TWI385248B - 一種蟲草屬培養基之配方 - Google Patents

Description

一種蟲草屬培養基之配方

本發明係關於一種蟲草屬真菌的培養基配方，特別是一種可以促進蟲草屬真菌生長及代謝物生成的培養基配方。

蟲草屬真菌(Cordyceps spp .)屬於寄生真菌，所寄生的宿主範圍相當廣泛，包含昆蟲、植物、真菌及一些蛛型綱的動物；根據文獻記載，蟲草屬真菌的種類大約有四百多種，少數蟲草屬真菌係作為中藥材使用，盛行於亞洲國家(如中國、韓國及日本等)，其中，冬蟲夏草是公認最具有療效的蟲草屬真菌；廣義的冬蟲夏草係指由一冬蟲夏草菌(蟲草屬真菌)感染宿主昆蟲，利用該宿主昆蟲體內的養分所形成的子座與蟲體屍體之複合體，如蛹蟲草、蟬花及白殭菌等；而普羅大眾所認為的冬蟲夏草(Cordyceps snensis )則主要係由一中華蟲草菌(Cordyceps sinensis )寄生於一蝙蝠科昆蟲(Hepialus armoricanus )之幼蟲的子座(特別是草蝙蝠(Oberthur)的幼體)，因其如冬則於土中似蟲生活，至夏則出土連身化為草，故稱冬蟲夏草。

冬蟲夏草的藥用價值已受到多方重視，主要對於循環系統、免疫活性、呼吸道、心血管及內分泌系統等功能具有提升的效果，並且經研究證實冬蟲夏草具有提升免疫力、抗癌細胞等多種生理意義，在西方國外也被視為一種治療用菇蕈類；冬蟲夏草於臨床上主要作用的機轉仍不明朗，但多數學者認為冬蟲夏草所含的多種成分如蟲草素(cordycepin)及腺苷(adenosine)等，係決定冬蟲夏草生理生化活性的指標性物質，而其醱酵培養液中所含的多醣體(polysaccharide)，則在免疫調節及抗腫瘤活性試驗有初步的結果。

然而，天然的冬蟲夏草對生長有嚴格的要求，需要特殊的地理環境及氣候，故產量有限，而近年來過度的採摘及環境的改變更導致野生冬蟲夏草的供不應求，因此，多採用人工培養技術，於無菌的環境下大量生產，習知人工培育冬蟲夏草的方法可分為活體內(in vivo )培養及活體外(in vitro )培養兩種方式；活體內培養係將冬蟲夏草菌以人工接種的方式直接培育於寄生昆蟲體內，然而，寄生昆蟲的大量培育與人工接種的技術目前仍有實行上的困難，往往無法成功培養；而活體外培養方式則係將冬蟲夏草菌接種至一培養基，以人工配方取代寄生昆蟲，提供冬蟲夏草菌於生長所需的養分進行培育，依照所培養冬蟲夏草菌的不同而選用不同配方的培養基如YM培養基、小麥抽出物培養基或馬鈴薯紅蘿蔔培養基；培養基配方的差異主要係由選用碳源或氮源的不同，常用的碳源有葡萄糖、麥芽糖、乳糖、糊精、單糖、雙糖及澱粉等，而氮源則可為酵母粉、黃豆粉、蛋白腖及麥麩等，另外，培養基配方中也可加入一些維生素(如維他命B1、B6)、無機物(如硫酸鈣)或有機鹽類(如磷酸鹽)以提供不同冬蟲夏草菌生長所需的養分；然而多數冬蟲夏草菌於配方培養基的生長效果不佳，故現今人工培養冬蟲夏草菌往往依照培養需求不同而分別選用以下三種培養形式：

A.液態培養形式：係以水為調配溶劑配製一冬蟲夏草之液態培養基配方，再接種一冬蟲夏草菌進行人工培養；利用液態培養形式所耗費之成本較低、醱酵產物較容易收集，並且可以於短時間內獲得大量菌絲體，該菌絲體經實驗證實與野生冬蟲夏草具有相近的藥理作用，因此，液態培養形式漸為多數人所採用，然而缺點在於生產規模較小，而且一些冬蟲夏草菌於液態培養基的生長狀態不佳，也會影響少數絲狀真菌的醱酵產率。

