，搅拌，静置5-8h，将沉淀物用水溶解后冷冻干燥。
10.权利要求1-9所述的方法在生物工程、食品、医药或保健品领域的应用。
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孟凡杰: "虎奶菇菌丝体胞外多糖深层发酵培养基的优化", 《浙江化工》 *

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