舉例而言，如中華民國公開第200412371號「用於冬蟲夏草菌菌絲體液態培養之方法及培養基」專利案，係揭示一種用於冬蟲夏草菌菌絲體之液態培養的培養基與方法，其中，該培養基係由一高分子醣類農產品的水解產物作為營養基質，培養冬蟲夏草菌之菌絲體；然而，該液態培養方法雖改用高分子醣類農產品作為培養基之碳源，但所培養冬蟲下草菌的醱酵產率卻仍未明顯提高，並且為使該高分子醣類農產品可以直接被所培養冬蟲夏草菌之菌絲體利用，須額外經由多步驟的水解處理將該高分子醣類農產品轉化為還原糖類，徒使培養過程更加複雜。

B.固態培養：係於一液態培養基配方中添加一膠材，使該培養基配方於常溫下係呈一固態膠狀之培養基材，同樣接種冬蟲夏草菌進行醱酵生產，常用的培養基材有麥芽洋菜基(MEA)，馬鈴薯葡萄糖基(PDA)或酵母洋菜基(YEA)等；一般而言，固態培養形式因其培養基材可提供冬蟲夏草菌於生長時之著附，較利於子實體的生長，然而固態培養的處理與操作流程較為繁複及費時，而且相關培養條件(如溫度、溼度及水份)較不易控制且培養基污染雜菌的機會較高，易造成培養生產上的困難。

舉例而言，如中華民國公告第I231825「一種繁殖真菌之固態醱酵培養方法」專利案，係揭示一種適用於培養冬蟲夏草、巴西洋菇及靈芝等真菌之固態醱酵培養方法，該固態醱酵培養方法係先將一真菌接種至一固態培養基材進行生長，再依序轉植至一液態培養基及一固態醱酵培養基材，以方便控制培養環境的溫度、水分、氣體供應及醱酵產物；然而，該固態培養形式之操作步驟太過繁複，培養週期較長且所培養真菌之代謝產物的產量未顯著提高，其醱酵產物的品質並未獲得改善。

C.半固態培養：係指一種含有固態營養基質的液態培養基配方，該固態培養基質多為米、麥等穀類，可作為培養菌體的養分來源，同時可供菌體攀附，使菌體維持於攀附生長的特性下進行液態醱酵培養，改善真菌的生產製程；如中華民國公告第I242044號「利用固態營養基質懸浮液培養絲狀真菌的方法」專利案，係揭示一種含有固態營養基質的醱酵培養液，將真菌接種至該醱酵培養液中進行生產，可以兼具有固態培養及液態醱酵的優點；然而，該半固態培養基仍然無法完全改善該固態培養及液態培養兩者之缺點，對於冬蟲夏草菌菌體的人工培養及其醱酵產物的生成仍然無法達成一最佳生產狀態。

由上所述，習知冬蟲夏草的人工活體外培養主要係將冬蟲夏草菌接種至配方培養基進行培養，雖然目前該配方培養基之應用已針對各種冬蟲夏草菌的生長差異開發多種配方成分(不同碳源、氮源)，卻普遍具有培養效果不佳影響菌體生長及醱酵產物等缺點，故需依照產業培養的目的採用不同的培養型式(液態、固態及半固態培養)，或是開發一些改良式的培養方法以提升冬蟲夏草菌的生長及醱酵，卻往往徒使操作過程繁雜而無法使效果顯著；因此，習知蟲草屬真菌的培養基配方有必要改進，以提升蟲草屬菌真人工培養產業之進步。

本發明主要係改良蟲草屬真菌習知人工培養技術的缺點，提供一種蟲草屬培養基之配方，其主要目的係促進蟲草屬真菌於人工培養環境之生長狀態

本發明之次一目的係提供一種蟲草屬培養基之配方，以提升蟲草屬真菌於人工培養環境之醱酵產物產量。

本發明之再一目的係提供一種蟲草屬培養基之配方，以提升蟲草屬真菌於人工培養環境之多醣體產量。

本發明之又一目的係提供一種蟲草屬培養基之配方，以提升蟲草屬真菌於人工培養環境之菌絲體產量。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段包含有：一種蟲草屬培養基之配方，係包含：一重量百分比濃度為1~6%之碳源；一0.85~1.5%之氮源；一2~12%之褐藻膠；及一86.2~96.2%之調配溶劑。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明一種蟲草屬培養基之配方，係將一褐藻膠加入一蟲草屬真菌的人工培養基，配製成一液態醱酵之蟲草屬培養基，可以有效提升該蟲草屬真菌的菌絲體生長、多醣體產量及醱酵產物產量。

本實施例係採用一蛹蟲草菌之菌株，接種至本發明之蟲草屬培養基，可以使該野生蛹蟲草菌絲體之生長狀態及醱酵狀態良好；該蟲草屬培養基係由一重量百分比濃度為1~6%之碳源；一0.85~1.5%之氮源；一2~12%之褐藻膠；及一86.2~96.2%之調配溶劑均勻混合後配製而成。

本發明蟲草屬培養基之碳源係包含一碳源(如葡萄糖、果糖、乳糖或麥芽糖等)，係選自一利用率高的糖類分子，係做為該蛹蟲草菌人工培養之主要營養受質，提供該蛹蟲草菌於生長時所需的主要養分；而該蟲草屬培養基所含之氮源係包含一固定氮源(如酵母菌萃取物或麥芽糖萃取物)及一改變氮源(如蛋白腖或玉米粉等)，同樣係提供該蛹蟲草菌生長所需之基本營養成分。

本發明之蟲草屬培養基係由水作為一調配溶劑，均勻混合及溶解該碳源、氮源及褐藻膠進行配製，其中，該褐藻膠可以由固體、液體或粉末等形式添加，褐藻膠的添加可使該蟲草屬培養基的質地較為黏稠卻仍保持液態，使所接種的蛹蟲草菌於生長時較具有著附力，而該蟲草屬培養基之液態培養醱酵形式則有利於該蛹蟲草菌之菌絲體生長，同時對該蛹蟲草菌養分的獲取及代謝反應皆具有促進的效果；另外，該蟲草屬培養基為維持所欲接種之蛹蟲草菌之良好生長，可另添加重量百分比例為0.05~0.1%之無機物質(如磷酸鉀鹽或硫酸鎂鹽等)，並且較佳係調整酸鹼值至pH 6；本發明蟲草屬培養基之詳細配方如下表所示：

為證實本發明之蟲草屬培養基可以有效促使蟲草屬真菌之菌絲體生長，依照上表配方配製本發明之蟲草屬培養基，以一接種環將該蛹蟲草菌之菌株接入本發明之蟲草屬培養基，係為試驗組(1)；另配製一普通培養基，係採用與本發明蟲草屬培養基相同成分及比例之碳源(葡萄糖)、氮源(麥芽糖萃取物、蛋白腖及酵母菌萃取物)，但不添加本發明之褐藻膠，以同樣方式接種該蛹蟲草之菌株，係為對照組(2)；將上述試驗組(1)及對照組(2)之蛹蟲草接種菌液置入一恆溫培養箱，於20~25℃的培養環境，150 rpm之攪拌轉速培養14~30天，於培養期間定時觀察並紀錄本發明之蟲草屬培養基及該普通培養基所培養蛹蟲草的生長狀 態，結果如第1圖所示。

如第1圖，其中，該試驗組(1)所培養之蛹蟲草，係於接種後第3天即可明顯觀察到正向生長狀態(+20%)，並且，該試驗組(1)之蛹蟲草於培養期間(30天內)皆維持於良好的生長狀態(>10%)；而該對照組(2)之蛹蟲草則係於接種後第6天出現負向的生長狀態，並且，隨著培養時間的增加其負向生長的情形則更明顯(第30天時)。由此結果顯示，本發明之蟲草屬培養基，因含有褐藻膠成分，可以促使蛹蟲草的生長，並且，相較於未添加褐藻膠之一般培養基，其生長之狀態係由負向而轉由正向生長，證實本發明之褐藻膠對於該蛹蟲草之人工培養具有明確而顯著的促進效果。

本實施例所採用之蛹蟲草，又稱北冬蟲夏草或蠶蛹蟲草，在藥理功能上具有鎮靜、平喘、抗心律失常及抗疲勞等功效，同時能增強免疫力；蛹蟲草因具有特別的化學組成，如甘露醇、腺苷、蟲草素及蟲草多醣體，故有醫療保健的效果，其中，該蟲草多醣體為主要的活性物質之一，具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、抗病毒、降血糖及降血脂等功能。目前人工栽培蛹蟲草雖已有相當程度的應用，但因生長困難，對於控制蛹蟲草菌絲體產量及有用代謝物質的生成，仍有技術層面的瓶頸；而本發明之蟲草屬培養基，除對該蛹蟲草的菌絲體生長有助益外，對於該蛹蟲草多醣體的產量及活性皆有較佳的效果，為證實本發明之蟲草屬培養基確實可以促進該蛹蟲草多醣體的產量及活性，再次操作上述蛹蟲草培養試驗，並且，於培養期間定期(每3天)取適量培養菌液，經一離心過濾方式去除雜質，再以酚硫酸法分析該培養菌液中多醣體的含量，比較該試驗組(1)及對照組(2)所培養之蛹蟲草產生多醣體的產量，其結果紀錄於第2圖。

如第2圖，其中，該試驗組(1)所培養之蛹蟲草，係於接種後即可於培養菌液中測到多醣體生成，並且，其產量高達0.45(克/單位體積公升)，而於培養過程中(0~6天)該試驗組(1)所產生多醣體的產量皆維持在0.4(克/單位體積公升)以上，同時所產生的多醣體具有良好的活性；而該對照組(2)所培養之蛹蟲草則係於接種後第3天由培養菌液中測到較高的多醣體產量，約有0.3(克/單位體積公升)，然該對照組(2)所培養之蛹蟲草所生成之多醣體含量仍明顯低於該試驗組(1)，同時活性也較低。由此結果顯示，本發明之蟲草屬培養基，因含有褐藻膠成分，可以促使蛹蟲草生成較多且活性較佳的多醣體，並且，相較於未添加褐藻膠之一般培養基，其多醣體的含量係明顯提升，證實本發明之褐藻膠對於人工培育之蛹蟲草具有促進其代謝產物生成的效果。

由上所述，本發明之蟲草屬培養基因含有褐藻膠成分，可以有效提升人工培養之蟲草屬真菌的菌絲體生成量、代謝物產量及代謝物之活性，對於該蟲草屬真菌的擴大培養及醱酵產物的應用皆有幫助；另外，藉由本發明之蟲草屬培養基可以獲得高產量及高活性的代謝產物，因此，可分離出純度較高的有效成分，對於蟲草屬真菌相關醫療產品的開發及該有效成分於抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等多方面的研究皆具有重要意義，有利於後續深入研究發展的進行。

本發明一種蟲草屬培養基之配方，係於一般培養基配方(含有一碳源、一固定氮源及一改變氮源等)中添加一褐藻膠成分，使該蟲草屬培養基之質地較黏稠，提供該蟲草屬真菌生長所需之著附，具有效促使蟲草屬真菌的生長之功效。

本發明一種蟲草屬培養基之配方，係於一般培養基配方(含有一碳源、一固定氮源及一改變氮源等)中添加一褐藻膠成分，維持一液態醱酵培養的狀態，可以提升該蟲草屬真菌之代謝產物的產量與活性，具有促進蟲草屬真菌人工培養技術之功效。

本發明一種蟲草屬培養基之配方，僅於一般培養基中添加一褐藻膠成分，即可達成有效控制蟲草屬真菌菌絲體產量及多醣體生成量等多項培養優勢，具有簡易操作且低成本之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

1‧‧‧試驗組

2‧‧‧對照組

第1圖：本發明蟲草屬培養基之生長狀態示意圖

第2圖：本發明蟲草屬培養基之代謝物產量示意圖

Claims (4)

1. 一種蟲草屬培養基之配方，係包含：重量百分比濃度為1~6%之葡萄糖；0.85~1.5%之氮源；2~12%之褐藻膠；及86.2~96.2%之調配溶劑。
2. 依申請專利範圍第1項所述一種蟲草屬培養基之配方，其中，該氮源係選自由一麥芽糖萃取物(Malt extract)、一酵母菌萃取物(Yeast extract)及一蛋白腖(Peptone)組成之群集。
3. 依申請專利範圍第1項所述一種蟲草屬培養基之配方，其中，該蟲草屬培養基之pH值為6。
4. 依申請專利範圍第1項所述一種蟲草屬培養基之配方，其中，該蟲草屬培養基之調配溶劑係為水。